Generation von Krebs Zellklonen Telomeric Repeat-haltigen RNA TERRA von einem einzigen Telomere in lebenden Zellen ausgedrückt zu visualisieren

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um Krebs Zellklonen mit einem MS2 Sequenz Beschriftung auf einer einzigen Produktlinie zu generieren. Dieser Ansatz, unter Berufung auf das MS2-GFP-System ermöglicht die Visualisierung der endogenen Abschriften der telomeric Repeat-haltigen RNA (TERRA) von einem einzigen Telomere in lebenden Zellen ausgedrückt.

Zusammenfassung

Telomere sind transkribiert telomeric Repeat-haltigen lange forensisches RNAs (TERRA), verursachend, die sind vorgeschlagen worden, eine wichtige Rolle in der Telomere Biologie, einschließlich Heterochromatin Bildung und Telomere Länge Homöostase spielen. Neue Erkenntnissen zufolge TERRA Moleküle auch mit inneren chromosomalen Regionen zur Regulierung der Genexpression in Mauszellen embryonaler Stammzellen (ES) interagieren. Im Einklang mit dieser Beweis RNA Fluoreszenz in Situ Hybridisierung (RNA-Fisch) Analysen haben gezeigt, dass nur eine Teilmenge von TERRA Abschriften an Chromosomenenden lokalisieren. Ein besseres Verständnis der Dynamik von Molekülen TERRA hilft, ihre Funktion und Wirkmechanismen zu definieren. Hier beschreiben wir eine Methode zum Beschriften und Single-Telomere TERRA Transkripte in Krebszellen mit dem MS2-GFP-System zu visualisieren. Zu diesem Zweck präsentieren wir ein Protokoll, um stabile Klone zu erzeugen mit Hilfe der AGS menschlichen Magen Krebs Zell-Linie mit MS2 Sequenzen zu einer einzigen Produktlinie integriert. Transkription von TERRA von MS2-Tags Telomere ergibt sich in der Expression von MS2-Tags TERRA-Moleküle, die durch live-Cell-Fluoreszenz-Mikroskopie auf Co Ausdruck ein MS2-RNA-bindende Protein mit GFP (MS2-GFP) verschmolzen visualisiert werden. Dieser Ansatz ermöglicht es Forschern, die Dynamik des Single-Telomere TERRA Moleküle in Krebszellen zu studieren, und es kann auf andere Zelllinien angewendet werden.

Einleitung

Die lange nichtcodierender RNA-TERRA ist aus der Region subtelomerischen Chromosomen transkribiert und seine Transkription verläuft in Richtung der Chromosomenenden, beendet in der telomeric repeat Trakt^1,2. Aus diesem Grund TERRA Abschriften bestehen aus subtelomeric stammenden Sequenzen an ihrem 5'-Ende und beenden mit telomeric Wiederholungen (UUAGGG bei Wirbeltieren)³. Wichtige Rollen vorgeschlagen worden für TERRA, einschließlich Heterochromatin Bildung Telomere^4,5, DNA-Replikation⁶, Förderung der homologen Rekombination zwischen Chromosom^7,8 endet ^{, 9}, Regulierung der Telomere Struktur¹⁰und Telomere Länge Homöostase^2,11,12,13. Darüber hinaus interagieren TERRA Transkripte mit zahlreichen Extratelomeric Websites, weit verbreitete Genexpression in Maus embryonaler Stammzellen (ES) Zellen¹⁴zu regulieren. Im Einklang mit diesen Beweis, RNA Fluoreszenz in Situ Hybridisierung (RNA-Fisch) Analysen haben gezeigt, dass nur eine Teilmenge der TERRA Transkripte lokalisieren Telomere^1,2,15. Darüber hinaus wurde TERRA Form nuklearen Aggregate Lokalisierung auf der X und Y Chromosomen in Maus Zellen^2,16berichtet. Diese Ergebnisse zeigen, dass TERRA Transkripte komplexe Dynamik innerhalb des Zellkerns zu unterziehen. Verständnis der Dynamik von Molekülen TERRA wird dazu beitragen, ihre Funktion und Wirkmechanismen zu definieren.

Das MS2-GFP-System hat verbreitet, RNA-Moleküle in lebenden Zellen aus verschiedenen Organismen^17,18zu visualisieren. Dieses System hat früher zu markieren und zu visualisieren Single-Telomere TERRA Moleküle in S. Cerevisiae^12,19. Mit diesem System vor kurzem zeigte sich, dass Hefe TERRA Transkripte lokalisieren innerhalb des Zytoplasmas während der Phase der Post-Diauxic-Schicht darauf hindeutet, dass TERRA extranuclear Funktionen²⁰ausüben kann. Wir haben vor kurzem MS2-GFP-System verwendet, um Single-Telomere TERRA Transkripte in Krebs Zellen²¹zu studieren. Zu diesem Zweck wir beschäftigt die CRISPR/Cas9-Genom-editing-Tool, MS2 Sequenzen an ein einzelnes Telomer (Telomere 15q, im folgenden Tel15q) zu integrieren und erhalten Klone MS2-Tags endogenen Tel15q TERRA (TERRA-MS2 Klone) zum Ausdruck zu bringen. Co Ausdruck ein GLP-verschmolzen MS2-RNA-bindende Protein (MS2-GFP), das erkennt und bindet MS2-RNA Sequenzen ermöglicht Visualisierung von Single-Telomere TERRA Transkripte in lebenden Zellen²¹. Das hier abgebildete Protokoll soll für die Generation von TERRA-MS2 Klonen erforderlichen Schritte im Detail zu beschreiben.

Um TERRA-MS2 Klone zu erzeugen, ist eine MS2 Kassette innerhalb der subtelomerischen Region der Telomere 15q, integriert der TERRA Promotor Region und Transkription Startsite nachgeschaltet. Die MS2-Kassette enthält eine Neomycin-Resistenz-Gen von Lox-p Seiten flankiert, und seine Integration in die Produktlinie 15q erfolgt über CRISPR/Cas9 System²². Nach Transfektion von der MS2 Kassette, einzelnen Klone ausgewählt sind und subtelomerischen Integration der Kassette wird verifiziert durch PCR, DNA Sequenzierung und Southern blot. Positive Klone sind mit einem Cre exprimierenden Adenovirus infiziert, um die Auswahlmarkierung in der Kassette entfernen nur MS2 Sequenzen und eine einzelne Lox-p vor Ort bei der Produktlinie 15q verlassen. Ausdruck der MS2-Tags TERRA Abschriften von Tel15q wird von RT-qPCR überprüft. Zu guter Letzt drückt sich die MS2-GFP Fusionsprotein in TERRA-MS2 Klone über retroviralen Infektion um MS2-TERRA Transkripte von Fluoreszenzmikroskopie sichtbar zu machen. TERRA Transkripte von RNA-Fisch leicht nachweisbar und live Cell Imaging mit telomeric Repeat-spezifische Sonden^1,2,15,23. Diese Ansätze liefern wichtige Informationen über die Lokalisation der Gesamtbevölkerung von TERRA Moleküle in einzelne Zelle Auflösung. Die Generation der Klone mit MS2 Sequenzen zu einer einzigen Produktlinie ermöglicht es Forscher studieren die Dynamik des Single-Telomere TERRA Transkripte in lebenden Zellen, die helfen die Funktion und die Mechanismen der Wirkung von TERRA zu definieren.

Protokoll

1. Auswahl von Neomycin resistente Klone

1. Wachsen Sie AGS-Zellen in Ham es F-12_K (Kaighn) Medium ergänzt mit 10 % fetalen Bovine Serum (FBS), 2 mM L-Glutamin, Penicillin (0,5 Einheiten pro mL Medium) und Streptomycin (0,2 µg pro mL Medium) bei 37 ° C und 5 % CO₂. Die Zellen mit einem 50-60 % Zusammenfluss mit dem SgRNA/Cas9 mit dem Ausdruck Vektor und der MS2-Kassette auf eine 01:10 transfizieren Molverhältnis²¹.
   Hinweis: In einer parallelen Programmierung überprüfen Sie Transfektion Effizienz durch transfecting einen GLP-mit dem Ausdruck Vektor (d. h. Cas9-GFP Vektor). Mindestens 60 %-70 % Transfektion Effizienz erreicht werden sollte.
2. Ersetzen Sie am folgenden Tag, die Kultivierung Medium mit Neomycin bei 0,7 µg/mL Endkonzentration (selektive Mittel)-haltigem Medium.
   Hinweis: Die Zellen teilen und säen sie im selektiven Medium am Tag nach der Transfektion der Auswahlprozess beschleunigt wird. Alle nicht-transfizierten Zellen werden sofort sterben. Transfektion in 6-well-Platten erfolgt, wobei jedes gut 60 % würde Zusammenfluss ca. 0,7 x 10⁶ Zellen am Folgetag enthalten, die die Zellen aus einem einzigen Brunnen zu einem 10 cm Schüssel mit selektiven Medium aufgeteilt werden können.
3. Halten die Zellen im selektiven Medium für 7-10 Tage ändern jedes Mediums oder zwei Tage, bis einzelne Klone sind sichtbar.
4. Kommissionierung von Zellklonen
   1. Bereiten Sie 96-well-Platte, mit 10 µL 0.25 % Trypsin in jedes gut vor.
      Hinweis: Bereiten Sie zwei 96 Platten auch für den Fall, dass mehr als 96 Klone abgeholt werden sollen.
   2. Markieren Sie mit dem Einsatz eines Mikroskops die Position jeder Klon sichtbar in die 10 cm Teller indem man einen Punkt am unteren Rand der Schale mit einem Marker. Jeder Punkt entspricht einer Kolonie abgeholt werden.
   3. Ersetzen Sie die Kultivierung Medium mit gerade genug Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) bilden einen dünnen Film von Flüssigkeit auf die Klone und nicht die Zellen während der Klon-Kommissionierung trocknen lassen.
   4. Wählen Sie einzelne Kolonien mit einer 10 µL Pipette. Befestigen Sie die Spitze mit 5 µL von Trypsin in die Kolonie und lassen Sie langsam Trypsin die lokalisierte auf die Kolonie bleiben los. Lassen Sie Trypsin zu trennen, die Zellen für 1 min, dann kratzen die Kolonie mit der Spitze in der Spitze saugen.
      Hinweis: Während dieses Vorgangs spiegeln die Schüssel ein bisschen auf der einen Seite so um das Volumen der PBS rund um die Kolonie gepflückt zu verringern den Kommissioniervorgang durch Verdünnen der Trypsin um die Kolonie zu vermeiden hilft. Mit einem Klon-Ring kann auch helfen, einzelne Klone abholen.
   5. Platzieren Sie die Zellen aus der Kolonie in einen Brunnen mit 10 µL 0.25 % Trypsin 96-well-Platte.
   6. Inkubieren Sie 5 min bei Raumtemperatur, dann füllen Sie den Brunnen mit 150 µL des selektiven Medium (Hams F - 12K (Kaighn) Mittel enthalten Neomycin bei und ergänzt mit 10 % FBS, 2 mM L-Glutamin, Penicillin (0,5 Einheiten pro mL Medium), Streptomycin (0,2 µg pro mL Medium) eine Konzentration von 0,7 µg/mL.
      Hinweis: Während der Inkubationszeit können andere Klone abgeholt werden. Es empfiehlt sich, möglichst viele Klone wie möglich auszuwählen. Die weitere Klone werden gepflückt, desto höher die Chancen der Identifizierung von positiven zu sein.
   7. Sobald alle Klone sind gepflückt und in der 96-well-Platte übertragen, können Sie die Zellen weiter für ein paar Tage in selektiven Medium Hams F - 12 K (Kaighn) Medium ergänzt mit 10 % FBS, 2 mM L-Glutamin, Penicillin (0,5 Einheiten pro mL Medium), Streptomycin (0,2 µg pro mL des Mediums) und mit Neomycin in einer Konzentration von 0,7 µg/mL bei 37 ° C und 5 % CO₂, bis zum Zusammenfluss von 90 % erreichen.
5. Spaltung der Klone
   1. Bereiten Sie drei 96 well-Platten beschichtet mit Gelatine durch Hinzufügen von 100 µL der Gelatine pro Bohrloch, 30 min bei Raumtemperatur inkubieren, dann zweimal mit PBS waschen. Diese Platten werden für die DNA-Extraktion (DNA-Platte) und Klon Einfrieren (einfrierende Platten) verwendet werden.
      Hinweis: Gelatine wird die Anlage der Zellen und der DNA in die Vertiefungen fördern. Die Gelatine-Beschichtung ermöglichen insbesondere die DNA zu kleben an der Unterseite der Brunnen während der DNA-Extraktion und Verfahren (siehe unten) zu waschen. Während das Klon-splitting-Verfahren empfiehlt es sich, eine Mehrkanal-Pipette verwenden.
   2. Einmal Klone erreichen 90 % Zusammenfluss, Aspirieren Medium aus jeder Quelle des 96-well-Platte, waschen mit PBS, 30 µL 0.25 % Trypsin pro Bohrloch hinzufügen und 5 min bei 37 ° c inkubieren
      Hinweis: Klone wachsen unterschiedlich schnell, die auch von der Anzahl der Zellen pro Klon nahm abhängen. Somit wird dieser Schritt während der mehrere Tage durchgeführt werden, wenn die anderen Klone Zusammenfluss von 90 % erreichen.
   3. Fügen Sie 70 µL des selektiven Medium pro Bohrloch hinzu, stören Sie Zelle Klumpen von oben und unten in die Vertiefungen Pipettieren zu, dann 30 µL 100 µL auf die verkleisterte DNA Platte vorausgefüllt mit 120 µL des selektiven Medium pro gut und 30 µL, die verkleisterte Einfrieren Platten vorgefüllten Witz h 50 µL Medium (ohne Markierung).
   4. Die DNA-Platte im Inkubator und lassen Sie die Zellen bei 37 ° C und 5 % CO₂ bis 90 % Zusammenfluss wachsen.
   5. Fügen Sie 80 µL eiskalte frisch 2 x Medium (80 % FBS und 20 % Dimethyl Sulfoxid (DMSO)) Einfrieren gemacht in jede Vertiefung der eiskalte Platte, fügen Sie Parafilm (gespritzt mit 70 % Ethanol) auf die Platte so zu jedem Bohrloch zu versiegeln, setzen Sie den Deckel an der Spitze und die Platte mit Alu-Folie wickeln. Legen Sie die eisigen Platten bei-80 ° C.
   6. Die ursprünglichen 96-well-Platte mit der Klone, die wurden aufgeteilt und halten es in der Kultur bis zum PCR-screening Ergebnisse fügen Sie 90 µL des selektiven Medium pro Bohrloch hinzu. Diese Platte wird als Platte zur Sicherung verwendet werden.

2. screening von Neomycin resistente Klone

1. DNA-Extraktion aus 96 well DNA-Platte.
   1. Sobald die Klone kultiviert in der DNA-Platte 90 % Zusammenfluss erreichen, 2 Mal mit PBS waschen, dann mit 50 µL-Lyse-Puffer (10 mM Tris pH 7,5, 10 mM EDTA, 10 mM NaCl, 0,5 % SDS und 1 mg/mL Proteinase K) lösen. Decken Sie die Platte mit Parafilm ab, Abdichten jedes gut, setzen Sie den Deckel auf, mit Frischhaltefolie abdecken, und stellen Sie über Nacht bei 37 ° C.
   2. Hinzufügen von 100 µL von kaltem Ethanol (Et-OH) / NaCl-Lösung (0,75 M NaCl in 100 % igem Ethanol) zu jedem gut und Niederschlag für 6 Stunden oder über Nacht bei Raumtemperatur.
      Hinweis: Das Protokoll kann hier angehalten werden.
   3. Entfernen Sie die Et-OH/NaCl-Lösung durch Umdrehen der Plattenrandes und waschen Sie 3 Mal mit 200 µL 70 % Ethanol pro gut.
   4. Fügen Sie 25 µL RNAse A-Lösung in destilliertem Wasser und Inkubation bei 37 ° C für 1 h.
2. Verwenden Sie 3 µL genomic DNA für PCR Verstärkung. Durchführen Sie PCR-Screening der ausgewählten Klone mit Zündkapseln Tempern innerhalb der Neomycin-Resistenz-Gen und Produktlinie 15q. PCR-Amplifikation erfolgt mit standard-Polymerase Enzyme und PCR Protokolle²¹.
   Hinweis: PCR-Bedingungen für die MS2 Primer (Primer als MS2-subtel15q-Grundierung-S und MS2) und CTR-Primer (CTR Prime S und CTR Grundierung als) sind die folgenden: 98 ° C für 20 s als Denaturierung Schritt und dann 34 Zyklen bei 98 ° C 10 s, 58° C 20 s, 72 ° C 15 s , mit Enzym Polymerase in 25 µL Reaktion mischen (siehe Tabelle der Materialien). Primer-Sequenzen sind in Tabelle 1angegeben.
3. PCR-Reaktionen auf Agarosegel laufen und PCR Bands gewonnenen positiven Klone mit standard Gel Extraktionsverfahren (siehe Tabelle der Materialien für Gel Extraktion Reagenzien) zu extrahieren.
4. Durchführen Sie DNA-Sequenzierung Analysen des PCR Produktes Gel extrahiert für Bestätigung der Anwesenheit der MS2 Sequenzen²¹.
   Hinweis: Die Sequenzierung Analysen können unter Verwendung der Zündkapseln benutzt für das PCR-Screening durchgeführt werden.
5. Südlicher Fleck Screening PCR positive Klone
   1. Wachsen Sie die Klone mit PCR und Sequenzierung Screening von der ursprünglichen 96-well-Platte (die Platte zur Sicherung), 6-well-Platten in Hams F - 12K (Kaighn) Medium ergänzt mit 10 % FBS, 2 mM L-Glutamin, Penicillin (0,5 Einheiten pro mL Medium), Streptomycin (0,2 µg pro positiv mL Medium) und mit Neomycin in einer Konzentration von 0,7 µg/mL bei 37 ° C 5 % CO₂.
      Hinweis: Alternativ, wenn einige dieser Klone verloren gegangen, tauen sie aus einem der eisigen Platten (siehe Protokoll 2.6).
   2. Sobald die Klone sind am Zusammenfluss von 90 % in der 6-well-Platte, die Zellen mit PBS waschen und fügen 250 µL Lyse Puffer mit 0,5 µg Proteinase K pro Bohrloch.
   3. Kratzen Sie die Zellen mit einem Schaber Zelle und übertragen Sie lysate in einem 1,5 mL Röhrchen zu.
   4. Inkubation bei 37 ° C 16 h.
   5. Fügen Sie 1 mL 100 % Ethanol, schütteln Sie kräftig und lassen Sie die DNA zu überstürzen sich mindestens 2 Stunden oder über Nacht bei-20 ° C.
      Hinweis: Das Protokoll kann hier angehalten werden.
   6. Drehen mit 13.400 x g bei 4 ° C für 10 min, überstand verwerfen, und waschen Sie die Pellets mit 70 % Ethanol. Lassen Sie die Pellets Luft bei Raumtemperatur trocknen. Alternativ können Sie einen Vakuum-Konzentrator.
   7. Die DNA-Pellets in 50 µL destilliertes Wasser mit RNAse A Aufschwemmen und 1 h bei 37 ° c inkubieren
   8. 5-10 µg genomische DNA mit Restriktionsenzymen NcoI und BamHI (zwei unabhängige Verdauung) in 100 µL Reaktionsvolumen durch Inkubation der Verdauung Reaktionen bei 37 ° C über Nacht zu verdauen.
   9. Führen Sie 4 µL der Verdauung auf Agarosegel (0,8 % Agarose) für die komplette Verdauung Bestätigung.
   10. Hinzufügen der Einschränkung Verdauung Reaktionen 1/10-bändige Natrium Acetat 3 M Lösung pH 5,2 und 2 Bände von 100 % Ethanol und inkubieren Sie mindestens 2 Stunden oder über Nacht bei-20 ° C, DNA auszufällen.
       Hinweis: Das Protokoll kann hier angehalten werden.
   11. Bei 13.400 x g bei 4 ° C für 20 min Zentrifugieren Sie, verwerfen Sie die Überstände und waschen Sie die Pellets mit 70 % Ethanol. Lassen Sie die Pellets an der Luft bei Raumtemperatur trocknen. Alternativ können Sie einen Vakuum-Konzentrator.
   12. Aufschwemmen Sie Pellets in 20 µL destilliertes Wasser und laden Sie die verdaute DNA auf einem 0,8 % Agarose-Gel.
       Hinweis: Für eine bessere Auflösung der verdauten DNA, bereiten Sie eine Gel mindestens 15 cm lang und bei niedriger Spannung (̴30 Volt) über Nacht laufen. Die Elektrophorese einrichten sollte optimiert werden.
   13. Am folgenden Tag, färben Sie das Gel mit einem DNA-Kennzeichnung Mittel, wie Interkalation Bromid in 1 µL/10 mL Endkonzentration für 30 min bei Raumtemperatur und nehmen Sie ein Bild mit einem Lineal in der Nähe von dem Gel auf einem Gel imaging Instrument.
   14. Den Transfer der DNA auf einer Nylon-Membran und durchführen Sie Membran Hybridisierung mit einer MS2 Sequenz-spezifische Sonde mit Standardverfahren²¹.
   15. Auftauen der Klone, die positiv auf PCR, DNA Sequenzierung und südlichen Fleck von einem der beiden Einfrieren Platten (siehe nächster Schritt).
6. Auftauen von Klonen
   1. Bereiten Sie eine 15 mL Tube mit 5 mL der vorgewärmten Ham F - 12 K (Kaighn) Medium ergänzt mit 10 % FBS, 2 mM L-Glutamin, Penicillin (0,5 Einheiten pro mL Medium) und Streptomycin (0,2 µg pro mL Medium) für jeden Klon aufgetaut werden.
   2. Entfernen Sie eines eisigen Platten von-80 ° und 100 µL vorgewärmten F12K komplette Medium in die gut mit den positiven Klon aufgetaut werden.
      Hinweis: Dieses Verfahren sollte schnell ausgeführt werden und die 96-well-Platte auf Trockeneis gelegt werden sollte, nachdem jeder Klon aufgetaut ist, damit die anderen Klone, eingefroren bleiben können. Dies ist besonders wichtig, wenn mehrere Klone aus der gleichen 96-well-Platte aufgetaut werden müssen.
   3. Übertragen Sie die Zellen in der 15 mL Tube mit 5 mL Medium und Zentrifuge bei 800 X g für 5 min bei Raumtemperatur.
   4. Aspirieren Sie das Medium, Aufschwemmen der Zellen in 500 µL vorgewärmten komplette F12K Medium, und jeder Klon zu einem einzigen Brunnen von einem 12-well-Platte zu übertragen.
7. Beseitigung von Neomycin-Resistenz-Gen aus der MS2 Kassette auf Produktlinie 15q integriert.
   1. Lassen Sie die Klone von einer 12-well-Platte auf eine 10 cm Teller in kompletten F12K Medium anwachsen.
      Hinweis: Neomycin sollten nicht in das Medium einbezogen werden, sofern nicht anders angegeben.
   2. Die kultivierten Zellen in einer 10 cm Petrischale mit 70 % Zusammenfluss in 10 mL des kompletten F12K Medium das Cre exprimierenden Adenovirus hinzufügen.
      Hinweis: Mit einem Cre-GLP mit dem Ausdruck ihrer Adenovirus Bewertung der Effizienz der Infektion, können 100 % nähern sollte. Das Adenovirus-Replikation-defekt verloren nach einige Passagen in der Kultur.
   3. Teilen Sie 48 Stunden nach der Infektion der Zellen in drei 10 cm Gerichte. Zwei Gerichte dienen zur Überprüfung der Neomycin gen Beseitigung durch negative Auslese, wachsen die Zellen in Neomycin-haltigen Medium (vor Gericht), und durch Southern blot (zweiten Gang).
   4. Die dritte Schale mit dem Klon für Zelle Einfrieren und RNA-Extraktion-Kultur.

3. Überprüfung der TERRA-MS2 Transkript Ausdruck von RT-qPCR

1. Führen Sie nach der Überprüfung von Neomycin gen entfernen total RNA-Extraktion aus TERRA-MS2 Klone mit organischen Lösungsmitteln (Phenol und Guanidin Isothiocynate Lösung)²¹.
   1. Aufschwemmen der RNS aus einer 10 cm Teller in 100 µL Diethyl Pyrocarbonate (DEPC) Wasser extrahiert.
   2. Laufen Sie 3 µL RNA auf ein Denaturating (1 % Formaldehyd-haltige) 1 X 3-(N-Morpholino) Propanesulfonic Säure (MOPS) Gel, um Konzentration und Integrität der RNA zu überprüfen. Analysieren Sie auch RNA-Konzentration mit einem Spektralphotometer.
   3. Ich benutze 1 Einheit der DNAse 3 µg RNA mit DNAse zu behandeln ich Enzym in 60 µL endgültige Reaktionsvolumen.
   4. Inkubieren Sie die Reaktion für 1 h bei 37 ° c
2. Reverse Transkription Reaktion und qPCR Analysen
   1. Fügen Sie die folgenden Komponenten zu einem Nuklease-freie Microcentrifuge Schlauch: 2 µL einer 1 µM TERRA spezifischen Primer, 1 µL dNTPs Mix (10 mM), 6 µL DNAse-behandelten RNA (entsprechend ̴300ng RNA). Stellen Sie die Lautstärke auf 13 µL mit 4 µL DEPC-Wasser.
      Hinweis: Für jede RNA untersucht werden, sollte eine zweite Röhre, enthält die gleichen Reagenzien, sondern eine Referenz spezifischen Primer, anstelle von TERRA spezifischen Primer, vorbereitet werden.
   2. Erhitzen Sie die Mischung auf 65 ° C für 5 min und im Eis für mindestens 1 min inkubieren.
   3. Den Inhalt der Röhren durch kurzen Zentrifugation sammeln und fügen 4 µL 5 X RT Enzyms Puffer, 1 µL 0.1 M Dithiothreitol (DTT), 1 µL RNAse-Inhibitor (4 Stück) und 1 µL Reverse Transkriptase (siehe Tabelle der Materialien).
   4. Die Proben bei 42 ° C für 60 min inkubieren und 2 µL RT-Reaktion für qPCR Analysen verwenden können.
3. Bereiten Sie qPCR-Reaktion-Mix in einem Endvolumen von 20 µL bestehend aus 10 µL 2 X qPCR-master-Mix, 2 µL cDNA-Vorlage, 1 µL vorwärts Primer (10 µM) 1 µL des rückwärts-Primer (10 µM) und 6 µL Wasser vor.
4. Durchführen Sie qPCR Reaktion in einem Thermocycler mit Standardprotokollen²¹.

4. Herstellung von ein MS2-GLP mit dem Ausdruck Retrovirus

1. MS2-GLP mit dem Ausdruck ihrer Retrovirus generieren, transfizieren Sie 80 % konfluierende Phoenix Verpackungszellen mit einem MS2-GFP Fusionsprotein Ausdruck Retrovirus-Vektor (pBabe-MS2-GFP PURO) und ein Env -gen mit dem Ausdruck Vektor (z. B. pCMV-VSVG) mit einem Molverhältnis 4:1 von die beiden Vektoren.
2. Am Folgetag ersetzen Sie die Kultivierung Medium (DMEM mit 10 % ergänzt, FBS, 2 mM L-Glutamin und Pen/Strep) mit frischem Medium mit 10mM Natrium Butyrat.
3. Inkubieren Sie 8 h bei 37 ° C, 5 % CO₂, dann ersetzen Sie das Medium mit frischen Kultivierung Medium, aus dem das Virus gesammelt werden.
4. Entfernen Sie nach 48 h das Retrovirus-haltigen Medium aus den Phoenix-Zellen. Dieses Medium kann direkt für die Infektion von TERRA-MS2 Klonen verwendet werden, in diesem Fall das Medium durch einen 0,45 µm-Filter filtern, Polybrene (30 µg/mL Endkonzentration) hinzufügen und Zellen (in diesem Fall ist das Protokoll weiter bei Schritt 5) hinzufügen. Alternativ kann Retrovirus in ein 50 mL Falcon-Röhrchen durch Zugabe von 1/5-^th -Volumen von 50 % PEG-8000/900 mM NaCl-Lösung und Inkubation über Nacht bei 4 ° C auf einem Rotator Rad ausgefällt werden.
5. Am folgenden Tag, Pellet Retrovirus Partikel durch Zentrifugation bei 2.000 x g für 30 min, überstand entfernen und das Pellet in F12K Medium ohne Serum aufzuwirbeln.
   Hinweis: Die Viruspartikel können in 1/100^th des ursprünglichen Volumens überstand Nukleinsäuretablette. Ein Infektion Test sollte durchgeführt werden, um zu überprüfen, das Mindestvolumen von Retroviren benötigt, um effizient die Zellen infizieren.

(5) Visualisierung von TERRA-MS2 Transkripte in lebenden Zellen

1. Platte TERRA-MS2 Klone und WT AGS Zellen im Glasboden-Gerichte. Am Tag der Infektion hinzu kommen Polybrene das Medium (30 µg/mL Endkonzentration) und die MS2-GLP mit dem Ausdruck ihrer Retrovirus.
2. Verwerfen Sie nach 24 Stunden die Virus-haltigen Medium zu und fügen Sie frisches Medium ohne Phenol-rot.
3. Analysieren Sie die Zellen in einem inversen Mikroskop mit dem entsprechenden Mikroskop-Einstellung. Das Bild der Zellen mit 100 X oder 60 X Objektiv mit großen numerische Apertur (1.4 X) und mit einem sensiblen Kamera (EMCCD). Verwenden Sie ein Umwelt-Kontrollsystem, um die Proben bei 37 ° C und 5 % CO₂ während der Bildgebung beizubehalten.

Ergebnisse

Abbildung 1 stellt einen Überblick über die experimentelle Strategie. Die wichtigsten Schritte des Protokolls und einer indikativen Zeitlinie zur Erzeugung von TERRA-MS2 Klone in AGS Zellen werden (Abb. 1A) angezeigt. Am 1. Tag sind mehrere Brunnen von einem 6-well-Platte mit der MS2 Kassette und SgRNA/Cas9 zum Ausdruck zu bringen (siehe Abbildung 1B)...

Diskussion

In diesem Artikel präsentieren wir Ihnen eine Methode, um Krebserkrankungen Zellklonen mit MS2 Sequenzen innerhalb Produktlinie 15q integriert zu generieren. Diese Klone verwenden, werden die MS2-Tags TERRA-Moleküle aus der Produktlinie 15q transkribiert durch Fluoreszenz-Mikroskopie von Co Ausdruck ein MS2-GFP Fusionsprotein erkannt. Dieser Ansatz ermöglicht es Forschern, die Dynamik der TERRA von einem einzigen ausgedrückt zu studieren Telomere in lebenden Zellen²¹. In diesem Protokoll werde...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
AGS cells	-	-	Gift from Christian Baron (Université de Montréal).
F12K Nut Mix 1X	GIBCO	21127022	Culturing medium for AGS cells
L-Glutamine	CORNING	MT25005CI	Component of cell culturing medium
Penicillin Streptomycin Solution	CORNING	30-002-CI	Component of cell culturing medium
Fetal Bovine Serum	Sigma Aldrich	F2442	Component of cell culturing medium
DMEM 1X	GIBCO	21068028	culturing medium for phoenix cell
CaCl2	Sigma Aldrich	C1016	used in phoenix cell transfection
HEPES	Sigma Aldrich	H3375	used in phoenix cell transfection (HBS solution)
KCl	Sigma Aldrich	P9333	used in phoenix cell transfection (HBS solution)
Dextrose	Sigma Aldrich	D9434	used in phoenix cell transfection (HBS solution)
NaCl	Sigma Aldrich	S7653	used in phoenix cell transfection (HBS solution) and retrovirus precipitation
Na2HPO4	Sigma Aldrich	S3264	used in phoenix cell transfection (HBS solution)
TRYPSIN EDTA SOLUTION 1X	CORNING	59430C	used in cell split
DPBS 1X	GIBCO	14190250	Dulbecco's Phosphate Buffered Saline
DMSO	Sigma Aldrich	D8418	Component of cell freezing medium (80% FBB and 20% DMSO)
G-418 Disulphate	Formedium	G4185	selection drug for
Gelatin solution Bioreagent	Sigma Aldrich	G1393	cotaing of 96 well DNA plate and freezing plate
Tris-base	Fisher BioReagents	10376743	Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction
EDTA	Sigma Aldrich	E6758	Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction
SDS	Sigma Aldrich	71729	Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction
Proteinase K	Thermo Fisher	AM2546	Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction
RNAse A	Thermo Fisher	12091021	RNA degradation during DNA extraction
Agarose	Sigma Aldrich	A5304	DNA gel preparation
Atlas ClearSight	Bioatlas	BH40501	Stain reagent used for detecting DNA and RNA samples in agarose gel
ethanol	Fisher BioReagents	BP28184	DNA precipitation
Sodium Acetate	Sigma Aldrich	71196	Used for DNA precipitation at a 3M concentration pH5.2
Wizard SV Gel and PCR clean-Up system	Promega	A9282	Extraction of PCR fragments from agarose gel during PCR screening of neomycin positive clones
Trizol	AMBION	15596018	Organic solvent used for RNA extraction
Dnase I	THERMO SCIENTIFIC	89836	degradation of genomic DNA from RNA
dNTPs mix	Invitrogen	10297018	used in RT and PCR reactions
DTT	Invitrogen	707265ML	used in RT reactions
diethyl pyrocarbonate	Sigma Aldrich	D5758	used to inactivate RNAses in water (1:1000 dilution)
Ribolock	Thermo Fisher	EO0381	RNase inhibitor
MOPS	Sigma Aldrich	M9381	preparation of RNA gel
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15710	preparation of denaturating RNA gel (1% PFA in 1x MOPS)
Superscript III Reverse transcriptase	Invitrogen	18080-093	Retrotranscription reaction
Pfu DNA polymerase (recombinant)	Thermo Scientific	EP0501	PCR reaction
2X qPCRBIO SyGreen Mix Separate-ROX	PCR BIOSYSTEMS	PB 20.14	qPCR reaction
Cre-GFP adenovirus	https://medicine.uiowa.edu/vectorcore	1174-HT	used to infect TERRA-MS2 clones in order to remove the neomycn gene
Sodium Butyrate	Sigma Aldrich	B5887	used to promote retrovirus particles production in phoenix cells
PEG8000	Sigma Aldrich	89510	Precipitation of retrovirus partcles
35µ-Dish Glass Bottom	Ibidi	81158	used in live cell imaging analyses of TERRA-MS2 clones