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摘要

在这里, 我们提出了一个协议, 以生成包含 ms2 序列标记在单个亚端粒的癌细胞克隆。这种方法, 依靠 ms2-gfp 系统, 实现了端粒重复 rna (terra) 的内源性转录记录的可视化表达从一个端粒表达在活细胞中。

摘要

端粒被转录, 导致端粒重复编码 rna (terra), 这已被建议在端粒生物学中发挥重要作用, 包括异染色质的形成和端粒长度的稳态。最近的发现表明, terra 分子也与内部染色体区域相互作用, 以调节小鼠胚胎干细胞 (es) 细胞的基因表达。根据这一证据, rna 荧光原位杂交 (rnaa-fish) 分析表明, 只有一部分 terra 转录记录定位在染色体末端。更好地了解 terra 分子的动力学将有助于确定其功能和作用机制。在这里, 我们描述了一种方法, 标签和可视化单端粒 terra 转录在癌细胞使用 ms2-gfp 系统。为此, 我们提出了一个协议, 以产生稳定的克隆, 使用 ags 人类胃癌细胞系, 包含 ms2 序列集成在一个单一的亚端粒。从 ms2 标记的端粒中转录 terra 的结果是 ms2 标记的 terra 分子的表达, 这些分子在 ms2 rna 结合蛋白融合蛋白与 gfp (ms2-gfp) 共表达后, 通过活细胞荧光显微镜进行了可视化。这种方法使研究人员能够研究癌细胞中单端粒 terra 分子的动力学, 并可应用于其他细胞系。

引言

长非编码 rna terra 从染色体的亚端粒区域转录, 其转录向染色体末端进行, 在端粒重复道1,2内终止。因此, terra 记录由 5 ' 端的亚端粒衍生序列组成, 并以端粒重复终止 (脊椎动物中的 uuaggg)3。提出了 terra 的重要作用, 包括端粒4、5、dna 复制 6的异染色质形成, 促进染色体末端 7,8 的同源重组,9、调节端粒结构10和端粒长度稳态2,11,12,13。此外, terra 转录与许多体外位点相互作用, 以调节小鼠胚胎干细胞 (es) 中广泛的基因表达。根据这些证据, rna荧光原位杂交 (rna-fish) 分析表明, 只有一部分 terra 转录记录定位端粒1,2,15。此外, 据报道, terra 在小鼠细胞2,16的 x 和 y 染色体处形成核聚集物。这些发现表明, terra 记录在细胞核内经历了复杂的动态。了解 terra 分子的动力学将有助于确定其功能和作用机制。

ms2-gfp 系统已被广泛用于可视化来自不同生物体的活细胞中的 rna 分子 17,18.该系统以前曾被用来标记和可视化单端粒 terra 分子在酿酒师12,19。利用该系统, 最近显示酵母 terra 转录转录位在细胞质内的后二氧化转变阶段, 这表明 terra 可能会发挥核外功能20。我们最近使用 ms2-gfp 系统研究癌细胞21中的单端粒 terra 转录.为此, 我们使用 crispr/cas9 基因组编辑工具将 ms2 序列集成在单个端粒 (端粒 15q, 以下为 telq 15q) 上, 并获得了表示 ms2 标记内生 t15q terra (terra-ms2 克隆) 的克隆。gfp 熔融 ms2 rna 结合蛋白 (ms2-gfp) 的共表达, 可识别并结合 ms2 rna 序列, 从而实现活细胞21中单端粒 terra 转录的可视化.本文所述协议的目的是详细描述生成 terra-ms2 克隆所需的步骤。

为了生成 terra-ms2 克隆, ms2 盒被集成在端粒15q 的亚端粒区域内, 位于 terra 启动子区域和转录起始位点的下游。ms2 盒式磁带含有由 lox-p 位点两侧的新霉素耐药基因, 其在近端粒15q 上的整合是使用 crispr/cas9 系统22进行的。经转染 ms2 盒后, 选择单克隆, 用 pcr、dna 测序和南方印迹验证盒的亚端粒积分。阳性克隆感染了表达 crec 的腺病毒, 以便删除盒式磁带中的选择标记, 只在近端粒15q 留下一个 ms2 序列和一个 lox-p 位点。通过 rt-qpcr 验证了 tel15q 中 ms2 标记的 terra 转录的表达。最后, ms2-gfp 融合蛋白通过逆转录病毒感染在 terra-ms2 克隆中表达, 以便用荧光显微镜显示 ms2-terra 转录。使用端粒重复特异性探针 1、2、15、23可通过 rna-fish 和活细胞成像快速检测 terra 记录。这些方法提供了关于 terra 分子在单个细胞分辨率下的总种群定位的重要信息。在单个亚端粒生成含有 ms2 序列的克隆, 将使研究人员能够研究活细胞中单端粒 terra 转录的动力学, 这将有助于确定 terra 的功能和作用机制。

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研究方案

(一)新霉素耐药克隆的选择

  1. 在哈姆赫-12k (kaighn) 培养基中生长 ags 细胞, 辅以10% 的胎儿牛血清 (fbs)、2 mm l-谷氨酰胺、青霉素 (培养基每毫升0.5 单位) 和链霉素 (每毫升介质 0.2μg) 和 5% co2.将细胞与 sgrnams9 表达载体和 ms2 盒式磁带以50-60 的融合方式转染, 以1:10 摩尔比21。
    注: 在并行实验中, 通过转染 transfection 表达向量 (即cas9-gfp 矢量) 来验证转染效率。应达到至少60-70% 的转染效率。
  2. 第二天, 以含有新霉素的培养基 (选择性培养基) 取代培养培养基。
    注: 在转染后的第二天, 将细胞拆分并在选择性培养基中播种, 将加快选择过程。所有未转染的细胞将立即死亡。如果转染在6个井板中进行, 在这种情况下, 60% 汇流处的每口井都含有大约 0.7 x10 6 个细胞, 第二天就可以将细胞从一口井分成10厘米的含有选择性介质的盘子。
  3. 将细胞保持在选择性培养基中 7-10, 每一两天改变介质, 直到单个克隆可见。
  4. 细胞克隆的拾取
    1. 准备一个96孔板, 每口井中含有 10μl 0.25% 的胰蛋白酶。
      注: 准备两个96孔板, 以防超过96个克隆, 预计将被挑选。
    2. 使用显微镜, 用标记在盘子底部做一个点, 标记每个在 1 0 厘米长的盘子中可见的克隆位置。每个点将对应于要选取的群体。
    3. 用足够的磷酸盐缓冲盐水 (pbs) 取代培养培养基, 在克隆体上形成一层薄薄的液体膜, 而不是让细胞在克隆采摘过程中干燥。
    4. 使用10μl 移液器选择单个菌落。将含有5μl 胰蛋白酶的尖端连接到菌落, 并慢慢释放将保留在菌落上的胰蛋白酶。允许胰蛋白酶分离细胞 1分钟, 然后用尖端刮伤菌落并将其吸进尖端。
      注: 在此过程中, 翻转菜的一侧, 以减少 pbs 的体积周围被挑选将有助于采摘过程中, 避免稀释周围的菌落周围的胰蛋白酶。使用克隆环也可以帮助拾取单个克隆。
    5. 将菌落中的细胞放入含有 10μl 0.25% 胰蛋白酶的96井板的井中。
    6. 在室温下孵化 5分钟, 然后用150μl 的选择性培养基 (ham 的 f-12k (kaighn) 培养基补充10% 的 fbs、2 mm l-谷氨酰胺、青霉素 (培养基0.5 单位)、链霉素 (每毫升介质0.2 微克), 并含有新霉素, 并含有新霉素, 在浓度为0.7μgml。
      注: 在孵化期间, 可以选择其他克隆。建议选择尽可能多的克隆。选择的克隆越多, 识别阳性克隆的可能性就越大。
    7. 一旦所有克隆被采摘并转移到96井板中, 允许细胞在选择性培养基火腿的 f-12k (kaighn) 介质中生长几天, 辅以10% 的 fbs、2 mm l-谷氨酰胺、青霉素 (每 mM 0.5 单位, 培养基)、链霉素 (0.2 微克/毫升在37°c 和 5% co2 浓度为0.7μgml 时含有新霉素, 直至达到90% 的汇合点。
  5. 克隆的拆分
    1. 每口井加入100μl 明胶, 制备三个96孔板涂上明胶, 在室温下孵育 30分钟, 然后用 pbs 清洗两次。这些板将用于 dna 提取 (dna 板) 和克隆冷冻 (冷冻板)。
      注: 明胶将促进细胞和 dna 与油井的附着。特别是, 明胶涂层将允许 dna 粘在井底的 dna 提取和洗涤过程 (讨论如下)。在拆分过程中, 建议使用多通道移液器。
    2. 一旦克隆达到90% 的融合, 从96孔板的每一口抽吸培养基, 用 pbs 清洗, 每口井加入 30μl 0.25% 的胰蛋白酶, 并在37°c 孵育5分钟。
      注: 克隆将以不同的速度增长, 这也将取决于每个克隆选择的细胞数量。因此, 这一步将在不同克隆达到90% 融合的几天内执行。
    3. 每口井加入70μl 的选择性培养基, 通过在井内上下移液来破坏细胞团块, 然后将100μl 的30μl 转移到涂布的 dna 板上, 上面装满120μl 的选择性培养基, 将30μl 转移到每口井的糊化冷冻板上h 50μl 介质 (无选择)。
    4. 将 dna 板放入孵化器中, 使细胞在37°c 和 5% co2 下生长, 直到 90%的融合。
    5. 在冻结板的每口井中加入80μl 的冰凉新鲜冷冻介质 (80% fbs 和20% 二甲基亚硫酸 (dmso)), 在板材顶部加入副底 (喷上70% 乙醇), 以便将每个井封好, 将盖子盖在上面, 并用铝箔包裹板材。 将冻结板放置在-80°c。
    6. 在原96井板上加入90μl 选择性培养基, 其中含有已被分裂的克隆体, 并将其保存在培养中, 直至 pcr 筛选结果。这个板块将被用作备用板。

2. 新霉素耐药克隆的筛选

  1. 从96口井 dna 板中提取 dna
    1. 一旦在 dna 板中培养的克隆体达到90% 的融合度, 用 pbs 清洗 2次, 然后用50μl 裂解缓冲液裂解2次 (10 mm tris ph 7.5, 10 mm edta, 10 mm 氯化萘, 0.5% sds 和 1 mgml 蛋白酶 k) 裂解。用护栏覆盖板, 密封每口井, 盖上盖子, 用沙兰包裹盖上盖子, 并在37°c 放置一夜。
    2. 在每口井中加入100μl 冷乙醇 (et-oh)/氯化钠溶液 (100% 乙醇中的 0.75 m 氯化碳), 并在室温下沉淀6小时或过夜。
      注: 协议可以在此处暂停。
    3. 通过倒置板, 去除 et-oh/ncl 溶液, 用每口700% 乙醇200μl 清洗3次。
    4. 在蒸馏水中加入 25μl rnse a 溶液, 在37°c 孵育1小时。
  2. 使用3μl 的基因组 dna 进行 pcr 扩增。利用新霉素耐药基因和近端粒15q 内的引物退火对选定的克隆进行 pcr 筛选。pcr 扩增是使用标准聚合酶和 pcr 协议21进行的。
    注: ms2 引物 (ms2-近15q 引物和 ms2 引物 as) 和 ctr 引物 (ctr 素数 s 和 ctr 引物 as) 的 pcr 条件如下: 98°c 为变性步骤 20秒, 然后在 98°c 10秒时进行34个循环, 58°C 20秒, 72°c 15 s, 在25μl 反应混合物中使用聚合酶酶 (见材料表)。引物序列如表 1所示。
  3. 在琼脂糖凝胶上运行 pcr 反应, 并使用标准凝胶提取程序提取从阳性克隆中获得的 pcr 带 (见凝胶提取试剂材料表)。
  4. 对凝胶提取的 pcr 产物进行 dna 测序分析, 以确认 ms2 序列21的存在。
    注: 测序分析可以使用用于 pcr 筛选的引物进行。
  5. pcr 阳性克隆的南方印迹筛选
    1. 在 pcr 和测序筛选中, 从原来的96孔板 (备用板) 增长到 ham f-12k (kaighn ' s) 培养基中的6个井板, 辅以10% 的 fbs、2 mm l-谷氨酰胺、青霉素 (培养基为0.5 单位)、链霉素 (0.2 微克/小时)培养基中的 ml), 并在 37°c 5% co 2 的浓度为0.7μgml 时含有新霉素.
      注: 或者, 如果其中一些克隆丢失, 则从其中一个冻结板上解冻 (见议定书 2.6)。
    2. 一旦克隆在6井板中的90% 汇流处, 用 pbs 清洗细胞, 并添加250微米的裂解缓冲液, 每口井含有0.5 微克蛋白酶 k。
    3. 使用细胞刮刀刮除细胞, 并将裂解液转移到 1.5 ml 管中。
    4. 在37°c 下孵化16小时。
    5. 加入1毫升的100% 乙醇, 用力摇晃, 并让 dna 在-20°c 下沉淀至少2小时或夜间。
      注: 协议可以在此处暂停。
    6. 在4°c 下以 13 400 x g 的速度旋转 10分钟, 丢弃上清液, 用70% 乙醇清洗颗粒。让颗粒在室温下干燥。或者, 使用真空集中器。
    7. 将 dna 颗粒在含有 rnse a 的50μl 蒸馏水中再循环, 在37°c 下孵育1小时。
    8. 在100μl 反应体积内使用 ncoi 和 bamhi 限制性酶 (两个独立消化酶), 在37°c 的情况下通过在37°c 的消化反应中进行5-10 微克的基因组 dna。
    9. 在琼脂糖凝胶 (0.8% 琼脂糖) 上运行4μl 的消化, 以进行完全消化确认。
    10. 在限制性消化反应中加入半体积的醋酸钠3m 溶液 ph 5.2 和2体积100% 乙醇, 并在-20°C 孵育至少2小时或一夜以沉淀 dna。
      注: 协议可以在此处暂停。
    11. 在4°c 条件下以 13 400 x 克离心 20分钟, 丢弃上清液, 并用70% 乙醇清洗颗粒。让颗粒在室温下风干。或者, 使用真空集中器。
    12. 在20μl 的蒸馏水中重新获得颗粒, 并将消化后的 dna 加载到0.8% 的琼脂糖凝胶上。
      注: 为了更好地解决消化 dna 的分辨率, 请制备长度至少为15厘米的凝胶, 并在低电压 (̴30伏) 下连夜运行。建立的电泳应进行优化。
    13. 第二天, 用 dna 标记剂 (如 1μl/10 ml 最终浓度下的溴化乙酯) 染色凝胶 30分钟, 并在室温下用靠近凝胶的标尺拍摄照片。
    14. 设置 dna 转移到尼龙膜, 并使用标准程序21与 ms2 序列特异性探针进行膜杂交。
    15. 从两个冷冻板中的一个中解冻 pcr、dna 测序和南方印迹呈阳性的克隆体 (见下一步)。
  6. 克隆体的解冻
    1. 准备一个含有5毫升预热火腿 f-12k (kaighn) 介质的 15 ml 管, 辅以10% 的 fbs、2 mL l-谷氨酰胺、青霉素 (每毫升0.5个单位) 和链霉素 (每毫升介质 0.2μg), 使每个克隆人都能解冻。
    2. 从-80°取出其中一个冷冻板, 并在含有正克隆的井中加入100μl 的预热 f12k 完整介质。
      注: 此过程应快速执行, 96 井板应放置在干冰上, 每次克隆解冻后, 以允许其他克隆保持冻结。如果需要从同一个96孔板上解冻多个克隆, 这一点尤其重要。
    3. 将细胞转移到含有5毫升介质的15毫升管, 并在室温下以 800 x g 的速度将离心机转移5分钟。
    4. 吸吸培养基, 在预热前的 f12k 介质500μl 中重新悬浮细胞, 并将每个克隆转移到12孔板的一口井中。
  7. 从亚端粒15q 整合的 ms2 盒中消除新霉素耐药基因。
    1. 允许克隆从一个12井盘成长为一个10厘米的盘子在完整的 f12k 介质。
      注: 除非另有说明, 否则不应将新霉素列入培养基。
    2. 将表达 cres 的腺病毒添加到10厘米的培养物中, 在70% 的融合中, 在10毫升的完整 f12k 培养基中培养。
      注: 使用 cr-gfp 表示腺病毒将允许评估感染的效率, 这应该接近100%。复制缺陷腺病毒将在培养中的几个通道后丢失。
    3. 感染48小时后, 将细胞分成3个10厘米的盘子。两个菜将用于验证新霉素基因去除的负选择, 生长细胞中的新霉素含有培养基 (第一盘), 并由南方印迹 (第二盘)。
    4. 培养含有克隆的第三道菜, 用于细胞冷冻和 rna 提取。

3. rt-qpcr 验证 terra-ms2 成绩单的表达

  1. 在确认新霉素基因去除后, 使用有机溶剂 (苯酚和鸟嘌呤异硫氰酸溶液)从terra-ms2 克隆中提取总 rna 21。
    1. 在100μl 的碳酸二乙酯 (depc) 水中, 将从10厘米的盘中提取的 rna 重新利用。
    2. 在变性 (含有1% 甲醛) 1x 3-(n-morpholino) 丙磺酸 (mops) 凝胶上运行 3μl rna, 以验证 rna 的浓度和完整性。也使用分光光度计分析 rna 浓度。
    3. 用10μl 最终反应体积中的 1个 dnse i 酶单位, 用 dnasse i 治疗 3μg rna。
    4. 在37°c 下将反应培养1小时。
  2. 逆转录酶和 qpcr 分析
    1. 在无核酸酶微离心管中加入以下成分: 1μm terra 特异性引物的2μl、1μl 的 dntp 混合 (每个 10 mm)、6μl 的 dNTPs i 处理 rna (对应̴300ng rna)。使用4μl 的 depc 水将体积调整为13μl。
      注: 对于要分析的每个 rna, 应准备一个包含相同试剂但具有参考的特定引物的第二管, 而不是 terra 特定引物。
    2. 将混合物加热至 65°c 5分钟, 在冰中孵育至少1分钟。
    3. 通过短暂离心收集管的含量, 并添加4μl 的 5x rt 酶缓冲液、1μl 0.1 m 二硫醇 (dtt)、1μl (4 单位) 的 rnse 抑制剂和1μl 的逆转录酶 (见《材料表》)。
    4. 将样品在42°c 下培养 60分钟, 然后使用2μl 的 rt 反应进行 qpcr 分析。
  3. 在20μl 的最终体积内制备 qpcr 反应混合物, 包括10μl 的 2x qpcr 主混合物、2μl 的 cdna 模板、1μl 的正向底漆 (10μm)、1μl 的反向底漆 (10μm) 和6μl 的水。
  4. 使用标准协议21在热环素中进行 qpcr 反应。

4. 生产表达逆转录酶病毒的 ms2-gfp

  1. 要产生 ms2-gfp 表达逆转录酶病毒, 用 ms2-gfp 融合蛋白 (pbbe-ms2-gfp pBabe-) 和使用摩尔比4:1 的env基因表达载体 (如 pcmv-vvvvg) 转染80% 的融合凤凰包装细胞。两个向量。
  2. 第二天, 将培养基 (dmem 补充 10% fbs、2mm l-谷氨酰胺和 penn-strep) 替换为含有10mm 丁酸钠的新鲜培养基。
  3. 在37°c 下培养 8小时, 5% 二氧化碳,然后用新鲜的培养基取代培养基, 从其中收集病毒。
  4. 48小时后, 从凤凰细胞中取出含有逆转录病毒的培养基。这种介质可直接用于感染 terra-ms2 克隆, 在这种情况下, 通过0.45μm 过滤器过滤培养基, 添加聚乙烯 (30μgl 最终浓度) 并将其添加到细胞中 (在这种情况下, 协议将在步骤5中继续进行)。或者, 可以在50毫升猎鹰管中沉淀逆转录酶病毒, 加入 50% peg-8000/900 mm ncl 溶液, 并在4°c 的旋转轮上孵育.
  5. 第二天, 通过离心在 2, 000 x 克的情况下离心, 30分钟内的颗粒逆转录病毒颗粒, 去除上清液, 并在没有血清的 f12k 培养基中重新悬浮颗粒。
    注: 病毒颗粒可以在原始上清液体积的百分之一重新悬浮。应进行感染测试, 以验证有效感染细胞所需的逆转录酶病毒的最小体积。

5. 活细胞中 terra-ms2 转录的可视化

  1. 玻璃底盘中的板 terra-ms2 克隆和 wt ags 细胞。在感染当天, 在培养基 (30μgml 最终浓度) 和表达逆转录酶病毒的 ms2-gfp 中加入聚乙烯。
  2. 24小时后, 丢弃含病毒培养基, 加入不含酚红色的新鲜培养基。
  3. 使用适当的显微镜设置在倒置显微镜下分析细胞。用 100 x 或60x 目标将细胞与大的数值孔径 (1.4 x) 和敏感相机 (emccd) 进行成像。在成像过程中, 使用环境控制系统将样品保持在37°c 和5% 二氧化碳.

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结果

图 11表示实验策略的概述。该协议的主要步骤和在 ags 单元中生成 terra-ms2 克隆的指示性时间表如下图所示 (图 1a)。在第1天, 用 ms2 盒式磁带和 sgrna/cas9 表示向量转染6孔的多个井 (如图 1b 所示)。在 cas9 nickase 表示 px335 载体中克隆了两个不同的近端粒15q 特异性引导 rna 序列,...

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讨论

在本文中, 我们提出了一种方法来生成人类癌症细胞克隆包含 ms2 序列集成在亚端粒15q。利用这些克隆体, 用荧光显微镜通过 ms2-gfp 融合蛋白的共表达检测从近端粒15q 转录的 ms2 标记的 terra 分子。这种方法使研究人员能够研究在活细胞21中的单个端粒表达的 terra 的动力学。在该协议中, 在 ags 细胞系中选择 terra-ms2 克隆, 这代表了一个有趣的模型系统来研究 terra, 因为 terra 表达在人?...

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披露声明

提交人声明没有相互竞争的经济利益

致谢

我们感谢特伦托大学 ciboi 先进成像设施的工作人员和维也纳 max f. perutz 实验室 (mfpl) 的生物光学光学显微镜设施的工作人员。导致这些成果的研究得到了 Mahlke-Obermann 基金会和欧洲联盟根据609431欧盟赠款协议进行的第七个研究、技术开发和示范框架方案的资助。欧共体得到意大利教育大学和研究部 (miur) 的 rita levi montalcini 研究金的支持。

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材料

NameCompanyCatalog NumberComments
AGS cells--Gift from Christian Baron (Université de Montréal).
F12K Nut Mix 1XGIBCO21127022Culturing medium for AGS cells
L-Glutamine CORNINGMT25005CIComponent of cell culturing medium
Penicillin Streptomycin SolutionCORNING30-002-CIComponent of cell culturing medium
Fetal Bovine SerumSigma AldrichF2442Component of cell culturing medium
DMEM 1XGIBCO21068028culturing medium for phoenix cell
CaCl2Sigma AldrichC1016used in phoenix cell transfection
HEPESSigma AldrichH3375used in phoenix cell transfection (HBS solution)
KClSigma AldrichP9333used in phoenix cell transfection (HBS solution)
DextroseSigma AldrichD9434used in phoenix cell transfection (HBS solution)
NaClSigma AldrichS7653used in phoenix cell transfection (HBS solution) and retrovirus precipitation
Na2HPO4Sigma AldrichS3264used in phoenix cell transfection (HBS solution)
TRYPSIN EDTA SOLUTION 1XCORNING59430Cused in cell split
DPBS 1XGIBCO14190250Dulbecco's Phosphate Buffered Saline
DMSOSigma AldrichD8418Component of cell freezing medium (80% FBB and 20% DMSO)
G-418 DisulphateFormediumG4185selection drug for 
Gelatin solution BioreagentSigma AldrichG1393cotaing of 96 well DNA plate and freezing plate
Tris-baseFisher BioReagents10376743Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction
EDTASigma AldrichE6758Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction
SDSSigma Aldrich71729Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction
Proteinase KThermo FisherAM2546Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction
RNAse AThermo Fisher12091021RNA degradation during DNA extraction
AgaroseSigma AldrichA5304DNA gel preparation
Atlas ClearSightBioatlasBH40501Stain reagent used for detecting DNA and RNA samples in agarose gel
ethanolFisher BioReagentsBP28184DNA precipitation
Sodium Acetate Sigma Aldrich71196Used for DNA precipitation at a 3M concentration pH5.2
Wizard SV Gel and PCR clean-Up systemPromegaA9282Extraction of PCR fragments from agarose gel during PCR screening of neomycin positive clones
TrizolAMBION15596018Organic solvent used for RNA extraction
Dnase ITHERMO SCIENTIFIC89836degradation of genomic DNA from RNA 
dNTPs mixInvitrogen10297018used in RT and PCR reactions
DTTInvitrogen707265MLused in RT reactions
diethyl pyrocarbonateSigma AldrichD5758used to inactivate RNAses in water (1:1000 dilution)
RibolockThermo FisherEO0381RNase inhibitor
MOPSSigma AldrichM9381preparation of RNA gel
ParaformaldehydeElectron Microscopy Sciences15710preparation of denaturating RNA gel (1% PFA in 1x MOPS)
Superscript III Reverse transcriptaseInvitrogen18080-093Retrotranscription reaction
Pfu DNA polymerase (recombinant)Thermo ScientificEP0501PCR reaction
2X qPCRBIO SyGreen Mix Separate-ROXPCR BIOSYSTEMSPB 20.14qPCR reaction
Cre-GFP adenovirushttps://medicine.uiowa.edu/vectorcore1174-HTused to infect TERRA-MS2 clones in order to remove the neomycn gene
Sodium ButyrateSigma AldrichB5887used to promote retrovirus particles production in phoenix cells
PEG8000Sigma Aldrich89510Precipitation of retrovirus partcles
35µ-Dish Glass BottomIbidi81158used in live cell imaging analyses of TERRA-MS2 clones

参考文献

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  3. Diman, A., Decottignies, A. Genomic origin and nuclear localization of TERRA telomeric repeat-containing RNA: from Darkness to Dawn. FEBS Journal. , (2017).
  4. Arnoult, N., Van Beneden, A., Decottignies, A. Telomere length regulates TERRA levels through increased trimethylation of telomeric H3K9 and HP1alpha. Nature Structural & Molecular Biology. 19 (9), 948-956 (2012).
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