Creación de Anastomosis de colon en ratones

Resumen

Fuga anastomótica o avería después de la cirugía es una causa importante de morbimortalidad postoperatoria. La cirugía para crear una anastomosis colónica es un método confiable y reproducible para el estudio de los mecanismos de cicatrización de las anastomosis.

Resumen

Anastomosis intestinales se realizan comúnmente en las operaciones electivas y emergentes. Aún así, si existen pérdidas anastomóticas son un muy temidas complicaciones de cirugías de colon y pueden ocurrir en hasta un 26% de las anastomosis quirúrgicas, con mortalidad que hasta un 39% para los pacientes con una pérdida de tal. Actualmente, existe una escasez de datos que detalla los mecanismos celulares de cicatrización anastomótica. Diseñar estrategias preventivas y tratamiento modalidades de fuga anastomótica se podría potenciada enormemente por una mejor comprensión de la cicatrización anastomótica apropiado.

Un modelo murino es ideal, ya que estudios anteriores han demostrado que la anastomosis murina es la más clínico similar al caso humano en comparación con otros modelos animales. Ofrecemos un modelo murino fácilmente reproducible de la anastomosis colónica en ratones que permitirá otra ilustración de la cicatrización anastomótica.

Introducción

Una complicación muy temida de anastomosis quirúrgica del intestino es anastomosis ruptura o fuga. Fuga anastomótica, que causa derramamiento del contenido intraluminal en la cavidad abdominal, es potencialmente mortal y puede rápidamente llevar a sepsis intraabdominal; tasas de descarga varían de 0.3% a 5.5% después de anastomosis del intestino y levantan a entre 0.5% y 26% para la anastomosis colónica^1,2. Las tasas de mortalidad después de fugas pueden ser tan altas como 39% debido a la rápida aparición de sepsis y progresión rápida a la muerte tras contaminación intraabdominal³. Estrategias preventivas y modalidades de tratamiento actualmente se basan en Fisiopatología que no se entiende completamente.

Actualmente, cicatrización anastomótica es a menudo comparado con la curación de herida cutánea más ampliamente estudiado, que está demostrando para ser un facsímil relativamente pobre. Se produce la consolidación de una serie de fases superpuestas, a partir de la fase de retraso inicial. Durante los días 0-4 después de la creación de la anastomosis intestinal, la fase lag se define por una respuesta inflamatoria aguda que borra la herida de restos celulares. A continuación, durante días 3-4, proliferación fibroblástica y la producción de colágeno tipifica la fase fibrophasia. Finalmente, después de 10 días, un período prolongado de colágeno que remodela se conoce como la fase de maduración. Es importante que tenga en cuenta que fuerza anastomótica es bastante baja y depende del apoyo extrínseco de quirúrgicamente colocados grapas o la sutura hasta el colágeno es depositado⁴. Entender el papel y el momento cada capa de la pared del intestino desempeña en la cicatrización anastomótica y la participación en tipos de la célula inflamatoria mediada por los macrófagos, así como marcadores sustitutos desdoblamiento para predecir fracaso anastomótico o éxito podría reducir la morbilidad, mortalidad y gastos sanitarios, siguiendo las indicaciones de las operaciones de colon⁵.

El modelo murino se ha demostrado en estudios previos para ser útil en mímica anastomosis humana⁶. Mientras que son populares, probadas y bien estudiado el modelo murino de anastomosis colónico, particularmente el método descrito por Komen et al. ⁷, estos modelos favorecen ileocecal o ascendente colocolonic técnicas anastomóticas⁸. Estudios previos de pacientes humanos han demostrado diferencias significativas en las tasas de fuga entre colocolonic, ileocecal y anastomosis colorrectales, resaltando la necesidad de más modelos experimentales en diferentes localizaciones anatómicas. Métodos adicionales, popularmente usados están dirigidos al desarrollo de un modelo que crea intencionalmente una fuga anastomótica en lugar de dilucidar los mecanismos celulares necesarios para la normal cicatrización anastomótica⁹. Modelos de ratón se han intentado en el pasado pero tienen las tasas de dehiscencia de la anastomosis o signos de fugas (es decir, formación de absceso) significativamente menor que los seres humanos y ratones^6,7. Además, las líneas experimentales más genéticamente modificadas están disponibles en ratones de ratas. Esto hace que el modelo de rata menos útiles para un modelo de anastomosis. Además, porcinos y caninos modelos han tenido investigación clínica menos que el modelo murino^6,7.

Proponemos un procedimiento seguro, técnicamente sencillo y rápidamente y fácilmente reproducible para la creación de anastomosis colónicas en un modelo murino que debe facilitar la mayor investigación en el mecanismo de herida anastomótica curación¹⁰ .

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Protocolo

El siguiente protocolo ha sido aprobado por la Universidad de Oklahoma Health Ciencias centro institucional cuidado de los animales y el Comité uso (IACUC) y cumple con todas las éticas con respecto al uso de animales de investigación. Además, todos los experimentos fueron realizados con arreglo a las normas institucionales, estatales y federales sobre las investigaciones experimentales en animales.

Nota: Para este protocolo, se utilizaron congenic hembras y machos criados en ratones de C57BL6/J en 12 a 72 semanas de edad. Todos los ratones utilizados para este procedimiento se mantuvieron en nuestras instalaciones sin barrera durante al menos una semana antes de la operación para adaptarse al bioma local. Animales se les permitió introducir en tiempo de operación y utilizamos la preparación intestinal mecánica oral ni lavado rectal antes del procedimiento.

1) creación de anastomosis

1. Autoclave de los instrumentos quirúrgicos, calentar la solución salina y limpiar todas las superficies operativas con etanol al 70%.
2. Para inducir la anestesia, colocar el ratón en una caja de inducción que está conectada con un vaporizador. Entrega 2-3% de isoflurano en 1-2 L/min hasta ratones son sedados.
3. Coloque el animal en un dispositivo de calentamiento, como una almohada, para prevenir la hipotermia.
4. Inyectar por vía subcutánea una dosis de tiempo de 0,1 mg/kg de buprenorfina (3 μg para un ratón de 30 g) para la analgesia postoperatoria y una vez que la dosis de 10 mg/kg de enrofloxacina para profilaxis antibiótica preoperatoria.
   Nota: Aunque pre- y postoperatorios de antibióticos no son necesarios para esta operación, las directrices y el animal cuidado y usan de Comité en nuestra institución recomendada su uso en nuestras instalaciones.
5. Coloque el cono de nariz anestésico alrededor de hocico del ratón. A lo largo de la operación, cuidadosamente el ritmo respiratorio del animal y ajustar la velocidad de flujo anestésico según sea necesario. Mantener una frecuencia respiratoria a 30-40 respiraciones por minuto.
6. Utilice una recortadora de pelo seguida por un agente depilatorio para eliminar el vello de la superficie de la piel entera del abdomen. Eliminar completamente el agente depilatorio con una gasa mojada con agua o el 70% de etanol. Seque bien el animal.
7. Antes de preparar el abdomen, cinta miembros del ratón a la almohada o la superficie operativa en el extremo de cada pata para evitar que el ratón se mueva durante la cirugía. Desinfecta el abdomen con clorhexidina. Incluyen toda la zona afeitada el pelo de los bordes de la zona depilada. Colocar un paño estéril sobre el ratón (figura 1A).
   1. Antes de cubrir, cortar una pequeña ventana ovoide o rectangular de la cortina para exponer el abdomen preparado.
      Nota: La ventana debe exponer el abdomen todo el ratón pero cubrir las extremidades, cola, cabeza y tórax. Cortar una ventana de 4 x 3 cm² para nuestras operaciones (figura 1B).
   2. Hacer una pequeña ranura a lo largo de la línea media del paño, desde el borde inferior hacia la ventana ovoide o rectangular, para permitir el acceso hasta el recto, durante el procedimiento (figura 1).
8. Hacer una incisión en la piel. Iniciar a lo largo de la línea media del abdomen inferior y haga una incisión en la piel con las tijeras verticalmente para el xifoides. Practique una incisión sólo la piel y evitar cortar la musculatura de la pared abdominal (figura 2A).
9. Tome la línea media de la pared abdominal con el fórceps y la elevación de los contenidos abdominales. Teniendo cuidado de no lesionar las estructuras intraabdominales, haga una incisión en la longitud de la fascia abdominal del midline vertical con unas tijeras afiladas. Ampliar la longitud de la incisión de la piel (figura 2B).
10. Cuando los intestinos son expuestos, ubicar el ciego y el intestino y gire las vísceras lado izquierdo medialmente para exponer el descendente y el colon sigmoide. Cubra la punta de prueba contundente con lubricante jelly y avanzar cuidadosamente la sonda en el recto para ayudar en la identificación del colon sigmoide en descendente (figura 3).
    Nota: A diferencia de los seres humanos, el ciego del ratón se encuentra generalmente en el cuadrante superior izquierdo del abdomen. Tenga cuidado de no para perforar la pared intestinal con la sonda en este paso. Si se perfora la pared del intestino, terminará el procedimiento y eutanasia el ratón.
    1. Evitar el aferramiento ciego con pinzas dentadas o afilados. En su lugar utilice pinzas atraumáticas, algodón aplicador con punta o manipulación suave dedo para girar las vísceras.
    2. Uso caliente solución salina estéril para que el intestino expuesto se mantiene húmedo durante todo el procedimiento.
    3. Los dos puntos serán el de la izquierda de línea media y al retroperitoneo a través del mesenterio. Después de la identificación, extraiga la sonda Roma parcialmente para facilitar colotomy.
11. Realizar colotomy transversal de los dos puntos sigmoideos.
    1. Suavemente Sujete los dos puntos sigmoideos superior a la entrada de la pelvis con pinzas atraumáticas (Figura 4A).
    2. Utilizando micro-unas tijeras afiladas, haga un corte a través de los dos puntos sigmoideos perpendicular a la dirección de los dos puntos y extendiendo a través de 80-90% de la anchura del colon. Esto ayudará a evitar la retracción de uno de los extremos de los dos puntos fuera del campo quirúrgico y facilitar la reparación (Figura 4B).
    3. Si se lesiona un vaso sanguíneo mesentérico durante el curso de la rotación visceral o colotomy, suavemente mantiene la presión hasta 2 minutos con una gasa o un aplicador con punta de algodón. Si el sangrado persiste después de este tiempo, colocar una figura de ocho sutura de monofilamento de 8-0 en el punto de sangrado.
       Nota: Si el intestino muestra signos de necrosis o lesión después de esto, terminar el procedimiento y eutanasia el ratón utilizando un método aprobado por el Comité institucional de uso animal.
12. Reparación de la colotomy sigmoidea.
    1. Usando un Portaagujas de Castroviejo, coloque 5-6 8-0 interrumpido simple no absorbible polipropileno puntos de sutura para reparar la colostomía. Colocar suturas de 1 mm una de otra con las mordeduras de 0,5 mm.
       1. Tenga cuidado para evitar rodar los bordes del intestino en la reparación por tomar un poco más serosa a mucosa con cada puntada. Dejar las colas de 5 mm de largo. Tenga cuidado de no accidentalmente captura del intestino circundante en la sutura (figura 4).
          Nota: Es útil empezar a suturar en la cerca de la frontera mesentérica de la colotomy, salvando la parte anti mesenteric más de colotomy para el final.
       2. Conforme avanza la reparación, la punta de prueba de disección punta Roma avance trans-anal para abarcar la reparación antes de coloca la sutura final. Esto ayudará a prevenir demasiado estrecha una reparación y disminuir las tasas de estenosis anastomótica.
13. Utilizando una jeringa de 10 mL llena con solución salina caliente, regar el abdomen varias veces. Si la superficie debajo del mouse se convierte en mojado, seco el ratón o mover el ratón sobre la superficie seca para evitar la hipotermia.
    1. Utilizar una gasa estéril sobre la incisión para absorber exceso riego.
    2. En la irrigación final, llenar el abdomen con solución salina estéril. Cuidadosamente avanzar un angiocatéter de 18 G lubricado en el recto e inflar con 0.5-1 cm³ de aire. Esto demostrará a cualquier fuga en la anastomosis que pueden repararse con sutura de polipropileno interrumpida otra uso de la sonda estéril para cubrir la anastomosis.
    3. Desinfla el colon con el angiocatéter antes del retiro.
14. Asegúrese de que no hay sangrado activo. Si hay, aplique suave presión directamente sobre el punto de sangrado para la sutura hemostática de lugar de 1-2 minutos como se describe anteriormente, si el sangrado persiste.
15. Volver suavemente las visceras medialized a su posición anatómica normal (figura 5A).
16. Cerrar la incisión abdominal (figura 5B).
    1. Usando el 4-0 suturas trenzadas absorbibles, coloque una sutura corriente a lo largo de la capa muscular de la pared abdominal en la parte superior de la incisión con salida y llegada en el aspecto inferior de la incisión. Instale un empate y cortar la sutura dejando colas de 5 mm.
       Nota: No incorporan accidentalmente el intestino en el cierre de la pared abdominal.
    2. Repita con sutura de monofilamento de 4-0 para cerrar la piel (figura 5).
17. Asegúrese de que el animal entero es cálido y seco, para prevenir la hipotermia postoperatoria.
18. Vigilar cuidadosamente el animal mientras se recupera de la anestesia. Administrar 0,1 mg/kg de buprenorfina cada 72 h para 2-3 días después del procedimiento para control del dolor.  Durante el período de recuperación, ratones deben ser cuidadosamente examinados diariamente para detectar signos de absceso o sepsis peritoneal.  Observación postoperatoria para el dolor y el malestar debe incluir: restricción de movimiento incluyendo inclinado tipo de postura, falta de comer o beber, aseo personal no adecuado, inflamación excesiva alrededor de herida, falta de cicatrización normal en el sitio de la incisión, o anidamiento no normal.  Cualquier animal demostrar cualquiera de estas conductas debe ser inmediatamente sacrificado por CO₂ asfixia durante un mínimo de 10 min seguido de toracotomía bilateral.
19. Mezclar 0.1 mg/mL de enrofloxacina con el agua potable del ratón durante 7 días después de la cirugía para prevenir la infección intraabdominal o sepsis debido a contaminación fecal asociada con la operación.

2) recolección de tejido anastomótico

1. Antes de suprimir el tejido anastomótico, eutanasia el ratón utilizando un método aprobado por el Comité institucional de uso animal.
   Nota: Basado en la política institucional, eutanasia a nuestros animales colocándolos en una cámara de dióxido de carbono con la infusión de gas dióxido de carbono 100% a 2 L/min durante 5 minutos antes de realizar toracotomía bilateral.
2. Esterilizar el abdomen con clorhexidina seguida de etanol al 70%.
3. Volver a incidir la incisión del midline original con unas tijeras afiladas. Empiezan en el polo inferior de la incisión anterior y extender este corte superior para el xifoides (figura 6A).
4. Con unas tijeras, corte en la capa muscular y después de entrar en el espacio peritoneal, ampliar el corte en la parte superior e inferior de la incisión. Tenga cuidado para evitar lesionar el intestino, al entrar en el abdomen o interrupción de la anastomosis, ya que puede haber de intestino adherido a la incisión o el sitio de la anastomosis.
5. Realizar cuidadosamente una rotación visceral medial izquierda exponer los dos puntos sigmoideos reparado (Figura 6B). Probablemente habrá adherencias a intestino del intestino alrededor de la reparación. Suavemente y sin rodeos diseccionar estas adherencias lejos del sitio de reparación. Tenga mucho cuidado de no interrumpir la anastomosis.
   1. Identificar el sitio de reparación por localizar las colas de la sutura de polipropileno utilizada para la reparación. Con unas tijeras y a partir de 1 cm proximal a la reparación, transecto transversalmente a través de los dos puntos descendentes. Repita este paso 1 cm distal al sitio de la anastomosis.
6. Quite el segmento sigmoidal agudamente disecando el colon del mesentery adjuntado a lo largo de la frontera posterior del colon con una tijera fina (figura 7).
7. Identificar la frontera mesentérica de la muestra de colon y ayudarse con unas tijeras finas cortar a lo largo de la longitud de la frontera mesentérica de manera longitudinal. Esto creará una sección cuadrada o rectangular de puntos de la muestra cilíndrica retirada anteriormente (figura 8).
8. Use un marcador para demarcar la frontera anti mesentérica del colon antes de retirar el segmento de colon. Después del retiro, haga un corte longitudinal a lo largo de la longitud del colon enfrente de la marca. Fijar, incrustar y cortar el tejido de muestra para la histología y el immunostaining.

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Resultados

A los 7 días después de la cirugía, la anastomosis debe curarse bien. La anastomosis puede ser cosechada en momentos antes y después de siete días para mejor ilustrar las etapas de la cicatrización anastomótica. En la figura 9, el análisis histológico muestra un fibroso (colágeno visualizado por tinción tricrómica) respuesta mediada por la alfa-actina de músculo liso positivos myofibroblasts. Sin embargo, hemos encontrado que los resultados de lo...

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Discusión

Hay varios pasos fundamentales para asegurar el éxito de y minimizar la morbilidad/mortalidad asociada a este procedimiento. En primer lugar, garantizar el manejo cuidadoso del tejido intestinal y tener cuidado para evitar lesiones de tracción al girar las vísceras para exponer los dos puntos. Tensión excesiva en el intestino o el mesenterio puede lesiones la necrosis intestinal del intestino o vasculatura y causa del sitio de la anastomosis. Además, afiladas pinzas o fórceps con dientes deben no utilizarse para ma...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57BL6/J mice	Jackson Labs	#00664
Fisherbrand Absorbent Underpads, 20" x 24"	Fisher Scientific	14-206-62
Polylined Sterile Field, 18" x 24"	Busse Hospital Disposables	696	Cut a rectangular hole
Isothesia isoflurane	Henry Schein	50033
Fisherbrand Sterile cotton gauze pad, 4" x 4"	Fisher Scientific	22-415-469
Puralube petrolatum ophthalmic ointment, 1/8 oz. tube	Dechra Veterinary Products	NDC 17033-211-38
Nair depilatory cream	Church & Dwight Co.	22339-05
Buprenex buprenorphine  0.3 mg/ml	Reckitt Benckiser Pharma Inc	NDC 12496-0757-5
1 cc insulin syringe, 27 G	Becton Dickinson	329412
Chloraprep Shampoo	Medline	APL82287
Webcol alcohol prep swabs	Covidien	6818
BioGel PI surgical gloves	Mölnlycke Health Care	ALA42675Z
Micro Forceps with teeth	Roboz	RS-5150
Fine scissors- sharp	Fine Science Tools	14060-09
Straight serrated forceps	Fine Science Tools	11050-10
Castro-Viejo needle driver	Fine Science Tools	12565-14
0.9% Sodium Chloride Irrigation	Baxter	BHL2F7121	Warm to 37 °C prior to use
10 ml syringe	Becton Dickinson	309604
4-0 Vicryl absorbable braided suture, 18", PS-2 needle	Henry Schein	6546037
Blue monofilament suture 24” BV-1 needle	Henry Schein	8305H	Usually comes double-armed. Cut the suture at the midway point to generate two usable sutures.
Cole-Parmer Microscissors, Standard Grade, Straight, 4".	Cole- Parmer	EW-10818-06
Medline Sterile lubricating jelly	Medline	MDS032273H