JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

نقدم هنا، بروتوكولا لتولد السرطان استنساخ الخلية التي تحتوي على علامة تسلسل MS2 في سوبتيلوميري واحد. ويمكن هذا النهج، الاعتماد على نظام MS2-التجارة والنقل، والتصور النصوص الذاتية من تيلوميريك التي تحتوي على تكرار "الحمض النووي الريبي" (TERRA) أعرب من telomere واحدة في الخلايا الحية.

Abstract

التيلومير يتم نسخها، مما أدى إلى تيلوميريك المحتوية على تكرار الكشف فضله منذ فترة طويلة (TERRA)، التي اقترحت أن تلعب أدواراً هامة في علم الأحياء telomere، بما في ذلك تشكيل هيتيروتشروماتين والتوازن طول telomere. وأظهرت النتائج الأخيرة أن جزيئات تيرا تتفاعل أيضا مع المناطق الكروموسومات الداخلية لتنظيم التعبير الجيني في الخلايا الجذعية الجنينية (ES) الماوس. وتمشيا مع هذه الأدلة، أظهرت الأسفار الجيش الملكي النيبالي في الموقع التحليلات التهجين (الحمض النووي الريبي-الأسماك) فقط مجموعة فرعية من تيرا ترجمة النصوص في نهايات الكروموسومات. سوف تساعد على فهم أفضل لديناميات الجزيئات تيرا تحديد وظيفتها والآليات من العمل. هنا، نحن تصف طريقة للتسمية، وتصور telomere واحد تيرا المحاضر في الخلايا السرطانية باستخدام نظام MS2-التجارة والنقل. لتحقيق هذا الهدف، نقدم بروتوكولا لإنشاء استنساخ مستقرة، باستخدام خط خلية سرطان المعدة البشرية AGS، تحتوي على تسلسلات MS2 المتكاملة في سوبتيلوميري واحد. يؤدي النسخ تيرا من telomere MS2 معلم في التعبير عن جزيئات تيرا MS2 المعلمة التي يتم تصور بالفحص المجهري خلية يعيش الأسفار عند التعبير المشارك بروتين ملزمة رنا MS2 تنصهر للتجارة والنقل (MS2-التجارة والنقل). هذا النهج يتيح للباحثين لدراسة ديناميات telomere واحد تيرا الجزيئات في الخلايا السرطانية، ويمكن تطبيقها على خطوط الخلايا الأخرى.

Introduction

تيرا الحمض النووي الريبي فضله طويلة يتم نسخها من منطقة سوبتيلوميريك في الكروموسومات والنسخ العائدات نحو نهايات الكروموسومات، تنتهي داخل المسالك تكرار تيلوميريك1،2. لهذا السبب، تتكون من تسلسل المستمدة من سوبتيلوميريك في نهايتها 5 ' تيرا النصوص وإنهاء مع تكرار تيلوميريك (أوواجج في الفقاريات)3. أهمية الأدوار قد اقترحت للأرض، بما في ذلك تشكيل heterochromatin التيلومير4،5، الحمض النووي النسخ المتماثل6، تشجيع جزئ مثلى بين كروموسوم ينتهي7،8 , 9تنظيم هيكل telomere10و telomere طول التوازن2،11،،من1213. وعلاوة على ذلك، محاضر تيرا التفاعل مع العديد من المواقع اكستراتيلوميريك لتنظيم التعبير الجيني على نطاق واسع في الماوس الخلايا الجذعية الجنينية (ES)14. تمشيا مع هذه الأدلة، الأسفار الجيش الملكي النيبالي في الموقع التهجين وأظهرت تحاليل الحمض النووي الريبي (الأسماك) أن فقط مجموعة فرعية نصوص تيرا المعربة في التيلومير1،2،15. وباﻹضافة إلى ذلك، أبلغ تيرا على شكل مجاميع النووية إضفاء الطابع المحلي على الكروموسومات X و Y في الماوس الخلايا2،16. تشير هذه النتائج إلى أن النصوص تيرا الخضوع للديناميات المعقدة داخل النواة. فهم ديناميات الجزيئات تيرا سيساعد على تحديد مهمتها والآليات من العمل.

وقد استخدمت نظام MS2-التجارة والنقل على نطاق واسع لتصور جزيئات الحمض النووي الريبي في الخلايا الحية من مختلف الكائنات17،18. وقد استخدمت هذا النظام سابقا الوسم ووضع تصور لجزيئات تيرا telomere واحد في12، S. cerevisiae19. باستخدام هذا النظام، فقد ظهر مؤخرا أن الخميرة تيرا النصوص المعربة داخل السيتوبلازم خلال مرحلة التحول دياوكسيك بوست، مما يوحي بأن الأرض قد تمارس مهام اكسترانوكلير20. أننا استخدمت مؤخرا نظام MS2-التجارة والنقل لدراسة النصوص تيرا telomere واحد في خلايا السرطان21. لتحقيق هذا الهدف، ونحن استخدمت أداة التحرير الجينوم كريسبر/Cas9 لدمج تسلسلات MS2 في telomere واحد (telomere 15q، يشار إليها فيما بعد Tel15q) والحصول على استنساخ معربا عن معلم MS2 تيرا Tel15q الذاتية (استنساخ تيرا-MS2). التعبير المشارك بروتين ملزمة رنا MS2 تنصهر فيها التجارة والنقل (MS2-التجارة والنقل) التي تعترف ويربط التصور تمكن تسلسل الحمض النووي الريبي MS2 telomere واحد تيرا النصوص في المعيشة الخلايا21. وغرض البروتوكول هو موضح هنا أن يصف بالتفصيل الخطوات اللازمة لتوليد الحيوانات المستنسخة تيرا-MS2.

لتوليد الحيوانات المستنسخة تيرا-MS2، تم دمج كاسيت MS2 داخل منطقة سوبتيلوميريك telomere 15q، المصب تيرا مروج المنطقة والنسخ الموقع ابدأ. كاسيت MS2 يحتوي على مورثة مقاومة النيوميسين محاط بمواقع لوكس-p، وإدماجه في سوبتيلوميري 15q تتم باستخدام نظام Cas9 كريسبر/22. بعد أن يتم تحديد تعداء MS2 استنساخ الكاسيت، واحد ويتم التحقق من التكامل سوبتيلوميريك للكاسيت ببكر، لطخة الحمض النووي تتابعها والجنوب. استنساخ إيجابية مصابون إتش معربا عن لجنة المساواة العرقية بغية إزالة علامة الاختيار في الكاسيت، تاركاً فقط MS2 متواليات وموقع واحد لوكس-ف في سوبتيلوميري 15q. يمكن التحقق منه التعبير عن النصوص تيرا MS2 معلم من Tel15q ب RT-قبكر. وأخيراً، يتم التعبير عن البروتين الانصهار MS2-التجارة والنقل في استنساخ تيرا-MS2 عبر عدوى الفيروسات الرجعية من أجل تصور النصوص تيرا MS2 بالفحص المجهري الأسفار. يمكن اكتشاف النصوص تيرا سهولة بالجيش الملكي النيبالي-الأسماك وخلية يعيش التصوير باستخدام تيلوميريك الخاصة بتكرار يسبر1،2،،من1523. هذه النهج معلومات هامة عن التعريب من مجموع السكان من جزيئات تيرا في قرار وحيد الخلية. الجيل من الحيوانات المستنسخة التي تحتوي على تسلسلات MS2 في سوبتيلوميري واحد سوف تمكن الباحثين من دراسة ديناميات telomere واحد تيرا المحاضر في الخلايا الحية، التي تساعد في تعريف الدالة وآليات عمل تيرا.

Protocol

1. التحديد من الحيوانات المستنسخة مقاومة النيوميسين

  1. تنمو خلايا AGS في المتوسط F-12_K في لحم الخنزير (كين) تستكمل مع 10% الجنيني البقري المصل (FBS)، 2 مم L-الجلوتامين والبنسلين (0.5 وحدة لكل مل متوسطة) ستربتوميسين (0.2 ميكروغرام كل مل متوسطة) في 37 درجة مئوية و 5% CO2. ترانسفيكت الخلايا في التقاء 50-60 في المائة مع سجرنا/Cas9 التعبير عن المتجهات وكاسيت MS2 في 01:10 نسبة المولى21.
    ملاحظة: في تجربة موازية، التحقق من كفاءة تعداء ترانسفيكتينج ناقل التعبير عن التجارة والنقل (أي، Cas9-بروتينات فلورية خضراء متجه). على الأقل ينبغي أن تتحقق الكفاءة تعداء 60-70%.
  2. في اليوم التالي، استبدال وسيلة تثقيف المتوسطة التي تحتوي على النيوميسين 0.7 ميكروغرام/مل تركيز النهائي (المتوسطة الانتقائي).
    ملاحظة: تقسيم الخلايا وبذر منهم في المتوسط انتقائية اليوم بعد تعداء سوف تسرع في عملية الاختيار. كافة الخلايا غير ترانسفيكتيد سوف يموت فورا. إذا كان يتم إجراء تعداء في 6 لوحات جيدا، في هذه الحالة كل بئر في 60% التقاء سيتضمن حوالي 0.7 × 106 خلايا، اليوم التالي يمكن تقسيم الخلايا من بئر واحدة إلى 10 سم صحن تحتوي على متوسط انتقائية.
  3. إبقاء الخلايا في المتوسط الانتقائي لمدة 7-10 أيام، تغيير المتوسطة كل واحد أو يومين، حتى استنساخ واحدة مرئية.
  4. الانتقاء لاستنساخ الخلايا
    1. إعداد لوحة جيدا 96 التي تحتوي على 10 ميليلتر من التربسين 0.25% في كل بئر.
      ملاحظة: إعداد اثنين 96 ألواح جيدا في حال استنساخ أكثر من 96 من المتوقع أن يتم انتقاؤها.
    2. مع استخدام المجهر، وضع علامة على موضع كل استنساخ مرئية في الطبق 10 سم بجعل نقطة في الجزء السفلي من الطبق باستخدام علامة. سوف تتوافق مع كل نقطة إلى مستعمرة التقاطها.
    3. استبدال وسيلة تثقيف بما يكفي الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) تشكل طبقة رقيقة من السائل على استنساخ وعدم السماح للخلايا الجافة خلال عملية الانتقاء استنساخ.
    4. اختيار المستعمرات مفرد باستخدام ماصة 10 ميليلتر. إرفاق تلميح يحتوي على 5 ميليلتر من التربسين إلى المستعمرة وبطء الإفراج عن التربسين التي ستبقى المترجمة في المستعمرة. السماح التربسين لفصل الخلايا لمدة 1 دقيقة، ثم تتخلص من المستعمرة بالتلميح وتمتص منه إلى الحافة.
      ملاحظة: أثناء هذا الإجراء، التقليب الطبق قليلاً على جانب واحد حتى إنقاص حجم برنامج تلفزيوني حول مستعمرة اختياره سوف تساعد عملية الانتقاء بتجنب إضعاف التربسين حول المستعمرة. قد يساعد استخدام حزام استنساخ أيضا التقاط استنساخ واحدة.
    5. ضع الخلايا من المستعمرة إلى بئر لصفيحة جيدا 96 التي تحتوي على 10 ميليلتر من 0.25% التربسين.
    6. احتضان 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة، ثم سد البئر مع 150 ميليلتر من انتقائية المتوسطة (المتوسطة و 12 ك في لحم الخنزير (كين) وتستكمل مع 10% FBS، 2 مم ل الجلوتامين، البنسلين (0.5 وحدة لكل مل متوسطة)، ستربتوميسين (0.2 ميكروغرام كل مل متوسطة) والتي تحتوي على النيوميسين في بتركيز 0.7 ميكروغرام/مل.
      ملاحظة: خلال فترة حضانة المرض يمكن انتقاء الحيوانات المستنسخة الأخرى. من المستحسن اختيار استنساخ أكبر عدد ممكن. يتم انتقاؤها المستنسخين أكثر كلما زادت الفرص سيكون تحديد الإيجابية منها.
    7. بمجرد انتقاء جميع المستنسخين ونقلها في لوحة جيدا 96، تسمح للخلايا لتنمو لبضعة أيام في المتوسطة انتقائية و 12 ك في لحم الخنزير (كايغن) المتوسطة وتستكمل مع 10% FBS، 2 مم ل الجلوتامين، البنسلين (0.5 وحدة لكل مل متوسطة)، ستربتوميسين (0.2 ميكروغرام في المتر المسطح متوسطة) والتي تحتوي على النيوميسين بتركيز 0.7 ميكروغرام/مل عند 37 درجة مئوية و 5% CO2، حتى وصلت إلى التقاء 90%.
  5. تقسيم الحيوانات المستنسخة
    1. إعداد ثلاث لوحات جيدا 96 المغلفة مع الجيلاتين بإضافة ميليلتر 100 من الجيلاتين الواحد جيدا، احتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، ثم يغسل مرتين مع برنامج تلفزيوني. سيتم استخدام هذه اللوحات لاستخراج الحمض النووي (DNA لوحة) واستنساخ التجميد (تجميد الألواح).
      ملاحظة: سوف تعزز الجيلاتين المرفق للخلايا والحمض النووي للآبار. على وجه الخصوص، سيسمح طلاء الجيلاتين الحمض النووي عصا في الجزء السفلي من الآبار أثناء استخراج الحمض النووي، وتغسل الإجراءات (مناقشتها أدناه). أثناء إجراء تقسيم استنساخ، فإنه من المستحسن استخدام ماصة متعددة القنوات.
    2. نضح المتوسطة من كل بئر من لوحة جيدا 96 مجرد استنساخ التوصل إلى التقاء 90%، وتغسل ببرنامج تلفزيوني وإضافة 30 ميليلتر من التربسين 0.25% من كل بئر واحتضان لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية.
      ملاحظة: استنساخ سوف تنمو بمعدلات مختلفة، الذي سوف يعتمد أيضا على عدد الخلايا التي التقطت كل استنساخ. وهكذا، سيتم تنفيذ هذه الخطوة خلال عدة أيام عندما المستنسخين مختلفة تصل إلى التقاء 90%.
    3. إضافة ميليلتر 70 من انتقائية المتوسطة الواحدة وكذلك، وتعطيل كتل الخلايا عن طريق بيبيتينج أعلى وأسفل داخل الآبار، ثم نقل 30 ميليلتر من ميليلتر 100 لوحة الحمض النووي جيلاتينيزيد المعبأة مع 120 ميليلتر من المتوسطة انتقائية كل ميليلتر جيدا و 30 إلى لوحات تجميد gelatinized فيت المعبأة ح 50 ميليلتر المتوسطة (دون تحديد).
    4. ضع لوحة الحمض النووي في الحاضنة وتسمح للخلايا لتنمو في 37 درجة مئوية و 5% CO2 حتى التقاء 90%.
    5. إضافة ميليلتر 80 من المثلج الطازج 2 × تجميد المتوسطة (80% FBS و 20% ثنائي ميثيل سلفوكسيد ([دمس])) لكل بئر من لوحة التجميد، إضافة بارافيلم (رش مع الإيثانول 70 في المائة) أعلى لوحة حتى ختم كل بئر ووضع الغطاء في الأعلى والتفاف اللوحة مع رقائق الألومنيوم. وضع لوحات التجميد في-80 درجة مئوية.
    6. إضافة ميليلتر 90 من انتقائية المتوسطة الواحدة وكذلك إلى لوحة جيدا 96 الأصلي الذي يحتوي على النسخ التي قد تم تقسيمها ويبقيه في الثقافة حتى بكر فرز النتائج. سيتم استخدام هذه اللوحة كلوحة النسخ الاحتياطي.

2-فرز لاستنساخ مقاومة النيوميسين

  1. استخراج الحمض النووي من 96 لوحة الحمض النووي جيدا.
    1. وبمجرد استنساخ مثقف في لوحة الحمض النووي التوصل إلى التقاء 90%، يغسل 2 مرات مع برنامج تلفزيوني، ثم مع 50 المخزن المؤقت من تحلل ميليلتر (10 ملم تريس درجة الحموضة 7.5، 10 مم يدتا، 10 مم كلوريد الصوديوم، والحزب الديمقراطي الصربي 0.5%، والبروتيناز 1 ملغ/مل ك). تغطية اللوحة مع بارافيلم، وختم كل بئر، وضع الغطاء، مع التفاف ساران تغطية، ووضع في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
    2. إضافة 100 ميليلتر من الإيثانول البارد (وأوه)/محلول كلوريد الصوديوم (0.75 متر كلوريد الصوديوم في الإيثانول 100 ٪) لكل خير ويعجل ح 6 أو بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة.
      ملاحظة: يمكن أن يكون مؤقتاً البروتوكول هنا.
    3. إزالة الحل Et-أوه/كلوريد الصوديوم بعكس اللوحة ويغسل 3 مرات مع 200 ميليلتر من الإيثانول 70% من كل بئر.
    4. إضافة 25 ميليلتر من حل رناسي A في الماء المقطر واحتضان في 37 درجة مئوية ح 1.
  2. استخدم 3 ميليلتر من الحمض النووي للتضخيم PCR. إجراء فحص PCR من استنساخ المحدد باستخدام كبسولة تفجير الصلب داخل الجينات المقاومة النيوميسين وسوبتيلوميري 15q. [بكر] تضخيم تتم باستخدام الإنزيمات بوليميريز القياسية و بروتوكولات بكر21.
    ملاحظة: شروط بكر MS2 الإشعال (MS2-subtel15q-التمهيدي-S و MS2 التمهيدي ك) والإشعال إلى الظهور (رئيس الوزراء إلى الظهور ثانية والتمهيدي إلى الظهور ك) هي التالية: 98 درجة مئوية 20 s كخطوة تمسخ وثم 34 دورات في s 98 درجة مئوية 10، 58 درجة مئوية 20 ق، ق 72 درجة مئوية 15 ، باستخدام إنزيم بوليميراز في 25 ميليلتر مزيج رد فعل (انظر الجدول للمواد). وترد في الجدول 1متواليات التمهيدي.
  3. تشغيل PCR ردود الفعل على [اغروس] هلام واستخراج PCR العصابات التي تم الحصول عليها من الحيوانات المستنسخة إيجابية باستخدام إجراءات استخراج هلام القياسية (انظر الجدول للمواد لجل استخراج المواد الكاشفة).
  4. إجراء تحليلات تسلسل الحمض النووي المنتج استخراج هلام PCR لتأكيد وجود تسلسل MS221.
    ملاحظة: يمكن إجراء تحاليل تسلسل باستخدام أجهزة الإشعال المستخدمة لفحص PCR.
  5. الفحص جنوب وصمة عار لاستنساخ إيجابية PCR
    1. تنمو المستنسخين الإيجابية في بكر وفرز تسلسل من لوحة جيدا 96 الأصلي (لوحة النسخ الاحتياطي) إلى 6 اللوحات جيدا في المتوسط و 12 ك في لحم الخنزير (كايغن) وتستكمل مع 10% FBS، 2 مم ل الجلوتامين، البنسلين (0.5 وحدة لكل مل متوسطة)، ستربتوميسين (0.2 ميكروغرام كل مل متوسطة) والتي تحتوي على النيوميسين بتركيز 0.7 ميكروغرام/مل عند 37 درجة مئوية 5% أول أكسيد الكربون2.
      ملاحظة: بدلاً من ذلك، إذا كان قد تم فقدان بعض من هذه الحيوانات المستنسخة، ذوبان الجليد لهم من إحدى لوحات تجميد (انظر البروتوكول 2.6).
    2. بمجرد استنساخ في التقاء 90% في لوحة جيدا 6، تغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني وإضافة 250 ميليلتر من تحلل المخزن المؤقت الذي يحتوي على 0.5 ميكروغرام بروتيناز ك كل بئر.
    3. تتخلص من الخلايا باستخدام مكشطة خلية ونقل في أنبوب 1.5 مل.
    4. احتضان في 37 درجة مئوية ح 16.
    5. أضف 1 مل إيثانول 100% واهتز بشدة، والسماح للحمض النووي يعجل على الأقل 2 ح أو بين ليلة وضحاها في-20 درجة مئوية.
      ملاحظة: يمكن أن يكون مؤقتاً البروتوكول هنا.
    6. تدور في س 13,400 ز عند 4 درجة مئوية لمدة 10 دقائق، وتجاهل المادة طافية، وتغسل الكريات مع الإيثانول 70%. واسمحوا الكريات الهواء الجاف في درجة حرارة الغرفة. وبدلاً من ذلك، استخدم مركز فراغ.
    7. ريسوسبيند الكريات الحمض النووي في 50 ميليلتر من الماء المقطر الذي يحتوي على رناسي أ واحتضانها ح 1 في 37 درجة مئوية.
    8. هضم 5-10 ميكروغرام للحمض النووي باستخدام إنزيمات التقييد نكوي وبامهي (ديجيسشنز المستقلة اثنين) في حجم رد فعل ميليلتر 100 التي تفرخ ردود فعل الهضم عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
    9. تشغيل 4 ميليلتر من الهضم على [اغروس] هلام ([اغروس] 0.8 في المائة) لتأكيد إكمال الهضم.
    10. إضافة إلى حجم 1/10 من الحل م 3 خلات الصوديوم درجة الحموضة 5-2 و 2 كميات الإيثانول 100% إلى ردود فعل الهضم التقييد واحتضان على الأقل 2 ح أو بين عشية وضحاها في-20 درجة مئوية يعجل بالحمض النووي.
      ملاحظة: يمكن أن يكون مؤقتاً البروتوكول هنا.
    11. الطرد المركزي في 13,400 س ز عند 4 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة، وتجاهل في supernatants، وتغسل الكريات مع الإيثانول 70%. تسمح الكريات إلى الهواء الجاف في درجة حرارة الغرفة. وبدلاً من ذلك، استخدم مركز فراغ.
    12. ريسوسبيند الكريات في 20 ميليلتر من الماء المقطر وتحميل الحمض النووي هضمها على 0.8% [اغروس] هلام.
      ملاحظة: للحصول على حل أفضل لهضم الحمض النووي، إعداد جل مالا يقل عن 15 سم طويلة وتشغيل بين عشية وضحاها في الجهد المنخفض (فور ثري زيرو فولت). ينبغي أن يكون الأمثل التفريد إعداد.
    13. في اليوم التالي، وصمة عار الهلام مع عامل التوسيم الحمض النووي، مثل بروميد اثيديوم بتركيز نهائي 1 ميليلتر/10 مل، لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة والتقاط صورة مع مسطرة قريبة من الجل على جل التصوير الصك.
    14. تعيين نقل الحمض النووي لغشاء نايلون وأداء الغشاء التهجين مع تحقيق خاصة بتسلسل MS2 استخدام إجراءات معيارية21.
    15. ذوبان الجليد المستنسخين الإيجابية في بكر، الحمض النووي تتابعها والجنوب وصمة عار من واحدة من لوحات تجميد اثنين (انظر الخطوة التالية).
  6. ذوبان الجليد من الحيوانات المستنسخة
    1. إعداد أنبوب 15 مل واحد يحتوي على 5 مل من و-12 ك قبل حرارة حم المتوسطة (كين) وتستكمل مع 10% FBS، مم 2 لتر-الجلوتامين والبنسلين (0.5 وحدة لكل مل متوسطة) ستربتوميسين (0.2 ميكروغرام كل مل متوسط) لكل استنساخ يكون مذاب.
    2. إزالة أحد لوحات التجميد من درجة-80 وإضافة 100 ميليلتر من قبل حرارة متوسطة كاملة F12K لتتضمن أيضا استنساخ إيجابية يكون مذاب.
      ملاحظة: يجب أن يتم تنفيذ هذا الإجراء بسرعة، وينبغي أن توضع لوحة جيدا 96 على الثلج الجاف بعد هو إذابة كل استنساخ، بغية السماح باستنساخ أخرى أن تظل مجمدة. هذا مهم خاصة إذا كان استنساخ متعددة تحتاج إلى يكون مذاب من نفس اللوحة جيدا 96.
    3. نقل الخلايا إلى أنبوب 15 مل يحتوي على 5 مل من المتوسطة وأجهزة الطرد المركزي في 800 x ز لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    4. نضح المتوسطة، ريسوسبيند الخلايا في 500 ميليلتر من قبل حرارة متوسطة F12K كاملة، ونقل كل استنساخ لبئر واحدة من 12 لوحة جيدا.
  7. القضاء على الجينات المقاومة النيوميسين من الكاسيت MS2 المتكاملة في سوبتيلوميري 15q.
    1. السماح باستنساخ تنمو من 12 لوحة جيدا لطبق 10 سم في كامل F12K المتوسطة.
      ملاحظة: النيوميسين أن لا يدرج في الأجل المتوسط ما لم يتبين خلاف ذلك.
    2. إضافة إتش معربا عن لجنة المساواة العرقية إلى الخلايا المستزرعة في طبق 10 سم في التقاء 70% في 10 مل من إكمال F12K المتوسطة.
      ملاحظة: استخدام إتش وإذ تعرب عن لجنة المساواة العرقية-التجارة والنقل سيسمح تقييم كفاءة العدوى، الذي ينبغي أن الاقتراب من نسبة 100%. سيتم فقدان إتش معيبة النسخ المتماثل بعد بضع فقرات في الثقافة.
    3. 48 ساعة بعد الإصابة، تقسيم الخلايا في ثلاثة أطباق 10 سم. سيتم استخدام الأطباق اثنين لتحقق إزالة الجينات النيوميسين بالانتقاء السلبي، تنمو خلايا تحتوي على النيوميسين المتوسطة (طبق أولاً)، ومن الجنوب لطخة (الطبق الثاني).
    4. الثقافة الطبق الثالث الذي يحتوي على النسخة لتجميد الخلايا واستخراج الحمض النووي الريبي.

3-تحقق إعراب تيرا-MS2 نسخة RT-قبكر

  1. عند تحقق إزالة الجينات النيوميسين، أداء مجموع استخراج الحمض النووي الريبي من تيرا-MS2 الحيوانات المستنسخة باستخدام المذيبات العضوية (حل إيسوثيوسيناتي الفينول وغوانيدين)21.
    1. ريسوسبيند الحمض النووي الريبي المستخرج من طبق 10 سم في 100 ميليلتر من الماء بيروكاربوناتي (ديبك) إثيل.
    2. تشغيل 3 ميليلتر من الجيش الملكي النيبالي على جل حمض (والمماسح) بروبانيسولفونيك 3-(N-Morpholino) ديناتوراتينج (1% فورمالدهايد تتضمن) 1 x بغية التحقق من تركيز ووحدة من الجيش الملكي النيبالي. كما يحلل تركيز الجيش الملكي النيبالي باستخدام جهاز المطياف الضوئي.
    3. علاج 3 ميكروغرام للجيش الملكي النيبالي مع الدناز أنا استخدام الوحدة 1 من الدناز أنا الإنزيم في 60 حجم الرد النهائي ميليلتر.
    4. تبني رد فعل ح 1 في 37 درجة مئوية.
  2. عكس رد فعل النسخ وتحليﻻت qPCR
    1. أضف المكونات التالية إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي خالية من نوكلاس: ميليلتر 2 تيرا 1 ميكرومتر محددة تمهيدي، 1 ميليلتر من دنتبس ميكس (10 ملم في كل)، 6 ميليلتر من الدناز أنا-معاملة الحمض النووي الريبي (المقابلة للجيش الملكي النيبالي ̴300ng). ضبط حجم الصوت إلى ميليلتر 13 مع 4 ميليلتر من الماء ديبك.
      ملاحظة: لكل الجيش الملكي النيبالي تحليلها، أنبوب ثان يحتوي على الكواشف نفس ولكن تمهيدي إشارة محددة، بدلاً من تيرا التمهيدي محددة، ينبغي أن تعد.
    2. تسخين المزيج إلى 65 درجة مئوية لمدة 5 دقائق واحتضان في الجليد لمدة 1 دقيقة على الأقل.
    3. جمع محتويات الأنابيب بالطرد المركزي قصيرة وإضافة 4 ميليلتر من 5 X RT الإنزيم المخزن المؤقت، ديثيوثريتول م 0.1 1 ميليلتر (DTT)، 1 ميليلتر (4 وحدات) من رناسي المانع، و 1 ميليلتر من المنتسخة العكسية (انظر الجدول للمواد).
    4. احتضان هذه العينات في 42 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة، ثم استخدم 2 ميليلتر من رد فعل RT لتحليلات qPCR.
  3. إعداد مزيج رد فعل قبكر بحجم نهائي في 20 ميليلتر تتألف من 10 ميليلتر من مزيج الرئيسي x qPCR 2، 2 ميليلتر من قالب كدنا، 1 ميليلتر من التمهيدي إلى الأمام (10 ميكرومتر)، 1 ميليلتر لعكس التمهيدي (10 ميكرومتر)، و 6 ميليلتر من الماء.
  4. القيام برد فعل قبكر في ثيرموسيكلير استخدام البروتوكولات القياسية21.

4-إنتاج لفي معربا عن MS2-بروتينات فلورية خضراء

  1. لتوليد لفي تعرب عن MS2-التجارة والنقل، ترانسفيكت 80% فينيكس المتلاقية تغليف الخلايا مع بروتين انصهار MS2-بروتينات فلورية خضراء الإعراب لفي المتجهات (بورو ببابي-MS2-التجارة والنقل) وجينات الحياة الفطرية التعبير عن المتجهات (مثل بكمف-فسفج) باستخدام نسبة 4:1 للمولى موجهات اثنين.
  2. اليوم التالي، استبدال وسيلة تثقيف (دميم تكملة مع 10% FBS، مم 2 لتر-الجلوتامين والقلم/بكتيريا) تحتوي على المتوسط الطازجة 10 ملم الصوديوم بوتيرات.
  3. احتضانها ح 8 في 37 درجة مئوية، وأول أكسيد الكربون 5%2، ثم استبدال المتوسطة مع المتوسط تثقيف الطازجة التي ستجمع الفيروس.
  4. بعد 48 ساعة، إزالة المتوسطة المحتوية على لفي من الخلايا فينيكس. هذه الوسيلة يمكن استخدامها مباشرة للعدوى من الحيوانات المستنسخة تيرا-MS2، وفي هذه الحالة تصفية المتوسطة من خلال عامل تصفية 0.45 ميكرومتر، إضافة بوليبريني (30 ميكروغرام/مل تركيز النهائية) وإضافتها إلى الخلايا (في هذه الحالة ما زالت البروتوكول في الخطوة 5). وبدلاً من ذلك، يمكن عجلت لفي في أنبوب فالكون 50 مل بإضافة 1/5 حجمال 50% شماعة-8000/900 ملم محلول كلوريد الصوديوم وتفرخ بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية على عجلة المدورة.
  5. اليوم التالي، بيليه لفي الجسيمات باستخدام الطرد المركزي في 2,000 ز س لمدة 30 دقيقة، إزالة المادة طافية، وريسوسبيند بيليه في المتوسط F12K دون المصل.
    ملاحظة: يمكن حراكه جزيئات الفيروس في 1/100th حجم طافية الأصلي. ينبغي أن يقوم اختبار إصابة بغية التحقق من حجم الحد الأدنى لفي اللازمة لكفاءة تصيب الخلايا.

5-التصور النصوص تيرا-MS2 في الخلايا الحية

  1. لوحة استنساخ تيرا-MS2 ووزن AGS الخلايا في أطباق زجاجية. اليوم من الإصابة، إضافة بوليبريني إلى المتوسطة (30 ميكروغرام/مل تركيز النهائية) ولفي تعرب عن MS2-التجارة والنقل.
  2. بعد 24 ساعة، تجاهل المتوسطة التي تحتوي على الفيروسات وإضافة متوسطة جديدة دون الحمراء الفينول.
  3. تحليل الخلايا في مجهر مقلوب استخدام الإعداد المناسب المجهر. الصورة في الخلايا التي تحتوي 100 X أو 60 X الهدف مع فتحه عددية كبيرة (1.4 X) واستخدام كاميرا حساسة (امككد). استخدام نظام مراقبة البيئة للحفاظ على العينات في شركة 37 درجة مئوية و 5%2 أثناء التصوير.

النتائج

الرقم 1 يمثل نظرة استراتيجية تجريبية. تظهر الخطوات الرئيسية للبروتوكول ومخطط زمني إرشادي للجيل من الحيوانات المستنسخة تيرا-MS2 في الخلايا AGS (الشكل 1أ). في اليوم الأول، هي transfected آبار متعددة للوحة جيدا 6 مع كاسيت MS2 وسجرنا/Cas9 الت?...

Discussion

في هذا المقال نقدم وسيلة لتوليد السرطان البشرية استنساخ الخلية التي تحتوي على تسلسلات MS2 المتكاملة داخل سوبتيلوميري 15q. استخدام هذه الحيوانات المستنسخة، الجزيئات تيرا MS2 معلم نسخها من سوبتيلوميري 15q اكتشاف بالفحص المجهري fluorescence المشارك التعبير عن البروتين الانصهار MS2-التجارة والنقل. هذا ?...

Disclosures

الكتاب يعلن لا تضارب المصالح المالية

Acknowledgements

ونحن ممتنون لموظفي مرفق التصوير المتقدم من سيبيو في بجامعة ترنتو ومرفق "بيوبتيكس الخفيفة الميكروسكوب" في واو ماكس بيروتس المختبرات (مفبل) في فيينا. البحوث المؤدية إلى هذه النتائج تلقت تمويلاً من ستيفتونغ اوبرمان مالك والبرنامج الإطاري السابع للاتحاد الأوروبي للبحث والتنمية التكنولوجية ومظاهره تحت المنحة من لا 609431 للجماعة الأوروبية. تدعمه المفوضية الأوروبية على زمالة ريتا ليفي مونتالشيني من الوزارة الإيطالية للتعليم الجامعي والبحوث (وزارة).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
AGS cells--Gift from Christian Baron (Université de Montréal).
F12K Nut Mix 1XGIBCO21127022Culturing medium for AGS cells
L-Glutamine CORNINGMT25005CIComponent of cell culturing medium
Penicillin Streptomycin SolutionCORNING30-002-CIComponent of cell culturing medium
Fetal Bovine SerumSigma AldrichF2442Component of cell culturing medium
DMEM 1XGIBCO21068028culturing medium for phoenix cell
CaCl2Sigma AldrichC1016used in phoenix cell transfection
HEPESSigma AldrichH3375used in phoenix cell transfection (HBS solution)
KClSigma AldrichP9333used in phoenix cell transfection (HBS solution)
DextroseSigma AldrichD9434used in phoenix cell transfection (HBS solution)
NaClSigma AldrichS7653used in phoenix cell transfection (HBS solution) and retrovirus precipitation
Na2HPO4Sigma AldrichS3264used in phoenix cell transfection (HBS solution)
TRYPSIN EDTA SOLUTION 1XCORNING59430Cused in cell split
DPBS 1XGIBCO14190250Dulbecco's Phosphate Buffered Saline
DMSOSigma AldrichD8418Component of cell freezing medium (80% FBB and 20% DMSO)
G-418 DisulphateFormediumG4185selection drug for 
Gelatin solution BioreagentSigma AldrichG1393cotaing of 96 well DNA plate and freezing plate
Tris-baseFisher BioReagents10376743Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction
EDTASigma AldrichE6758Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction
SDSSigma Aldrich71729Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction
Proteinase KThermo FisherAM2546Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction
RNAse AThermo Fisher12091021RNA degradation during DNA extraction
AgaroseSigma AldrichA5304DNA gel preparation
Atlas ClearSightBioatlasBH40501Stain reagent used for detecting DNA and RNA samples in agarose gel
ethanolFisher BioReagentsBP28184DNA precipitation
Sodium Acetate Sigma Aldrich71196Used for DNA precipitation at a 3M concentration pH5.2
Wizard SV Gel and PCR clean-Up systemPromegaA9282Extraction of PCR fragments from agarose gel during PCR screening of neomycin positive clones
TrizolAMBION15596018Organic solvent used for RNA extraction
Dnase ITHERMO SCIENTIFIC89836degradation of genomic DNA from RNA 
dNTPs mixInvitrogen10297018used in RT and PCR reactions
DTTInvitrogen707265MLused in RT reactions
diethyl pyrocarbonateSigma AldrichD5758used to inactivate RNAses in water (1:1000 dilution)
RibolockThermo FisherEO0381RNase inhibitor
MOPSSigma AldrichM9381preparation of RNA gel
ParaformaldehydeElectron Microscopy Sciences15710preparation of denaturating RNA gel (1% PFA in 1x MOPS)
Superscript III Reverse transcriptaseInvitrogen18080-093Retrotranscription reaction
Pfu DNA polymerase (recombinant)Thermo ScientificEP0501PCR reaction
2X qPCRBIO SyGreen Mix Separate-ROXPCR BIOSYSTEMSPB 20.14qPCR reaction
Cre-GFP adenovirushttps://medicine.uiowa.edu/vectorcore1174-HTused to infect TERRA-MS2 clones in order to remove the neomycn gene
Sodium ButyrateSigma AldrichB5887used to promote retrovirus particles production in phoenix cells
PEG8000Sigma Aldrich89510Precipitation of retrovirus partcles
35µ-Dish Glass BottomIbidi81158used in live cell imaging analyses of TERRA-MS2 clones

References

  1. Azzalin, C. M., Reichenbach, P., Khoriauli, L., Giulotto, E., Lingner, J. Telomeric repeat containing RNA and RNA surveillance factors at mammalian chromosome ends. Science. 318 (5851), 798-801 (2007).
  2. Schoeftner, S., Blasco, M. A. Developmentally regulated transcription of mammalian telomeres by DNA-dependent RNA polymerase II. Nature Cell Biology. 10 (2), 228-236 (2008).
  3. Diman, A., Decottignies, A. Genomic origin and nuclear localization of TERRA telomeric repeat-containing RNA: from Darkness to Dawn. FEBS Journal. , (2017).
  4. Arnoult, N., Van Beneden, A., Decottignies, A. Telomere length regulates TERRA levels through increased trimethylation of telomeric H3K9 and HP1alpha. Nature Structural & Molecular Biology. 19 (9), 948-956 (2012).
  5. Montero, J. J., et al. TERRA recruitment of polycomb to telomeres is essential for histone trymethylation marks at telomeric heterochromatin. Nature Communications. 9 (1), 1548 (2018).
  6. Beishline, K., et al. CTCF driven TERRA transcription facilitates completion of telomere DNA replication. Nature Communications. 8 (1), 2114 (2017).
  7. Arora, R., et al. RNaseH1 regulates TERRA-telomeric DNA hybrids and telomere maintenance in ALT tumour cells. Nature Communications. 5, 5220 (2014).
  8. Balk, B., et al. Telomeric RNA-DNA hybrids affect telomere-length dynamics and senescence. Nature Structural & Molecular Biology. 20 (10), 1199-1205 (2013).
  9. Graf, M., et al. Telomere Length Determines TERRA and R-Loop Regulation through the Cell Cycle. Cell. 170 (1), 72-85 (2017).
  10. Lee, Y. W., Arora, R., Wischnewski, H., Azzalin, C. M. TRF1 participates in chromosome end protection by averting TRF2-dependent telomeric R loops. Nature Structural & Molecular Biology. , (2018).
  11. Moravec, M., et al. TERRA promotes telomerase-mediated telomere elongation in Schizosaccharomyces pombe. EMBO Reports. 17 (7), 999-1012 (2016).
  12. Cusanelli, E., Romero, C. A., Chartrand, P. Telomeric noncoding RNA TERRA is induced by telomere shortening to nucleate telomerase molecules at short telomeres. Molecular Cell. 51 (6), 780-791 (2013).
  13. Moradi-Fard, S., et al. Smc5/6 Is a Telomere-Associated Complex that Regulates Sir4 Binding and TPE. PLoS Genetics. 12 (8), e1006268 (2016).
  14. Chu, H. P., et al. TERRA RNA Antagonizes ATRX and Protects Telomeres. Cell. 170 (1), 86-101 (2017).
  15. Lai, L. T., Lee, P. J., Zhang, L. F. Immunofluorescence protects RNA signals in simultaneous RNA-DNA FISH. Experimental Cell Research. 319 (3), 46-55 (2013).
  16. Zhang, L. F., et al. Telomeric RNAs mark sex chromosomes in stem cells. Genetics. 182 (3), 685-698 (2009).
  17. Gallardo, F., Chartrand, P. Visualizing mRNAs in fixed and living yeast cells. Methods in Molecular Biology. 714, 203-219 (2011).
  18. Querido, E., Chartrand, P. Using fluorescent proteins to study mRNA trafficking in living cells. Methods in Cell Biology. 85, 273-292 (2008).
  19. Cusanelli, E., Chartrand, P. Telomeric noncoding RNA: telomeric repeat-containing RNA in telomere biology. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 5 (3), 407-419 (2014).
  20. Perez-Romero, C. A., Lalonde, M., Chartrand, P., Cusanelli, E. Induction and relocalization of telomeric repeat-containing RNAs during diauxic shift in budding yeast. Current Genetics. , (2018).
  21. Avogaro, L., et al. Live-cell imaging reveals the dynamics and function of single-telomere TERRA molecules in cancer cells. RNA Biology. , 1-10 (2018).
  22. Ran, F. A., et al. Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity. Cell. 154 (6), 1380-1389 (2013).
  23. Yamada, T., et al. Spatiotemporal analysis with a genetically encoded fluorescent RNA probe reveals TERRA function around telomeres. Scientific Reports. 6, 38910 (2016).
  24. Deng, Z., et al. Formation of telomeric repeat-containing RNA (TERRA) foci in highly proliferating mouse cerebellar neuronal progenitors and medulloblastoma. Journal of Cell Science. 125 (Pt 18), 4383-4394 (2012).
  25. Casini, A., et al. A highly specific SpCas9 variant is identified by in vivo screening in yeast. Nature Biotechnology. 36 (3), 265-271 (2018).
  26. Nergadze, S. G., et al. CpG-island promoters drive transcription of human telomeres. RNA. 15 (12), 2186-2194 (2009).
  27. Porro, A., et al. Functional characterization of the TERRA transcriptome at damaged telomeres. Nature Communications. 5, 5379 (2014).
  28. Farnung, B. O., Brun, C. M., Arora, R., Lorenzi, L. E., Azzalin, C. M. Telomerase efficiently elongates highly transcribing telomeres in human cancer cells. PLoS One. 7 (4), e35714 (2012).
  29. Flynn, R. L., et al. Alternative lengthening of telomeres renders cancer cells hypersensitive to ATR inhibitors. Science. 347 (6219), 273-277 (2015).
  30. Scheibe, M., et al. Quantitative interaction screen of telomeric repeat-containing RNA reveals novel TERRA regulators. Genome Research. 23 (12), 2149-2157 (2013).
  31. Bolland, D. J., King, M. R., Reik, W., Corcoran, A. E., Krueger, C. Robust 3D DNA FISH using directly labeled probes. Journal of Visualized Experiments. (78), (2013).
  32. Masui, O., et al. Live-cell chromosome dynamics and outcome of X chromosome pairing events during ES cell differentiation. Cell. 145 (3), 447-458 (2011).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

143 telomere Cas9MS2

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved