Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול ליצירת סרטן התא שיבוטים המכיל תגית רצף MS2 ב subtelomere יחיד. גישה זו, בהסתמך על מערכת MS2-GFP, מאפשרת הדמיה של התרשימים אנדוגני של telomeric המכילים חוזר RNA (TERRA) הביע מ טלומר יחיד בתאים חיים.

Abstract

טלומרים משוקלטים, והוליד telomeric המכילים חוזר זמן noncoding RNAs (TERRA), אשר הוצעו כדי לשחק תפקידים חשובים בביולוגיה טלומר, כולל היווצרות הטרוכרומטין טלומר אורך הומאוסטזיס. הממצאים האחרונים גילה כי מולקולות טרה גם לקיים אינטראקציה עם אזורים פנימיים כרומוזומלית להסדיר ביטוי גנים בתאי גזע עובריים (ES) העכבר. בקנה אחד עם הראיות, קרינה פלואורסצנטית RNA ניתוחים בחיי עיר הכלאה (RNA-דג) הראו כי רק תת-ערכה של טרה תעתיקים לשפה קצותיו כרומוזום. הבנה טובה יותר של הדינמיקה של מולקולות טרה נעזור להגדיר פונקציה ואת מנגנוני הפעולה שלהם. כאן, אנו מתארים שיטה כדי לתייג והמחש יחיד-טלומר תעתיקים טרה בתאי סרטן באמצעות מערכת MS2-GFP. לכוונה זו, אנו מציגים פרוטוקול כדי ליצור שיבוטים יציב, באמצעות AGS שהבטן האנושית סרטן תא קו, המכיל רצפי MS2 משולב ב subtelomere יחיד. תמלול של טרה מ טלומר מתויג MS2 תוצאות הביטוי של מולקולות מתויג MS2 טרה הם דמיינו ידי קרינה פלואורסצנטית לחיות תאים במיקרוסקופ על ביטוי משותף של חלבון מחייב MS2 RNA דבוקה GFP (MS2-GFP). גישה זו מאפשרת לחוקרים ללמוד את הדינמיקה של יחיד-טלומר טרה מולקולות בתאים סרטניים, ניתן להחיל אותה על שורות תאים אחרים.

Introduction

טרה RNA noncoding זמן הוא עיבד מאזור subtelomeric של כרומוזומים, שעתוק שלה ההכנסות לכיוון הקצוות כרומוזום, הפסקת בתוך בדרכי. אני חוזר telomeric1,2. מסיבה זו, טרה תעתיקים מורכב subtelomeric, נגזר רצפים בסוף 5' ולסיים עם telomeric חזרה (UUAGGG גולגולת)3. חשוב תפקידי הוצעו על TERRA, כולל הטרוכרומטין היווצרות-טלומרים4,5, ה-DNA שכפול6, קידום רקומבינציה הומולוגית בין כרומוזום מסתיים7,8 , 9, ויסות טלומר מבנה10ו טלומר אורך הומאוסטזיס2,11,12,13. יתר על כן, טרה תעתיקים אינטראקציה עם אתרים רבים extratelomeric להסדיר ביטוי גנים נרחבת תאי גזע עובריים (ES) העכבר14. בקנה אחד עם אלה ראיות, קרינה פלואורסצנטית RNA בחיי עיר הכלאה ניתוחים (RNA-דג) הראו כי רק תת-ערכה של טרה הפרוטוקולים לשפה טלומרים1,2,15. בנוסף, טרה דווח טופס גרעיני אגרגטים לוקליזציה על הכרומוזומים X ו- Y העכבר תאים2,16. ממצאים אלה מצביעים על TERRA תעתיקים לעבור דינמיקה מורכבת בתוך הגרעין. הבנת הדינמיקה של מולקולות טרה תסייע להגדיר פונקציה ואת מנגנוני הפעולה שלהם.

מערכת MS2-GFP כבר בשימוש נרחב כדי להמחיש מולקולות RNA בתאים חיים של אורגניזמים שונים17,18. מערכת זו שימש בעבר כדי לתייג והמחש יחיד-טלומר מולקולות טרה cerevisiae ס12,19. באמצעות מערכת זו, זה היה לאחרונה הוכיח כי שמרים טרה תעתיקים בתרגום בתוך הציטופלסמה במהלך שלב shift פוסט-diauxic, רומז כי טרה לנצל פונקציות extranuclear20. השתמשנו לאחרונה מערכת MS2-GFP ללמוד יחיד-טלומר תעתיקים טרה סרטן תאים21. לכוונה זו, אנחנו מועסקים CRISPR/Cas9 הגנום כלי עריכה כדי לשלב את רצפי MS2 ב טלומר יחיד (טלומר 15q, להלן Tel15q) וקיבלתי שיבוטים ביטוי מתויג MS2 אנדוגני Tel15q טרה (TERRA-MS2 שיבוטים). ביטוי שיתוף התמזגו-GFP MS2 RNA מחייב חלבון (MS2-GFP) מזהה ומאגד רצפי MS2 RNA מאפשר החזיית יחיד-טלומר טרה תעתיקים חי תאים21. המטרה של פרוטוקול מאויר כאן היא לתאר בפירוט את הפעולות הדרושות עבור הדור של טרה-MS2 שיבוטים.

כדי ליצור שיבוטים טרה-MS2, קלטת MS2 משולב בתוך האזור subtelomeric של טלומר 15q, במורד הזרם של טרה יזם האזור ואת שעתוק התחלה האתר. בקלטת MS2 מכילה גן עמידות neomycin ולצדו אתרי סלומון-p, בהיותה אינטגרטיבית-subtelomere 15q מתבצעת באמצעות מערכת CRISPR/Cas922. לאחר תקנים של MS2 קלטת, יחיד שיבוטים שנבחרו subtelomeric שילוב של הקלטת מאומת על ידי ה-PCR, כתם DNA רצף ובדרום. שיבוטים חיובי נגוע אדנו לבטא-Cre למען הסר סמן הבחירה בקלטת, עוזב רק רצפי MS2 ואתר לקס יחיד-p-subtelomere 15q. הביטוי של טרה מתויג MS2 הפרוטוקולים מ Tel15q מאומתת על ידי RT-qPCR. בסופו של דבר, בא לידי ביטוי החלבון פיוז'ן MS2-GFP ב- TERRA-MS2 שיבוטים דרך זיהום retroviral כדי להמחיש תעתיקים MS2-טרה על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ. טרה תעתיקים אפשר לזהות בקלות בעזרת RNA-דג, הדמיה לחיות תאים באמצעות telomeric חוזר ספציפי רגשים1,2,15,23. גישות אלה לספק מידע חשוב על הלוקליזציה של מכלל האוכלוסייה של טרה מולקולות ברזולוציה תא בודד. הדור של שיבוטים המכיל רצפי MS2 ב subtelomere יחיד יאפשר לחוקרים ללמוד את הדינמיקה של יחיד-טלומר תעתיקים טרה בתאים חיים, אשר יסייע להגדיר את תפקוד ואת מנגנוני הפעולה של טרה.

Protocol

1. הבחירה של שיבוטים Neomycin עמיד

  1. לגדל תאים AGS במדיום F-12_K של חזיר (Kaighn), בתוספת 10% עוברית שור סרום (FBS), 2 מ מגלוטמין פניצילין (0.5 יחידות לכל מיליליטר בינוני), סטרפטומיצין (0.2 µg לכל מיליליטר בינונית)-CO 37 ° C ו-5%2. Transfect התאים ב- 50-60% בשילוב עם sgRNA/Cas9 להביע וקטור, בקלטת MS2 בעשר: 1 יחס טוחנת21.
    הערה: בניסוי מקביל, לאמת תרביות תאים יעילות על ידי transfecting GFP-להביע וקטור (קרי, Cas9-GFP וקטורית). לפחות צריך להיות מושגת יעילות תרביות תאים 60-70%.
  2. למחרת, החלף את המדיום culturing בינוני המכיל neomycin-µg/mL 0.7 הסופי ריכוז (סלקטיבית בינוני).
    הערה: פיצול התאים, זריעה אותם אמצעי סלקטיבי יום אחרי תרביות תאים יזרז את תהליך הבחירה. כל התאים שאינם transfected ימותו מיד. אם תרביות תאים מבוצע ב 6 צלחות טוב, ובמקרה מכל קידוח ב 60% הנהרות יכיל כ 0.7 x 106 תאים, למחרת היום שניתן לפצל את התאים מבאר יחיד למדיום 10 ס מ מאכל המכיל סלקטיבי.
  3. לשמור את התאים במדיום סלקטיבי במשך 7-10 ימים, שינוי בינוני כל אחד או יומיים, עד יחיד שיבוטים גלויים.
  4. איסוף של שיבוטים תא
    1. להכין צלחת טוב 96 המכיל 10 µL של 0.25% טריפסין כל היטב.
      הערה: להכין שני 96 צלחות טוב למקרה שיבוטים יותר מ 96 צפויים להיבחר.
    2. עם השימוש של מיקרוסקופ, לסמן את המיקום של כל המשובטים גלוי בצלחת 10 ס מ על-ידי הפיכת נקודה בחלק התחתון של המנה באמצעות סמן. כל נקודה יתאים למושבת לאסוף אותם.
    3. החלף את המדיום culturing עם מספיק פוספט Buffered מלוחים (PBS) יוצרים סרט דק של נוזל על השיבוטים ולתת לא התאים יבש במהלך האיסוף שיבוט.
    4. לבחור אחת המושבות באמצעות פיפטה של 10 µL. לצרף את הטיפ המכיל 5 µL של טריפסין למושבה ולשחרר לאט טריפסין אשר יישאר מקומי על המושבה. לאפשר טריפסין לנתק את התאים עבור 1 דקות, ואז לגרד את המושבה עם הקצה תתמודד לתוך הקצה.
      הערה: במהלך הליך זה, היפוך המנה קצת בצד אחד אז כדי להקטין את הנפח של PBS סביב המושבה להיבחר יעזור בתהליך איסוף על ידי הימנעות דילול של טריפסין סביב המושבה. באמצעות טבעת גומי עשוי גם לסייע לאסוף שיבוטים יחיד.
    5. מקם את התאים מהמושבה לבאר של צלחת טוב 96 המכיל 10 µL של טריפסין 0.25%.
    6. דגירה 5 דקות בטמפרטורת החדר, ואז למלא את הבאר µL 150 סלקטיבי בינוני (F - 12K של חזיר (Kaighn) בינוני בתוספת 10% FBS, 2 מ מגלוטמין, פניצילין (0.5 יחידות לכל מיליליטר בינוני), סטרפטומיצין (0.2 µg לכל מיליליטר בינוני), המכיל neomycin ב ריכוז של 0.7 µg/mL.
      הערה: במהלך זמן הדגירה שיבוטים אחרים יכולים לבחור בהם. מומלץ לבחור שיבוטים רבים ככל האפשר. עוד שיבוטים נאספות יהיה גבוה יותר הסיכויים לזיהוי אלה חיובית.
    7. ברגע השיכפולים בחרה והעבירו בצלחת טוב 96, מאפשרים לתאים לגדול לכמה ימים סלקטיבי בינוני בינוני F - 12K של חזיר (Kaighn) בתוספת 10% FBS, 2 מ מגלוטמין, פניצילין (0.5 יחידות לכל מיליליטר בינוני), סטרפטומיצין (0.2 µg לכל mL בינוני), המכיל neomycin-ריכוז של µg/mL 0.7-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2, עד שהגיע למפגש 90%.
  5. פיצול של שיבוטים
    1. להכין שלוש צלחות טוב 96 מצופה עם ג'לטין על-ידי הוספת 100 µL של ג'לטין לכל טוב, תקופת דגירה של 30 דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן לשטוף פעמיים עם PBS. הצלחות האלה ישמש להפקת DNA (DNA צלחת) ועבור שיבוט קפוא (צלחות ההקפאה).
      הערה: ג'לטין תקדם את הקובץ המצורף של התאים ושל ה-DNA הבארות. בפרט, ציפוי הג'לטין יאפשר את ה-DNA מקל בתחתית הבארות במהלך הפקת דנ א. ולשטוף הליכים (נדון להלן). במהלך ההליך פיצול-שיבוט, מומלץ להשתמש עם פיפטה רב-ערוצי.
    2. ברגע שיבוטים להגיע למפגש 90%, תשאף בינוני מכל קידוח של צלחת טוב 96 לשטוף עם PBS, להוסיף 30 µL של 0.25% טריפסין לכל טוב, תקופת דגירה של 5 דקות ב 37 º C.
      הערה: יגדל בקצב שונה, אשר גם תלוי מספר התאים בחרה לכל שיבוט שיבוטים. לפיכך, צעד זה יבוצעו במהלך מספר ימים כאשר שיבוטים שונות להגיע למפגש 90%.
    3. להוסיף µL 70 סלקטיבי בינוני לכל טוב, לשבש גושים תא על-ידי pipetting למעלה ולמטה בתוך הבארות, ואז להעביר 30 µL של µL 100 הצלחת ה-DNA gelatinized שמולאו מראש עם 120 µL סלקטיבית בינוני לכל µL טוב ו-30 כדי gelatinized מקפיא צלחות שמולאו מראש העד h 50 µL בינונית (ללא בחירה).
    4. מקם את הצלחת ה-DNA בחממה ולאפשר לתאים לגדול ב 37 ° C ו 5% CO2 עד 90% הנהרות.
    5. להוסיף µL 80 של קרח טריות 2 x קפוא בינוני (80% FBS ו-20% דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד)) כל טוב של צלחת קופא, להוסיף מצלמות-מיקרוסקופים (ריסס עם 70% אתנול) על גבי הלוח כדי לאטום כל טוב, למקם את המכסה העליון, לעטוף את הצלחת עם רדיד אלומיניום. המקום הקפאת צלחות ב-80 מעלות צלזיוס.
    6. הוסף µL 90 סלקטיבי בינוני לכל טוב טוב המקורי 96 לצלחת המכילה שיבוטים פוצלו ולהשאיר אותה בתרבות עד ה-PCR הקרנת תוצאות. הצלחת הזו תשמש כמו צלחת גיבוי.

2. הקרנת שיבוטים Neomycin עמיד

  1. מיצוי DNA מהצלחת דנ א טוב 96.
    1. ברגע שיבוטים תרבותי בצלחת דנ א להגיע למפגש 90%, לשטוף 2 פעמים עם PBS, ולאחר מכן lyse עם מאגר פירוק µL 50 (10 מ מ טריס pH 7.5, 10 מ מ EDTA, 10 מ מ NaCl מרחביות 0.5%, 1 מ"ג/מ"ל proteinase K). כיסוי לצלחת עם מצלמות-מיקרוסקופים, איטום אחד טוב, שים את המכסה, לכסות עם הניילון הנצמד, במקום בגיל 37 º C למשך הלילה.
    2. להוסיף 100 µL קר אתנול (Et-OH) / פתרון NaCl (0.75 מ' NaCl ב- 100% אתנול) לכל אחד טוב לזרז במשך 6 שעות או ללילה בטמפרטורת החדר.
      הערה: הפרוטוקול אפשר לעצור כאן.
    3. להסיר את הפתרון Et-הו/NaCl על-ידי היפוך את הצלחת ולשטוף 3 פעמים עם 200 µL של 70% אתנול לכל טוב.
    4. להוסיף 25 µL של פתרון RNAse A במים מזוקקים, דגירה ב 37 ° C עבור 1 h.
  2. השתמש µL 3 של ה-DNA גנומי PCR הגברה. לבצע PCR הקרנת שיבוטים שנבחרו באמצעות תחל חישול בתוך גן עמידות neomycin, subtelomere 15q. PCR-הגברה מתבצעת באמצעות אנזימים פולימראז רגיל ו- PCR פרוטוקולים21.
    הערה: תנאים PCR MS2 צבעי יסוד (פריימר MS2-subtel15q-פריימר-S ו- MS2 בתור), תחל CTR (CTR ראש S ו- CTR פריימר כמו) הן הבאות: 98 ° C עבור 20 s שלב דנטורציה, ואז 34 מחזורים ב 98 ° C 10 s, 58 מעלות 20 s, s ° 72 ג 15 , באמצעות האנזים פולימראז µL 25 תגובה לערבב (ראה טבלה של חומרים). פריימר רצפים מסומנים בטבלה1.
  3. להפעיל תגובות PCR agarose ג'ל ולחלץ להקות PCR המתקבלים שיבוטים חיובי באמצעות ג'ל רגיל מיצוי הליכים (ראו טבלה של חומרים ג'ל החילוץ ריאגנטים).
  4. לבצע ניתוח רצפי ה-DNA של המוצר PCR ג'ל, חילוץ לאישור נוכחות של רצפי MS221.
    הערה: רצף הבדיקות ניתן לבצע באמצעות תחל את המשמש ההקרנה PCR.
  5. תספיג דנ א ההקרנה של PCR חיובית שיבוטים
    1. לגדול השיבוטים חיובי ב- PCR והקרנה רצף מהצלחת המקורית 96 היטב (את הצלחת גיבוי) כדי 6 צלחות היטב במדיום F - 12K של חזיר (Kaighn), בתוספת 10% FBS, 2 מ מגלוטמין, פניצילין (0.5 יחידות לכל מיליליטר בינוני), סטרפטומיצין (0.2 µg לכל mL בינוני), המכיל neomycin-ריכוז של µg/mL 0.7-37 ° C 5% CO2.
      הערה: לחלופין, אם חלק שיבוטים אלה אבדו, להפשיר אותם באחד הלוחות קפוא (ראה פרוטוקול 2.6).
    2. ברגע השיבוטים נמצאים 90% זרימה בתוך הצלחת טוב 6, לשטוף את התאים עם PBS ולהוסיף µL 250 פירוק מאגר המכיל proteinase µg 0.5 K לכל טוב.
    3. לגרד את התאים באמצעות מגרד תא ולהעביר את lysate צינור 1.5 מ.
    4. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 16 שעות.
    5. להוסיף 1 מ"ל של 100% אתנול, לנער נמרצות, ולאפשר את ה-DNA לזרז לפחות 2 h או למשך הלילה ב-20 ° C.
      הערה: הפרוטוקול אפשר לעצור כאן.
    6. ספין-13,400 x ג'י ב- 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, למחוק את תגובת שיקוע, לשטוף את כדורי עם 70% אתנול. תנו לאוויר כדורי יבש בטמפרטורת החדר. לחלופין, השתמש concentrator ואקום.
    7. Resuspend את כדורי ה-DNA ב- 50 µL של מים מזוקקים המכילים RNAse A ואת תקופת דגירה של h 1-37 מעלות צלזיוס.
    8. לעכל µg 5-10 של ה-DNA גנומי באמצעות אנזימי הגבלה NcoI ו- BamHI (שני digestions עצמאית) בכרך התגובה µL 100 על ידי המקננת עיכול תגובות ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
    9. הרץ 4 µL של העיכול agarose ג'ל (0.8% agarose) לאישור עיכול מלאה.
    10. להוסיף 1/10 נפח של סודיום אצטט פתרון 3 מ' pH 5.2 ו- 2 כרכים של 100% אתנול לתגובות עיכול הגבלה, דגירה לפחות 2 h או למשך הלילה ב-20 ° C, כדי לזרז את הדנ א.
      הערה: הפרוטוקול אפשר לעצור כאן.
    11. צנטריפוגה ב g x 13,400 ב 4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות, למחוק את supernatants, לשטוף את כדורי עם 70% אתנול. לאפשר את כדורי מהאוויר יבש בטמפרטורת החדר. לחלופין, השתמש concentrator ואקום.
    12. Resuspend כדורי ב 20 µL של מים מזוקקים, לטעון את ה-DNA מתעכל על ג'ל agarose 0.8%.
      הערה: עבור רזולוציה טובה יותר של ה-DNA מעוכל, להכין ג'ל לפחות 15 ס"מ זמן ולרוץ בין לילה מתח נמוך (̴30 וולט). צריך להיות מותאם אלקטרופורזה הגדר.
    13. למחרת, מכתים את הג'ל עם סוכן labelling דנ א, כגון אתידיום ברומיד-ריכוז סופי 1 מ"ל µL/10, למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, להצטלם עם סרגל קרוב הג'ל על ג'ל הדמיה כלי נגינה.
    14. הגדר את ההעברה של ה-DNA קרום ניילון ולבצע ממברנה הכלאה גשש רצף ספציפי MS2 באמצעות הליכים סטנדרטיים21.
    15. הפשרת שיבוטים הם חיוביים ב- PCR, DNA רצף ובדרום חשופה מאחד שתי צלחות קפוא (ראה שלב הבא).
  6. הפשרתו של שיבוטים
    1. להכין אחד 15 מ"ל שפופרת המכילה 5 מ"ל F - 12 K של חזיר מראש ומחוממת בינוני (Kaighn) בתוספת 10% FBS, 2 מ מגלוטמין פניצילין (0.5 יחידות לכל מיליליטר בינוני), סטרפטומיצין (0.2 µg לכל מיליליטר בינוני) עבור כל המשובטים להיות הקרת.
    2. הסר באחד הלוחות מקפיא-80 ° ולהוסיף µL 100 F12K מראש ומחוממת בינוני מלא טוב המכיל השיבוט חיובי כדי להיות הקרת.
      הערה: הליך זה צריך להתבצע במהירות, הצלחת היטב 96 להניחה על קרח יבש לאחר כל המשובטים מופשר הוא, על מנת לאפשר שיבוטים אחרים להישאר קפואה. הדבר חשוב במיוחד אם מספר שיבוטים צריך להיות הקרת מ באותה צלחת טוב 96.
    3. העבר את התאים הצינור 15 מ"ל המכיל 5 מיליליטר בינונית, צנטריפוגה ב 800 x g עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר.
    4. האחות של המדיום, resuspend תאי µL 500 מראש ומחוממת בינוני F12K מלאה, להעביר כל המשובטים טוב יחיד של צלחת טוב 12.
  7. חיסול של הגן ההתנגדות neomycin מ בקלטת MS2 משולב ב subtelomere 15q.
    1. לאפשר שיבוטים לגדול מצלחת טוב 12 צלחת 10 ס מ בינוני F12K מלאה.
      הערה: Neomycin לא ייכללו בטווח הבינוני אלא אם צוין אחרת.
    2. להוסיף את הבעת-Cre אדנו התאים בתרבית בקערה 10 ס מ- 70% זרימה של 10 מ"ל של מדיום F12K מלאה.
      הערה: שימוש אדנו לביטוי של Cre-GFP תאפשר הערכה של היעילות של זיהום, אשר צריך לגשת 100%. אדנו שכפול תקינה יאבדו לאחר כמה קטעים בתרבות.
    3. 48 שעות לאחר ההדבקה, לפצל את התאים במנות 10 ס מ 3. שתי מנות ישמש עבור אימות של הסרת ג'ין neomycin לפי בחירה שלילי, גדל התאים המכילים neomycin בינוני (צלחת קודם), ולא על ידי הדרומי כתם (תבשיל השני).
    4. תרבות המנה השלישית המכיל שיבוט תא הקפאה, החילוץ-RNA.

3. אימות של טרה-MS2 ביטוי התעתיק לפי RT-qPCR

  1. עם האימות של הסרת ג'ין neomycin, מבצע החילוץ-RNA הכולל של טרה-MS2 שיבוטים שימוש בממסים אורגניים (פתרון פנול, guanidine isothiocynate)21.
    1. Resuspend את הרנ א מופק צלחת 10 ס מ ב- 100 µL diethyl pyrocarbonate (DEPC) מים.
    2. הרץ 3 µL של RNA denaturating (1% פורמלדהיד המכילות) 1 x 3-(N-Morpholino) propanesulfonic חומצה (MOPS) ג'ל על מנת לוודא ריכוז והתקינות של הרנ א. גם לנתח את ריכוז ה-RNA באמצעות ספקטרופוטומטרים.
    3. לטפל µg 3 של RNA עם DNAse אני משתמש 1 יחידה של DNAse אני האנזים בנפח 60 של התגובה האחרונה µL.
    4. דגירה התגובה עבור h 1-37 מעלות צלזיוס.
  2. הפוך ניתוחים התגובה ואת qPCR שעתוק
    1. הוספת הרכיבים הבאים צינור ללא נוקלאז microcentrifuge: µL 2 מיקרומטר 1 טרה פריימר ספציפי, µL 1 של dNTPs מיקס (10 מ מ כל אחד), µL 6 של RNA התייחסתי DNAse (תואם ל̴300ng RNA). לכוון את עוצמת הקול כדי µL 13 עם 4 µL DEPC מים.
      הערה: עבור כל RNA להיות מנותח, צינור השני המכיל את ריאגנטים אותו אבל פריימר ספציפי הפניה, במקום תחל ספציפי טרה, צריך להיות מוכן.
    2. מחממים את התערובת עד 65 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, דגירה קרח לפחות 1 דקות.
    3. לאסוף את התוכן של הצינורות על ידי צנטריפוגה קצר ולהוסיף 4 µL של 5 X RT האנזים מאגר, dithiothreitol 0.1 M 1 µL (DTT), µL 1 (4 יחידות) של מעכב RNAse ולאחר µL 1 של רוורס טרנסקריפטאז (ראה טבלה של חומרים).
    4. דגירה בדגימות ב 42 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות, ולאחר מכן להשתמש µL 2 התגובה RT עבור ניתוחים qPCR.
  3. להכין תערובת התגובה qPCR באמצעי אחסון הסופי של 20 µL המורכב µL 10 מיקס מאסטר 2 x qPCR, 2 µL של תבנית cDNA, µL 1 של פריימר לפנים (10 מיקרומטר), µL 1 של פריימר הפוכה (10 מיקרומטר), ו 6 µL של מים.
  4. ביצוע qPCR התגובה thermocycler באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים21.

4. הייצור של רטרווירוס לבטא MS2-GFP

  1. כדי להפיק הרטרווירוס לביטוי MS2-GFP, transfect 80% confluent פיניקס אריזה תאים עם חלבון פיוז'ן MS2-GFP לבטא הרטרווירוס וקטור (pBabe-MS2-GFP PURO) וג'ין env להביע וקטור (כגון pCMV-VSVG) באמצעות יחס טוחנת 4:1 של שני וקטורים.
  2. למחרת, החלף המדיום culturing (DMEM בתוספת 10% FBS, 2 מ מגלוטמין ו עט/דלקת) טרי בינוני המכיל 10 מ מ נתרן butyrate.
  3. תקופת דגירה של 8 שעות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2, ולאחר מכן להחליף את המדיום טרי בינוני culturing שממנו ייאספו הוירוס.
  4. לאחר 48 שעות, הסר המדיום המכיל הרטרווירוס התאים פיניקס. בינוני ניתן להשתמש ישירות על זיהום של טרה-MS2 שיבוטים, ובמקרה לסנן המדיום דרך מסנן מיקרומטר 0.45, להוסיף polybrene (30 ריכוז סופי µg/mL) ולהוסיף אותו התאים (במקרה זה הפרוטוקול ממשיך בשלב 5). לחלופין, הרטרו וירוס יכול להיות זירז בשפופרת בז 50 מ על-ידי הוספת 1/5ה נפח של 50% פג-8000/900 מ מ פתרון NaCl המקננת בן לילה ב 4 ° C על גלגל מסובב.
  5. למחרת, גלולה חלקיקים הרטרווירוס על ידי צנטריפוגה ב g x 2,000 למשך 30 דקות, הסר את תגובת שיקוע ולאחר resuspend בגדר F12K בינוני ללא סרום.
    הערה: יכול להיות resuspended חלקיקי וירוס ב- 1/100th של אמצעי האחסון supernatant המקורי. בדיקת זיהום יש לבצעו על מנת לוודא נפח מינימלי של רטרווירוס נדרשים ביעילות להדביק את התאים.

5. ויזואליזציה של טרה-MS2 תעתיקים בתאים חיים

  1. צלחת טרה-MS2 שיבוטים ותאים WT AGS במנות עם תחתית זכוכית. ביום של זיהום, להוסיף polybrene את המדיום (30 ריכוז סופי µg/mL) ולהבין את הרטרווירוס לביטוי MS2-GFP.
  2. לאחר 24 שעות, למחוק את המדיום המכיל וירוס ולהוסיף בינוני טריים ללא פנול אדום.
  3. לנתח את התאים במיקרוסקופ הפוך הגדרה זו מיקרוסקופ המתאים. תמונה של התאים עם 100 X או המטרה X 60 עם מפתח נומרי גדול (1.4 X), בעזרת מצלמה רגישה (EMCCD). השתמש מערכת בקרת איכות הסביבה כדי לשמור את הדוגמאות-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 במהלך דימות.

תוצאות

איור 1 מייצג סקירה כללית של האסטרטגיה ניסיוני. השלבים העיקריים של הפרוטוקול, ציר מעיד לדור של טרה-MS2 שיבוטים בתאים AGS מוצגים (איור 1א'). יום 1, בארות מרובים של צלחת טוב 6 הם transfected עם קלטת MS2, sgRNA/Cas9 לבטא וקטורים (המוצג באיור

Discussion

במאמר זה אנו מציגים שיטה לייצר שיבוטים תאים סרטניים אנושיים המכיל רצפי MS2 משולב בתוך subtelomere 15q. באמצעות שיבוטים אלה, מולקולות טרה מתויג MS2 עיבד מ subtelomere 15q מזוהים על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ על ידי ביטוי משותף של חלבון פיוז'ן MS2-GFP. גישה זו מאפשרת לחוקרים ללמוד את הדינמיקה של טרה הביע א?...

Disclosures

המחברים מצהירים אין אינטרסים כלכליים מתחרים

Acknowledgements

. אנחנו אסירי תודה על הסגל של המתקן הדמיה מתקדמות של CIBIO ב אוניברסיטה של טרנטו (trento), המתקן מיקרוסקופ אור BioOptics-מעבדות פרוץ פ מקס (MFPL) בווינה. המחקר שהוביל את התוצאות הללו קיבלה מימון מן Stiftung Mahlke-Obermann של תכנית המסגרת השביעית של האיחוד האירופי למחקר, פיתוח טכנולוגי, הפגנה תחת גרנט הסכם אין 609431 כדי לכלכלת EC נתמך על ידי מלגת ריטה לוי Montalcini איטלקית משרד החינוך ואוניברסיטת המחקר (MIUR).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
AGS cells--Gift from Christian Baron (Université de Montréal).
F12K Nut Mix 1XGIBCO21127022Culturing medium for AGS cells
L-Glutamine CORNINGMT25005CIComponent of cell culturing medium
Penicillin Streptomycin SolutionCORNING30-002-CIComponent of cell culturing medium
Fetal Bovine SerumSigma AldrichF2442Component of cell culturing medium
DMEM 1XGIBCO21068028culturing medium for phoenix cell
CaCl2Sigma AldrichC1016used in phoenix cell transfection
HEPESSigma AldrichH3375used in phoenix cell transfection (HBS solution)
KClSigma AldrichP9333used in phoenix cell transfection (HBS solution)
DextroseSigma AldrichD9434used in phoenix cell transfection (HBS solution)
NaClSigma AldrichS7653used in phoenix cell transfection (HBS solution) and retrovirus precipitation
Na2HPO4Sigma AldrichS3264used in phoenix cell transfection (HBS solution)
TRYPSIN EDTA SOLUTION 1XCORNING59430Cused in cell split
DPBS 1XGIBCO14190250Dulbecco's Phosphate Buffered Saline
DMSOSigma AldrichD8418Component of cell freezing medium (80% FBB and 20% DMSO)
G-418 DisulphateFormediumG4185selection drug for 
Gelatin solution BioreagentSigma AldrichG1393cotaing of 96 well DNA plate and freezing plate
Tris-baseFisher BioReagents10376743Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction
EDTASigma AldrichE6758Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction
SDSSigma Aldrich71729Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction
Proteinase KThermo FisherAM2546Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction
RNAse AThermo Fisher12091021RNA degradation during DNA extraction
AgaroseSigma AldrichA5304DNA gel preparation
Atlas ClearSightBioatlasBH40501Stain reagent used for detecting DNA and RNA samples in agarose gel
ethanolFisher BioReagentsBP28184DNA precipitation
Sodium Acetate Sigma Aldrich71196Used for DNA precipitation at a 3M concentration pH5.2
Wizard SV Gel and PCR clean-Up systemPromegaA9282Extraction of PCR fragments from agarose gel during PCR screening of neomycin positive clones
TrizolAMBION15596018Organic solvent used for RNA extraction
Dnase ITHERMO SCIENTIFIC89836degradation of genomic DNA from RNA 
dNTPs mixInvitrogen10297018used in RT and PCR reactions
DTTInvitrogen707265MLused in RT reactions
diethyl pyrocarbonateSigma AldrichD5758used to inactivate RNAses in water (1:1000 dilution)
RibolockThermo FisherEO0381RNase inhibitor
MOPSSigma AldrichM9381preparation of RNA gel
ParaformaldehydeElectron Microscopy Sciences15710preparation of denaturating RNA gel (1% PFA in 1x MOPS)
Superscript III Reverse transcriptaseInvitrogen18080-093Retrotranscription reaction
Pfu DNA polymerase (recombinant)Thermo ScientificEP0501PCR reaction
2X qPCRBIO SyGreen Mix Separate-ROXPCR BIOSYSTEMSPB 20.14qPCR reaction
Cre-GFP adenovirushttps://medicine.uiowa.edu/vectorcore1174-HTused to infect TERRA-MS2 clones in order to remove the neomycn gene
Sodium ButyrateSigma AldrichB5887used to promote retrovirus particles production in phoenix cells
PEG8000Sigma Aldrich89510Precipitation of retrovirus partcles
35µ-Dish Glass BottomIbidi81158used in live cell imaging analyses of TERRA-MS2 clones

References

  1. Azzalin, C. M., Reichenbach, P., Khoriauli, L., Giulotto, E., Lingner, J. Telomeric repeat containing RNA and RNA surveillance factors at mammalian chromosome ends. Science. 318 (5851), 798-801 (2007).
  2. Schoeftner, S., Blasco, M. A. Developmentally regulated transcription of mammalian telomeres by DNA-dependent RNA polymerase II. Nature Cell Biology. 10 (2), 228-236 (2008).
  3. Diman, A., Decottignies, A. Genomic origin and nuclear localization of TERRA telomeric repeat-containing RNA: from Darkness to Dawn. FEBS Journal. , (2017).
  4. Arnoult, N., Van Beneden, A., Decottignies, A. Telomere length regulates TERRA levels through increased trimethylation of telomeric H3K9 and HP1alpha. Nature Structural & Molecular Biology. 19 (9), 948-956 (2012).
  5. Montero, J. J., et al. TERRA recruitment of polycomb to telomeres is essential for histone trymethylation marks at telomeric heterochromatin. Nature Communications. 9 (1), 1548 (2018).
  6. Beishline, K., et al. CTCF driven TERRA transcription facilitates completion of telomere DNA replication. Nature Communications. 8 (1), 2114 (2017).
  7. Arora, R., et al. RNaseH1 regulates TERRA-telomeric DNA hybrids and telomere maintenance in ALT tumour cells. Nature Communications. 5, 5220 (2014).
  8. Balk, B., et al. Telomeric RNA-DNA hybrids affect telomere-length dynamics and senescence. Nature Structural & Molecular Biology. 20 (10), 1199-1205 (2013).
  9. Graf, M., et al. Telomere Length Determines TERRA and R-Loop Regulation through the Cell Cycle. Cell. 170 (1), 72-85 (2017).
  10. Lee, Y. W., Arora, R., Wischnewski, H., Azzalin, C. M. TRF1 participates in chromosome end protection by averting TRF2-dependent telomeric R loops. Nature Structural & Molecular Biology. , (2018).
  11. Moravec, M., et al. TERRA promotes telomerase-mediated telomere elongation in Schizosaccharomyces pombe. EMBO Reports. 17 (7), 999-1012 (2016).
  12. Cusanelli, E., Romero, C. A., Chartrand, P. Telomeric noncoding RNA TERRA is induced by telomere shortening to nucleate telomerase molecules at short telomeres. Molecular Cell. 51 (6), 780-791 (2013).
  13. Moradi-Fard, S., et al. Smc5/6 Is a Telomere-Associated Complex that Regulates Sir4 Binding and TPE. PLoS Genetics. 12 (8), e1006268 (2016).
  14. Chu, H. P., et al. TERRA RNA Antagonizes ATRX and Protects Telomeres. Cell. 170 (1), 86-101 (2017).
  15. Lai, L. T., Lee, P. J., Zhang, L. F. Immunofluorescence protects RNA signals in simultaneous RNA-DNA FISH. Experimental Cell Research. 319 (3), 46-55 (2013).
  16. Zhang, L. F., et al. Telomeric RNAs mark sex chromosomes in stem cells. Genetics. 182 (3), 685-698 (2009).
  17. Gallardo, F., Chartrand, P. Visualizing mRNAs in fixed and living yeast cells. Methods in Molecular Biology. 714, 203-219 (2011).
  18. Querido, E., Chartrand, P. Using fluorescent proteins to study mRNA trafficking in living cells. Methods in Cell Biology. 85, 273-292 (2008).
  19. Cusanelli, E., Chartrand, P. Telomeric noncoding RNA: telomeric repeat-containing RNA in telomere biology. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 5 (3), 407-419 (2014).
  20. Perez-Romero, C. A., Lalonde, M., Chartrand, P., Cusanelli, E. Induction and relocalization of telomeric repeat-containing RNAs during diauxic shift in budding yeast. Current Genetics. , (2018).
  21. Avogaro, L., et al. Live-cell imaging reveals the dynamics and function of single-telomere TERRA molecules in cancer cells. RNA Biology. , 1-10 (2018).
  22. Ran, F. A., et al. Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity. Cell. 154 (6), 1380-1389 (2013).
  23. Yamada, T., et al. Spatiotemporal analysis with a genetically encoded fluorescent RNA probe reveals TERRA function around telomeres. Scientific Reports. 6, 38910 (2016).
  24. Deng, Z., et al. Formation of telomeric repeat-containing RNA (TERRA) foci in highly proliferating mouse cerebellar neuronal progenitors and medulloblastoma. Journal of Cell Science. 125 (Pt 18), 4383-4394 (2012).
  25. Casini, A., et al. A highly specific SpCas9 variant is identified by in vivo screening in yeast. Nature Biotechnology. 36 (3), 265-271 (2018).
  26. Nergadze, S. G., et al. CpG-island promoters drive transcription of human telomeres. RNA. 15 (12), 2186-2194 (2009).
  27. Porro, A., et al. Functional characterization of the TERRA transcriptome at damaged telomeres. Nature Communications. 5, 5379 (2014).
  28. Farnung, B. O., Brun, C. M., Arora, R., Lorenzi, L. E., Azzalin, C. M. Telomerase efficiently elongates highly transcribing telomeres in human cancer cells. PLoS One. 7 (4), e35714 (2012).
  29. Flynn, R. L., et al. Alternative lengthening of telomeres renders cancer cells hypersensitive to ATR inhibitors. Science. 347 (6219), 273-277 (2015).
  30. Scheibe, M., et al. Quantitative interaction screen of telomeric repeat-containing RNA reveals novel TERRA regulators. Genome Research. 23 (12), 2149-2157 (2013).
  31. Bolland, D. J., King, M. R., Reik, W., Corcoran, A. E., Krueger, C. Robust 3D DNA FISH using directly labeled probes. Journal of Visualized Experiments. (78), (2013).
  32. Masui, O., et al. Live-cell chromosome dynamics and outcome of X chromosome pairing events during ES cell differentiation. Cell. 145 (3), 447-458 (2011).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

143noncoding RNACRISPR Cas9MS2 GFP

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved