Creazione dell'anastomosi colica in topi

Riepilogo

Perdita anastomotic o ripartizione dopo la chirurgia è delle principali cause di mortalità e di morbosità postoperatoria. Il nostro studio per la creazione di un'anastomosi colica è un metodo affidabile e riproducibile per studiare i meccanismi di guarigione delle anastomosi.

Abstract

Anastomosi intestinale vengono comunemente eseguite in operazioni emergenti ed elettive. Anche così, perdite anastomotiche sono un altamente temute complicanze della chirurgia colica e possono accadere in fino a 26% delle anastomosi chirurgiche, con mortalità essendo fino al 39% per i pazienti con una perdita di tale. Attualmente, ci rimane una scarsità dei dati dettagliare i meccanismi cellulari di guarigione anastomotiche. Mettendo a punto strategie preventive e le modalità di trattamento per perdita anastomotic potrebbe essere notevolmente rafforzato da una migliore comprensione di guarigione anastomotic appropriato.

Un modello murino è ideale in quanto gli studi precedenti hanno dimostrato che l'anastomosi murino è il più clinicamente simile al caso umano rispetto ad altri modelli animali. Offriamo un modello murino facilmente riproducibile dell'anastomosi colica in topi che permetterà per ulteriore illustrazione di guarigione anastomotiche.

Introduzione

Una complicazione altamente temuta di anastomosi chirurgica dell'intestino è anastomotic guasto o perdita. Perdita anastomotic, che provoca la fuoriuscita del contenuto intraluminale nella cavità addominale, è pericolosa e può rapidamente portare a sepsi intra-addominale; prezzo shock varia dallo 0,3% al 5,5% seguendo le anastomosi dell'intestino tenue e salire a tra 0,5% e 26% per anastomosi colica^1,2. Tassi di mortalità dopo perdite possono essere alti come 39% a causa della rapida insorgenza di sepsi e progressione veloce a morte dopo contaminazione intra-addominale³. Strategie preventive e modalità di trattamento sono attualmente basate su patofisiologia che completamente non è capito.

Attualmente, guarigione anastomotic è spesso paragonata alla guarigione della ferita cutanea più ampiamente studiati, che sta dimostrando di essere un facsimile relativamente povero. La guarigione si verifica in una serie di fasi sovrapposte, a partire dalla fase iniziale del ritardo. Durante i giorni 0-4 dopo la creazione dell'anastomosi intestinale, la fase di ritardo è definita da una risposta infiammatoria acuta che cancella la ferita di detriti cellulari. Successivamente, nei giorni 3-4, produzione di collagene e proliferazione fibroblastica caratterizza la fase di fibrophasia. Infine, dopo 10 giorni, un periodo prolungato di rimodellamento del collagene è conosciuto come la fase di maturazione. È importante notare che forza anastomotic è piuttosto bassa e dipende dal sostegno estrinseco delle graffette chirurgicamente posizionati o suturare fino a quando il collagene è depositato⁴. Comprensione del ruolo e tempistica ogni strato della parete intestinale svolge nella cicatrizzazione anastomotica e il coinvolgimento in tipi di cellule infiammatorie-mediata come macrofagi, nonché illuminante markers surrogati per predire guasto anastomotic o successo potrebbe ridurre notevolmente la morbilità, la mortalità e la spesa sanitaria seguendo colon operazioni⁵.

Il modello murino è stato indicato negli studi precedenti l'utile in che imita l'anastomosi umano⁶. Mentre ci sono esempi popolari, provati e ben studiati il modello murino di anastomosi colica, particolarmente il metodo descritto da Komen et al. ⁷, questi modelli favoriscono ileocecale o ascendente colocolonic anastomotico tecniche⁸. Gli studi precedenti dei pazienti umani hanno dimostrato significative differenze nei tassi di perdita ileocecal, colocolonic e anastomosi colorettale, evidenziando la necessità di ulteriori modelli sperimentali a diverse posizioni anatomiche. Ulteriori metodi comunemente utilizzati sono finalizzati allo sviluppo di un modello che crea volutamente una perdita anastomotic anziché delucidare i meccanismi cellulari necessari per la normale cicatrizzazione anastomotica di⁹. Modelli del ratto sono state tentate in passato ma hanno tassi di deiscenza anastomotica e/o segni di perdita (cioè, la formazione di ascesso) significativamente più bassa di esseri umani e topi^6,7. Inoltre, sono disponibili in topi che i ratti più geneticamente linee sperimentali. Questo rende meno utile per un modello anastomotic modello del ratto. Inoltre, suini e canini modelli hanno avuto meno clinico indagine rispetto al modello murino^6,7.

Vi proponiamo una procedura sicura, tecnicamente semplice e rapidamente e facilmente riproducibile per la creazione di anastomosi coliche in un modello murino che dovrebbero facilitare l'indagine successiva nel meccanismo underreported della ferita anastomotic guarigione¹⁰ .

Protocollo

Il seguente protocollo è stato approvato dalla University of Oklahoma Health Sciences Center istituzionali cura degli animali e uso Committee (IACUC) ed è conforme a tutti gli orientamenti etici istituzionali per quanto riguarda l'uso di animali di ricerca. Inoltre, tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in conformità alle norme istituzionali, statali e federali per quanto riguarda la ricerca sperimentale su animali.

Nota: Per questo protocollo, abbiamo usato Congenici maschili e femminili in-allevato topi C57BL6/J 12 a 72 settimane di età. Tutti i topi usati per questa procedura sono stati tenuti presso la nostra struttura senza proprietà barriera per almeno una settimana prima dell'operazione di adattare per il bioma locale. Animali potevano alimentare fino al momento dell'operazione e abbiamo usato né preparazione intestinale meccanica orale né lo svuotamento rettale prima della procedura.

1) creazione delle anastomosi

1. Autoclave gli strumenti chirurgici, riscaldare la soluzione di irrigazione con soluzione fisiologica e pulire accuratamente tutte le superfici operative con etanolo al 70%.
2. Per indurre l'anestesia, posizionare il mouse in una finestra di induzione che è collegata a un vaporizzatore. Fornire isoflurano 2-3% a 1-2 L/min fino a topi sono sedati.
3. Metti l'animale su un dispositivo per riscaldare, ad esempio un cuscinetto di riscaldamento, per prevenire l'ipotermia.
4. Iniettare per via sottocutanea una volta dose di 0,1 mg/kg buprenorfina (3 µ g per un mouse 30g) per analgesia postoperatoria e una volta la dose di 10 mg/kg di enrofloxacina per profilassi antibiotica preoperatoria.
   Nota: Anche se pre- e postoperatori gli antibiotici non sono necessari per questa operazione, le linee guida istituzionali e l'animale cura e utilizzare Comitato alla nostra istituzione consigliato loro uso presso la nostra struttura.
5. Inserire il cono di naso anestetico intorno muso del mouse. Nel corso dell'operazione, la frequenza respiratoria dell'animale di monitorare attentamente e regolare la portata di anestetico, se necessario. Mantenere un ritmo respiratorio a 30-40 respiri al minuto.
6. Utilizzare un tagliatore di capelli seguito da un agente depilatorio per rimuovere i peli dalla superficie tutta la pelle dell'addome. Rimuovere accuratamente l'agente depilatorio con una garza bagnata con acqua o 70% di etanolo. Asciugare accuratamente l'animale.
7. Prima di preparare l'addome, nastro membra del mouse per il rilievo di riscaldamento o superficie operativa all'estremità di ogni gamba per impedire che il mouse lo spostamento durante la chirurgia. Disinfettare l'addome con clorexidina. Includere l'intera area rasata come pure i capelli sui bordi della zona rasata. Posizionare un telino sterile sopra il mouse (Figura 1A).
   1. Prima di Festoni, tagliate il drappo per esporre l'addome preparata una piccola finestra ovale o rettangolare.
      Nota: La finestra deve esporre l'intero addome del mouse ma coprire gli arti, coda, testa e torace. Abbiamo tagliato una finestra di 4 x 3 cm² per le nostre operazioni (Figura 1B).
   2. Fare una piccola fessura lungo il midline del drappo, dal bordo inferiore verso la finestra ovale o rettangolare, per consentire l'accesso al retto durante la procedura (Figura 1).
8. Fare un'incisione della pelle. Avviare lungo la linea mediana dell'addome più basso e incise la pelle con le forbici in verticale per il xifoideo. Incidere solo la pelle ed evitare di tagliare la muscolatura della parete addominale (Figura 2A).
9. Afferrare la linea mediana della parete addominale con la pinzetta e sollevare allontanandolo il contenuto addominale. Facendo attenzione a non ferire strutture intra-addominale, incise verticalmente la lunghezza della fascia addominale del midline con forbici affilate. Estendere la lunghezza dell'incisione della pelle (Figura 2B).
10. Quando gli intestini sono esposti, individuare l'intestino cieco e il piccolo intestino e ruotare i visceri di sinistra-parteggiato medialmente per esporre il discendente e due punti sigmoidei. Rivestire la punta della sonda smussata con gelatina di lubrificazione e far avanzare con cautela la sonda nel retto per facilitare l'identificazione del colon discendente/sigmoideo (Figura 3).
    Nota: A differenza degli uomini, intestino cieco del mouse si trova generalmente nel quadrante superiore sinistro dell'addome. Fare attenzione a non per forare la parete delle viscere con la sonda in questo passaggio. Se la parete intestinale è perforato, terminare la procedura ed eutanasia il mouse.
    1. Evitare di afferrare l'intestino cieco con il forcipe dentato o tagliente. Invece utilizzare pinza atraumatica, cotone applicatore capovolto, o manipolazione delicata dito per ruotare i visceri.
    2. Uso riscaldato soluzione salina sterile per garantire che le viscere esposte sono tenuta umida durante tutta la procedura.
    3. Il colon sarà sulla sinistra della linea mediana e attaccato al retroperitoneum tramite mesentery. Dopo l'identificazione, ritirare la sonda smussata parzialmente per facilitare colotomy.
11. Eseguire colotomy trasversale dei due punti sigmoidei.
    1. Afferrare delicatamente il colon sigmoideo superiore all'ingresso pelvico con pinza atraumatica (Figura 4A).
    2. Utilizzando micro-forbici affilate, fare un taglio attraverso due punti sigmoidei perpendicolare alla direzione del colon e si estende su 80-90% la larghezza del colon. Questo aiuterà a prevenire ritrazione di un'estremità del colon fuori del campo chirurgico e facilitare la riparazione (Figura 4B).
    3. Se un vaso sanguigno mesenterico è ferito durante il corso della rotazione viscerale o colotomy, premere delicatamente la pressione fino a 2 min con un applicatore con punta di cotone o garza. Se il sanguinamento persiste dopo tale orario, posto una figura di otto sutura monofilamento 8-0 intorno al punto di spurgo.
       Nota: Se l'intestino Mostra segni di necrosi o lesioni dopo questo, chiudere la procedura ed eutanasia il mouse usando un metodo umanitario approvato dalla vostra commissione istituzionale uso animale.
12. Riparare il colotomy sigmoideo.
    1. Utilizza un driver di aghi Castroviejo, inserire 5-6 punti in polipropilene non assorbibili e semplice 8-0 interrotto per riparare la colostomia. Posizionare suture 1 mm l'una da altra con punture di 0,5 mm.
       1. Fare attenzione a evitare i bordi delle viscere di rotolamento in riparazione prendendo leggermente più sierosa che mucosa con ogni punto. Lasciare le code lunghe 5 mm. Fare attenzione a non accidentalmente cattura circostante delle viscere nella sutura (Figura 4).
          Nota: È utile iniziare a sutura presso il vicino confine mesenterico di colotomy, salvare la parte anti-mesenteric-la maggior parte di colotomy per ultimo.
       2. Col progredire della riparazione, sonda con punta blunt dissezione anticipo trans-anale per estendersi la riparazione prima si trovano i punti di sutura finale. Questo aiuterà a prevenire troppo stretto una riparazione e diminuire i tassi di critica anastomotic.
13. Usando una siringa da 10 mL riempita con soluzione salina riscaldata, irrigare l'addome più volte. Se la superficie sotto il mouse diventa bagnata, asciutto il mouse o spostare il mouse a una superficie asciutta per evitare l'ipotermia.
    1. Utilizzare una garza sterile posizionata sopra l'incisione per assorbire l'eccesso d'irrigazione.
    2. Presso l'irrigazione finale, riempire l'addome con soluzione fisiologica sterile. Attentamente avanzare un angiocatheter 18 G lubrificato nel retto e gonfiare con 0,5-1 cm³ di aria. Questo dimostrerà eventuali perdite nell'anastomosi che possono essere riparati con sutura in polipropilene interrotto un altro usando la sonda sterile per estendersi all'anastomosi.
    3. Sgonfiare il colon usando il angiocatheter prima della rimozione.
14. Assicurarsi che non ci sia nessun sanguinamento attivo. Se c'è, applicare una leggera pressione direttamente sul punto di spurgo per sutura emostatico in posto 1-2 minuti, come descritto sopra, se il sanguinamento continua.
15. Tornare delicatamente dei visceri alla relativa posizione anatomica normale (Figura 5A).
16. Chiudere l'incisione addominale (figura 5B).
    1. Utilizzando suture intrecciate 4-0, posizionare un suturare corrente lungo lo strato muscolare della parete addominale a partire dall'inizio dell'incisione e finitura a funzione inferiore dell'incisione. Installare una cravatta e tagliare la sutura lasciando code di 5 mm.
       Nota: Non incorporano accidentalmente intestino nella chiusura della parete addominale.
    2. Ripetere con sutura monofilamento 4-0 per chiudere la pelle (Figura 5).
17. Assicurarsi che l'animale intero è caldo e asciutto, per evitare l'ipotermia postoperatoria.
18. Monitorare con attenzione l'animale come si recupera dall'anestesia. Amministrare la buprenorfina 0,1 mg/kg ogni 72 ore per 2-3 giorni dopo la procedura per il controllo del dolore.  Durante il periodo di recupero, topi dovrebbero essere esaminati con attenzione ogni giorno per segni di ascesso o di sepsi peritoneale.  Osservazione post-operatoria per dolore e afflizione dovrebbe includere: restrizione di movimento tra cui incurvando tipo di postura, mancanza di mangiare o bere, governare non adeguato, eccessiva infiammazione intorno ferita, mancanza di guarigione normale presso il sito di incisione, o nidificazione non normale.  Qualsiasi animale che dimostrano uno qualsiasi di questi comportamenti dovrebbe essere euthanized immediatamente da CO₂ asfissia per un minimo di 10 min seguita da toracotomia bilaterale.
19. Mescolare 0,1 mg/mL di enrofloxacina con acqua potabile del mouse per 7 giorni dopo la chirurgia per impedire infezione intra-addominale o sepsis dovuto contaminazione fecale associata all'operazione.

2) raccolta tessuto Anastomotic

1. Poco prima di asportare tessuto anastomotic, eutanasia il mouse usando un metodo umanitario approvato dal Comitato istituzionale uso animale.
   Nota: Basata sulla politica istituzionale, abbiamo eutanasia nostri animali mettendoli in una camera di anidride carbonica con infusione di gas del biossido di carbonio 100% a 2 L/min per 5 min prima di eseguire la toracotomia bilaterale.
2. Sterilizzare l'addome con clorexidina seguita da etanolo al 70%.
3. Re-incise l'originale incisione del midline con forbici affilate. Avviare presso il polo inferiore dell'incisione precedente ed estendere questo taglio superiormente al xifoideo (Figura 6A).
4. Utilizzando le forbici, tagliare nello strato muscolare e dopo aver inserito lo spazio peritoneale, estendere il taglio alla parte superiore e inferiore dell'incisione. Fare attenzione a non ferire l'intestino quando si entra l'addome o perturbare l'anastomosi, come possono esserci delle viscere aderito all'incisione o sito anastomotico.
5. Attentamente e compiono una rotazione viscerale mediale sinistra esponendo due punti sigmoidei riparato (Figura 6B). Ci sarà probabilmente le adesioni intestinali di viscere che circonda la riparazione. Delicatamente e senza mezzi termini sezionare queste adesioni lontano dal sito di riparazione. Fare attenzione a non disturbare l'anastomosi.
   1. Identificare il sito di riparazione individuando le code della sutura in polipropilene utilizzata per la riparazione. Utilizzando le forbici e a partire da 1 cm prossimali alla riparazione, transetto trasversalmente attraverso il colon discendente. Ripetere questo passaggio 1 cm distalmente al sito dell'anastomosi.
6. Rimuovere il segmento sigmoidale dissecando acutamente il colon dal mesentery allegato lungo il bordo posteriore del colon con forbice (Figura 7).
7. Identificare il confine mesenterico dell'esemplare del colon e forbice per tagliare lungo la lunghezza del bordo mesenterico in modo longitudinale. Questo creerà una sezione quadrata o rettangolare del colon dal provino cilindrico rimosso in precedenza (Figura 8).
8. Utilizzare un pennarello per demarcare il confine anti-mesenterico dei due punti prima della rimozione del segmento del colon. Dopo la rimozione, fare un taglio longitudinale lungo la lunghezza del colon di fronte la marcatura. Difficoltà, incorporare e tagliare il tessuto campione come necessario per istologia e/o immunostaining.

Risultati

A 7 giorni dopo la chirurgia, l'anastomosi deve essere ben guarito. L'anastomosi può essere raccolto a intervalli di tempo prima e dopo sette giorni per meglio illustrare le fasi di guarigione anastomotiche. Nella Figura 9, l'analisi istologica mostra un fibrotico (collagene visualizzato tramite la colorazione tricromica) risposta mediata dai miofibroblasti positivi di alfa-actina del muscolo liscio. Tuttavia, abbiamo trovato che i risultati dalle analisi is...

Discussione

Ci sono diversi passaggi chiave per garantire il successo di e ridurre al minimo la morbilità/mortalità connessa con questa procedura. In primo luogo, garantire la gestione attenta del tessuto intestinale e fare attenzione a evitare lesioni di trazione durante la rotazione i visceri per esporre i due punti. Indebita tensione dell'intestino o mesentere possibile ferita la necrosi intestinale intestinale o il sistema vascolare e causa lontano dal sito dell'anastomosi. Inoltre, pinze taglienti o forcipe con denti non deve...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57BL6/J mice	Jackson Labs	#00664
Fisherbrand Absorbent Underpads, 20" x 24"	Fisher Scientific	14-206-62
Polylined Sterile Field, 18" x 24"	Busse Hospital Disposables	696	Cut a rectangular hole
Isothesia isoflurane	Henry Schein	50033
Fisherbrand Sterile cotton gauze pad, 4" x 4"	Fisher Scientific	22-415-469
Puralube petrolatum ophthalmic ointment, 1/8 oz. tube	Dechra Veterinary Products	NDC 17033-211-38
Nair depilatory cream	Church & Dwight Co.	22339-05
Buprenex buprenorphine  0.3 mg/ml	Reckitt Benckiser Pharma Inc	NDC 12496-0757-5
1 cc insulin syringe, 27 G	Becton Dickinson	329412
Chloraprep Shampoo	Medline	APL82287
Webcol alcohol prep swabs	Covidien	6818
BioGel PI surgical gloves	Mölnlycke Health Care	ALA42675Z
Micro Forceps with teeth	Roboz	RS-5150
Fine scissors- sharp	Fine Science Tools	14060-09
Straight serrated forceps	Fine Science Tools	11050-10
Castro-Viejo needle driver	Fine Science Tools	12565-14
0.9% Sodium Chloride Irrigation	Baxter	BHL2F7121	Warm to 37 °C prior to use
10 ml syringe	Becton Dickinson	309604
4-0 Vicryl absorbable braided suture, 18", PS-2 needle	Henry Schein	6546037
Blue monofilament suture 24” BV-1 needle	Henry Schein	8305H	Usually comes double-armed. Cut the suture at the midway point to generate two usable sutures.
Cole-Parmer Microscissors, Standard Grade, Straight, 4".	Cole- Parmer	EW-10818-06
Medline Sterile lubricating jelly	Medline	MDS032273H