Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Burada, tek bir subtelomere bir MS2 sıra etiketi içeren kanser hücre klonlar oluşturmak için bir protokol mevcut. Bu yaklaşım MS2 GFP sistemde güvenerek, endojen tutanaklar, telomeric tekrar içeren RNA (canlı hücreler içinde tek bir telomer üzerinden ifade TERRA) görselleştirme sağlar.

Özet

Telomer, sebebiyet veren telomeric için tekrar içeren-uzun kodlamayan RNA'ların (TERRA), hangi heterochromatin oluşumu ve telomer uzunluğu homeostasis gibi telomer biyolojide önemli rol oynarlar önerilen transkripsiyonu. Son bulgular TERRA molekülleri Ayrıca gen ekspresyonu fare embriyonik kök (ES) hücre içinde düzenlemek için iç kromozom bölgeleri ile etkileşim ortaya koydu. Bu kanıtlar doğrultusunda sadece bir alt RNA floresans in situ hibridizasyon (RNA-balık) analizleri göstermiştir TERRA tutanaklar kromozom uçlarında yerelleştirilmesine. TERRA molekülleri dinamiklerini daha iyi anlaşılmasını işlev ve mekanizmaları eylem tanımlamak yardımcı olur. Burada, etiket ve tek-telomer TERRA transkript kanser hücrelerinde MS2 GFP sistemini kullanarak görselleştirmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu amaçla, biz AGS insan mide kanseri hücre kültürünü tek bir subtelomere entegre MS2 dizileri içeren kullanarak istikrarlı klonlar, oluşturmak için bir protokol mevcut. TERRA transkripsiyon MS2 öğesini telomer üzerinden canlı hücre floresans mikroskobu GFP (MS2-GFP) erimiş MS2 RNA-bağlayıcı proteinin ortak ifade üzerine tarafından görüntülenmiştir MS2 öğesini TERRA molekülleri ifade sonuçlanır. Tek-telomer TERRA molekülleri kanser hücrelerinin dinamiklerini incelemek araştırmacılar bu yaklaşım sağlar ve diğer hücre hatları için uygulanabilir.

Giriş

Uzun kodlamayan RNA TERRA kromozomlar subtelomeric bölgesinden sentezlenir ve onun transkripsiyon içinde telomeric tekrar yolu1,2sonlandırma kromozom uçları doğru devam eder. Bu nedenle, TERRA transkript vasıl onların son 5' subtelomeric kaynaklı sıralarının oluşur ve telomeric tekrarlar (omurgalılarda UUAGGG)3ile bitirmek. Önemli rolleri önerdi TERRA için telomerlerin4,5, DNA çoğaltma6kromozom arasında Homolog rekombinasyon teşvik, heterochromatin formasyonu da dahil olmak üzere7,8 biter , telomer yapısını10ve telomer uzunluğu homeostazı2,11,12,13düzenleyen 9. Ayrıca, TERRA transkript yaygın gen ekspresyonu fare embriyonik kök (ES) hücreleri14düzenleyen sayısız extratelomeric siteleri ile etkileşim. Bunlar doğrultusunda (RNA-balık) analizleri yalnızca alt küme küme küme kümesini TERRA transkript göstermiştir kanıt, RNA floresans in situ hibridizasyon yerelleştirmek telomerlerin1,2,15' de. Buna ek olarak, TERRA formu nükleer toplamları fare hücreleri2,16X ve Y kromozomu, yerelleştirme bildirilmiştir. Bu bulgular TERRA transkript çekirdek içinde karmaşık dynamics geçmesi göstermektedir. TERRA molekülleri dinamiklerini anlamak, işlev ve mekanizmaları eylem tanımlamak yardımcı olacaktır.

MS2 GFP sistem, canlı hücreler çeşitli organizmalar17,18RNA molekülleri görselleştirmek için yaygın olarak kullanılmıştır. Bu sistem daha önce etiket ve tek-telomer TERRA molekülleri S. cerevisiae12,19görselleştirmek için kullanılmıştır. Bu sistemi kullanarak, bu son zamanlarda Maya TERRA tutanaklar içinde sitoplazma post-diauxic shift aşamasında TERRA extranuclear işlevleri20uygulamayın düşündüren yerelleştirmek gösterilmiştir. Son zamanlarda tek-telomer TERRA transkript kanser hücreleri21çalışmaya MS2 GFP sistemi kullandık. Bu amaç için MS2 dizileri tek telomer (telomer 15q, bundan sonra Tel15q), entegre etmek için CRISPR/Cas9 genom düzenleme aracı istihdam ve klonlar MS2 öğesini endojen Tel15q TERRA (TERRA-MS2 klonları) ifade elde. Tanıyan ve yaşam MS2 RNA sıralarını etkinleştirir görselleştirme tek-telomer TERRA transkript bağlar GFP erimiş MS2 RNA-bağlayıcı protein (MS2-GFP) ortak ifade21hücreleri. TERRA-MS2 klonlar üretimi için gereken adımları ayrıntılı olarak açıklamak için burada resimli Protokolü amacı budur.

TERRA-MS2 klonlar üretmek için MS2 kaset telomer 15q, bölgenin subtelomeric tümleşiktir, TERRA organizatörü bölge ve transkripsiyon başlangıç sitesi aşağı akım. Füme balığı-p siteleri tarafından çevrili bir paromisin direnç gen MS2 kaset içerir ve onun entegrasyon subtelomere 15q, CRISPR/Cas9 sistem22kullanılarak gerçekleştirilir. Kaset, tek klonlar MS2 transfection seçilir ve subtelomeric entegrasyon-in kaset PCR tarafından doğrulandıktan sonra DNA sekanslama ve Güney leke. Pozitif klonlar Cre ifade adenovirus ile sadece MS2 dizileri ve subtelomere 15q tek somon balığı-p sitesinde bırakarak kasete, seçim işaretçisi kaldırmak için bulaşmış. TERRA MS2 öğesini transkript Tel15q üzerinden ifade RT-qPCR tarafından doğrulanır. Son olarak, MS2 GFP füzyon protein ifade edilir MS2-TERRA transkript floresans mikroskobu tarafından görselleştirmek için retroviral enfeksiyon via TERRA-MS2 klonlar içinde. TERRA transkript RNA-balık tarafından kolayca tespit edilebilir ve1,2,15,23telomeric tekrar özel kullanarak canlı hücre görüntüleme sondalar. Bu yaklaşımlar TERRA molekülleri tek hücre çözünürlükte toplam nüfusu lokalizasyonu üzerinde önemli bilgiler sağlar. Klonlar MS2 dizileri, tek bir subtelomere içeren nesil araştırmacılar tek-telomer TERRA transkript işlevi ve mekanizmaları TERRA eylem tanımlamak yardımcı olacaktır canlı hücrelerdeki dinamikleri çalışmaya olanak sağlar.

Protokol

1. Paromisin dayanıklı klonlar yelpazesi

  1. %10 Fetal sığır Serum (FBS) 2 mM L-glutamin, penisilin (orta mL başına 0.5 birim) ve streptomisin (orta mL başına 0.2 µg) 37 ° C ve % 5 CO2ile takıma Ham'ın F-12_K (Kaighn'ın) orta AGS hücreleri büyümek. Vektör ve MS2 Kaset 1:10, ifade sgRNA/Cas9 ile % 50-60 izdiham hücreleri transfect molar oranı21.
    Not: paralel bir deneyde, GFP ifade vektör (Yani, Cas9-GFP vektör) transfecting tarafından transfection verimliliği doğrulayın. En az 60-%70 transfection verim elde.
  2. Ertesi gün, paromisin, 0.7 µg/mL nihai toplama (Seçmeli Orta) içeren orta kodlamayla orta yerine.
    Not: hücreleri bölme ve onları transfection seçim sürecini hızlandıracaktır ertesi günü seçici ortamda tohum. Tüm sigara transfected hücreleri hemen ölür. Transfection 6 iyi levha gerçekleştirilirse, her şey % 60 Bu durumda izdiham yaklaşık 0,7 x 106 hücreler, hücre tek bir kuyudan bir 10 cm çanak içeren seçmeli orta bölünebilir ertesi gün içerir.
  3. Hücrelerin seçici ortamda 7-10 gün boyunca orta her biri değişen tutmak ya da iki gün, tek klonlar kadar görünür.
  4. Hücre klonlar seçmek
    1. % 0.25 tripsin her iyi 10 µL içeren bir 96 iyi tabak hazırlamak.
      Not: iki hazırlamak 96 de tabaklar-dibi takdirde fazla 96 klonlar çekilmesi bekleniyor.
    2. Mikroskop kullanımı ile her klon konumunu görünür 10 cm tabak içinde bir nokta alt kısmında bir işaretleyici kullanarak yemek yaparak işaretleyin. Her nokta bir koloni için çekilecek karşılık gelir.
    3. Kodlamayla orta ile yeterli fosfat tamponlu serum fizyolojik (sıvı ince bir film üzerinde klonlar formu ve klon malzeme çekme sırasında kuru hücreleri değil izin vermek için PBS) değiştirin.
    4. Tek kolonileri 10 µL pipet kullanarak seçin. Tripsin kolonisi 5 µL içeren ipucu ekleyin ve yavaş yavaş koloni lokalize kalır tripsin bırakın. Tripsin hücreler için 1 dk, ayırmak o zaman koloni ucu scrape ve ucunu emmek izin.
      Not: PBS hikayesidir koloni çevresinde azaltmak için malzeme çekme işlemi koloni çevresinde tripsin sulandrarak kaçınarak yardımcı olacak bu yüzden bu işlem sırasında bir tarafta biraz çanak çevirme. Bir klon ring kullanarak da tek klonlar seçmek yardımcı olabilir.
    5. Hücreleri koloni 96 iyi plaka 10 µL % 0.25 tripsin içeren bir kuyunun içine yerleştirin.
    6. Oda sıcaklığında 5 dk kuluçkaya sonra iyi Seçmeli Orta (%10 FBS, 2 mM L-glutamin, penisilin (orta mL başına 0.5 birim), streptomisin (orta mL başına 0.2 µg) ile desteklenmiş ve paromisin de içeren Ham'ın F - 12 K (Kaighn'ın) orta 150 µL ile doldurmak 0.7 µg/mL konsantrasyonu.
      Not: kuluçka süre içinde diğer klonlar olabilir aldı. Bu mümkün olduğu kadar çok klonlar almak için tavsiye edilir. Daha fazla klon toplanır yüksek şansını pozitif olanlar tanımlama olacaktır.
    7. Bir kez tüm klonlar aldı ve 96 iyi plaka transfer, Seçmeli Orta Ham'ın F - 12 K (Kaighn'ın) orta takıma %10 FBS, 2 mM L-glutamin, penisilin (orta mL başına 0.5 birim), streptomisin (0.2 µg mL başına birkaç gün büyümeye hücreleri bekleyin Orta) ve paromisin % 90 izdiham ulaşan kadar 0.7 µg/mL 37 ° C ve % 5 CO2' adlı bir konsantrasyon içeren.
  5. Klonlar keskin
    1. Üç hazırlamak 96 iyi tabak iyi, başına jelatin ekleyerek 100 µL tarafından jelatin ile kaplı, oda sıcaklığında 30 dk için kuluçkaya sonra PBS ile iki kez yıkayın. Bu tabakları ve dondurma (dondurma kaplamalar) klon DNA ekstraksiyon (DNA plaka) için kullanılır.
      Not: Jelatin kuyuları bağlanma hücrelerinin ve DNA'ın teşvik edeceklerdir. Özellikle, jelatin kaplama kuyu dibinde DNA ekstraksiyon sırasında sopa ve prosedürleri (aşağıda açıklanmıştır) yıkama DNA sağlayacaktır. Clone bölme işlemi sırasında bir çok kanallı pipet kullanılması önerilir.
    2. Klonlar % 90 izdiham ulaştığınızda, orta 96 iyi plaka her kuyudan Aspire edin, PBS ile yıkayın, 30 µL % 0.25 tripsin iyi ücret eklemek ve 37 ° C'de 5 min için kuluçkaya
      Not: Klonlar da klon aldı hücreleri bağlıdır farklı fiyatlarla büyüyecek. Böylece, bu adımı farklı klonlar % 90 izdiham ulaştığınız zaman birkaç gün boyunca gerçekleştirilecek.
    3. İyi başına seçmeli orta 70 µL ekleyin, yukarı ve aşağı kuyu içinde pipetting tarafından hücre kümeleri bozabilir, sonra 100 µL 30 µL Seçmeli Orta gelatinized Dondurucu levha doldurulmuş zekâ için iyi ve 30 µL başına 120 µL ile doldurulmuş gelatinized DNA plaka transfer h 50 µL Orta (seçme) olmadan.
    4. DNA plaka da kuluçka makinesine yerleştirin ve hücrelerin % 90 izdiham kadar 37 ° C ve % 5 CO2 ' de büyümeye sağlar.
    5. (% 70 etanol ile püskürtülür) parafilm kadar her şey mühür, kapağı üstüne yerleştirin ve plaka alüminyum folyo ile sarın için plaka üstüne ekleyin, buz gibi 80 µL taze 2 x Orta (% 80 FBS ve % 20 dimetil sülfoksit (DMSO)) dondurma yapılmış dondurma plaka her şey için ekleyin. -80 ° C'de yer donma tabaklar
    6. İyi başına Seçmeli Orta 90 µL bölünmüş olan ve kültür sonuçları eleme PCR kadar devam klonlar içeren orijinal 96 iyi plaka ekleyin. Bu plaka yedek plaka kullanılacaktır.

2. eleme paromisin dayanıklı klonları

  1. DNA ekstraksiyon 96 iyi DNA plaka.
    1. DNA plaka kültürlü klonlar % 90 izdiham ulaştığınızda, 2 kez PBS ile yıkayın, sonra 50 µL lysis ile tampon (10 mM Tris pH 7.5, 10 mM EDTA, 10 mM NaCl, % 0.5 SDS ve 1 mg/mL İndinavir K) koşullar. Parafilm ile plaka kapak, sızdırmazlık her şey, üzerinde streç ile kapak kapak koyun ve 37 ° C'de gecede yer.
    2. Soğuk etanol (Et-OH) 100 µL Ekle / NaCl çözüm (% 100 etanol 0,75 M NaCl) her şey ve 6 h veya gecede oda sıcaklığında çökelti.
      Not: Protokol burada duraklatılmış.
    3. Plaka ters çevirme tarafından Et-OH/NaCl çözümü kaldırmak ve 200 µL % 70 etanol iyi başına 3 kez yıkayın.
    4. RNAse A çözüm 25 µL distile su ekleyin ve 1 h için 37 ° C'de kuluçkaya.
  2. Genomik DNA'ın 3 µL PCR güçlendirme için kullanın. Besleme paromisin direnç gen ve subtelomere 15q içinde primerler kullanılarak seçilen klonlar PCR tarama gerçekleştirin. PCR güçlendirme standart polimeraz enzimleri ve PCR protokolleri21kullanılarak gerçekleştirilir.
    Not: MS2 astar (MS2-subtel15q-astar-S ve MS2 astar olarak) ve to astar (to Başbakan S ve to astar olarak) için PCR koşullar şunlardır: 20 98 ° C olarak denatürasyon adım ve sonra 34 döngü 98 ° C 10 s, 58° C 20 s, 72 ° C 15 s s , bir 25 µL polimeraz enzimi kullanarak tepki mix ( Tablo malzemelerigörmek). Astar dizileri Tablo 1' de belirtilmiştir.
  3. PCR reaksiyonları özel jel üzerinde çalıştırmak ve olumlu klonlar ( Tablo malzemeleri jel ayıklama kimyasalları görmek) standart jel çıkarma yordamları kullanarak elde edilen PCR bantları çıkarın.
  4. DNA sıralama jel çıkarılan PCR ürününün MS2 dizileri21varlığını onaylamasını çözümlemesi.
    Not: Sıralama analizleri PCR tarama için kullanılan primerler kullanılarak gerçekleştirilir.
  5. PCR olumlu klonlar Southern blot testi ile taranması
    1. Klonlar PCR ve Ham'ın F - 12 K (Kaighn'ın) orta takıma %10 FBS, 2 mM L-glutamin, penisilin (orta mL başına 0.5 birim), streptomisin (0.2 µg başına 6 iyi levha için sıralama filtreleme dışında orijinal 96 iyi plaka (yedek plaka) pozitif büyümeye Orta mL) ve paromisin, 0.7 µg/mL 37 ° C % 5 CO2konsantrasyonu içeren.
      Not: bazı bu klonlar kayıp olması, alternatif olarak, bir (bkz: Protokolü 2.6) dondurma plakaların onlardan çözülme.
    2. Bir kez klonlar % 90 izdiham içinde 6 iyi plaka, PBS hücrelerle yıkayın ve lizis arabelleği 0,5 µg İndinavir K iyi ücret içeren 250 µL ekleyin.
    3. Bir hücre kazıyıcı kullanarak hücreleri scrape ve lysate bir 1,5 mL tüp aktarmak.
    4. 16 h için 37 ° C'de kuluçkaya.
    5. 1 mL % 100 etanol ekleyin, şiddetle çalkalanır ve en az 2 h çökelti veya bir-20 ° C'de gece DNA izin
      Not: Protokol burada duraklatılmış.
    6. 13.400 x g 10 dk 4 ° C'de, spin, süpernatant atmak ve granül % 70 etanol ile yıkayın. Oda sıcaklığında Kuru granül hava girsin. Alternatif olarak, bir vakum yoğunlaştırıcı kullanın.
    7. DNA parçaları içinde 50 µL distile su RNAse A içeren resuspend ve 37 ° C'de 1 h için kuluçkaya
    8. 5-10 µg sindirim reaksiyonları 37 ° C'de gecede kuluçka tarafından 100 µL tepki hacmindeki NcoI ve BamHI enzimleri (iki bağımsız sindirim) kullanarak genomik DNA'ın sindirmek.
    9. Sindirim 4 µL üzerinde özel jel (% 0,8 özel) tam sindirim onay için çalıştırın.
    10. 1/10 birim sodyum asetat 3 M çözüm pH 5.2 ve 2 hacimli % 100 etanol kısıtlama sindirim reaksiyonları için ekleme ve en az 2 h kuluçkaya veya bir DNA çökelti-20 ° C'de gece.
      Not: Protokol burada duraklatılmış.
    11. 13.400 x g 20 dk için 4 ° C'de, santrifüj kapasitesi, supernatants atmak ve granül % 70 etanol ile yıkayın. Hava Pellet kuru oda sıcaklığında izin. Alternatif olarak, bir vakum yoğunlaştırıcı kullanın.
    12. Granül 20 µL distile su içinde resuspend ve sindirilmiş DNA % 0,8 özel jel üzerinde yük.
      Not: Daha iyi bir çözünürlük sindirilir DNA için jel en az 15 cm uzun hazırlamak ve gecede alçak gerilim (̴30 volt) çalıştırın. Kurmak Elektroforez optimize edilmelidir.
    13. Ertesi gün, jel gibi etidyum bromür 1 µL/10 mL son konsantrasyon, oda sıcaklığında 30 dakika, bir DNA etiketleme aracı ile leke ve enstrüman Imaging bir jel üzerinde jel yakın cetvelle fotoğrafını çek.
    14. DNA transferini bir naylon membran ayarla ve membran hibridizasyon standart prosedürler21kullanarak bir MS2 fingerprinting sonda ile gerçekleştirebilirsiniz.
    15. PCR, DNA sekanslama ve Güney pozitif klonlar leke birinden (sonraki adıma bakın) iki dondurma tabak çözülme.
  6. Çözdürme klonları
    1. 5 mL, önceden ısıtılmış Ham'ın F - 12 K içeren bir 15 mL Tüp hazırlayın (Kaighn'ın) orta %10 FBS, 2 mM L-glutamin, penisilin (orta mL başına 0.5 birim) ve streptomisin (orta mL başına 0.2 µg) her klon çözdürülen için ile desteklenmiştir.
    2. Bir dondurma plakaların-80 ° çıkarmak ve önceden ısıtılmış F12K tam orta 100 µL de çözdürülen için olumlu klon içeren için ekleyin.
      Not: Bu yordam hızlı bir şekilde uygulanmalıdır ve her klon, diğer klonlar donmuş kalmasını sağlamak amacıyla çözdürülen sonra 96 iyi plaka Kuru buz üzerinde yer almalıdır. Birden fazla klon aynı 96 iyi plaka çözdürülen gerekiyorsa, bu özellikle önemlidir.
    3. Hücreleri orta ve oda sıcaklığında 5 min için vasıl 800 x g santrifüj 5 mL içeren 15 mL tüp aktarın.
    4. Orta Aspire edin, önceden ısıtılmış tam F12K orta 500 µL hücrelerde resuspend ve her klon 12 iyi plaka tek bir şey için transfer.
  7. Paromisin direnç gen MS2 kaset üzerinden kaldırılması subtelomere 15q entegre.
    1. Klonlar tam F12K ortamda 10 cm çanak 12 iyi tabağı büyümeye izin.
      Not: Paromisin ortamda aksi belirtilmedikçe dahil edilmemesini.
    2. 10 cm çanak tam F12K orta 10 ml % 70 izdiham, kültürlü hücrelerde Cre ifade adenovirus ekleyin.
      Not: Cre-GFP ifade adenovirus kullanmak % 100 yaklaşım gerektiğini enfeksiyon verimliliğini değerlendirilmesi olanak tanır. Çoğaltma-arızalı adenovirus kültür kaç pasajlar sonra kaybolur.
    3. 48 saat sonra enfeksiyon, üç 10 cm yemeklerinde hücreleri bölün. Paromisin içeren hücrelerde büyüyen negatif seçime göre iki tabak paromisin gen Temizleme doğrulaması için kullanılacak Orta (ilk yemek) ve Güney tarafından (ikinci çanak) leke.
    4. Hücre dondurma ve RNA ayıklama için klon içeren üçüncü yemek kültürü.

3. TERRA-MS2 transkript ifade RT-qPCR tarafından doğrulanması

  1. Paromisin gen kaldırma doğrulama toplam RNA çekme--dan TERRA-MS2 klonlar organik çözücüler (fenol ve guanidin isothiocynate çözüm)21kullanarak gerçekleştirin.
    1. Bir 10 cm tabak 100 µL dietil pyrocarbonate (DEPC) su içinde çıkarılan RNA resuspend.
    2. RNA'ın 3 µL konsantrasyon ve RNA bütünlüğünü doğrulamak için bir denaturating (% 1 formaldehit içeren) 1 x 3-(N-Morpholino) propanesulfonic asit (paspas) jel üzerinde çalıştırın. Ayrıca bir spektrofotometre kullanarak RNA konsantrasyon inceliyorlar.
    3. DNaz ile RNA'ın 3 µg DNaz 1 adet kullanarak davranıyorum ben 60 µL son tepki birimindeki enzim.
    4. Reaksiyon 37 ° C'de 1 h için kuluçkaya
  2. Ters transkripsiyon tepki ve qPCR analizler
    1. Nükleaz ücretsiz microcentrifuge tüp için aşağıdaki bileşenleri ekleyin: 1 µM TERRA belirli astar, 1 µL dNTPs Mix (10 mM her), (̴300ng RNA için karşılık gelen) DNaz-tedavi RNA'ın 6 µL 2 µL. 4 µL DEPC su ile 13 µL için ses düzeyini ayarlayın.
      Not: aynı reaktifler ama TERRA belirli astar, yerine bir başvuru belirli astar içeren ikinci bir tüp her RNA analiz hazırlanmalıdır.
    2. İla 65 ° C 5 min için karışım ısı ve buz en az 1 dk. için kuluçkaya.
    3. Tüpler içeriğini tarafından kısa aralıklarla toplamak ve 5 X RT enzim arabellek, 1 µL 0.1 M dithiothreitol (DTT), 1 µL RNAse inhibitörü (4 adet) ve ters transkriptaz 1 µL 4 µL ekleyin ( Tablo malzemelerigörmek).
    4. 60 dk 42 ° C'de örnekleri kuluçkaya sonra 2 µL RT tepki qPCR analizleri için kullanın.
  3. 20 µL 2 x qPCR ana mix, 2 µL cDNA şablonunun, ileri astar (10 µM), ters astar (10 µM) 1 µL ve su 6 µL 1 µL 10 µL oluşan son hacmi qPCR reaksiyon karışımı hazırlayın.
  4. QPCR reaksiyon bir thermocycler standart protokolleri21kullanarak gerçekleştirin.

4. ifade MS2 GFP retrovirüsü imalatı

  1. MS2 GFP ifade retrovirüsü üretmek için % 80'i konfluent phoenix ambalaj hücreleri retrovirüsü vektör (pBabe-MS2-GFP PURO) ve molar oranı 4:1 / kullanarak vektör (örneğin pCMV-VSVG) ifade bir env gen ifade MS2 GFP füzyon proteini ile transfect iki vektörel çizimler.
  2. Ertesi gün, (DMEM FBS, 2 mM L-glutamin ve kalem/Strep % 10 ile desteklenmiş) kodlamayla orta ile taze orta içeren 10 mM sodyum bütrat değiştirin.
  3. 37 ° c, % 5 CO2, 8 h için kuluçkaya sonra taze kodlamayla orta virüs toplanan gireceği orta yerine.
  4. 48 saat sonra phoenix hücrelerden retrovirüsü içeren orta kaldırma. Bu orta doğrudan TERRA-MS2 klonlar enfeksiyon için kullanılabilir, bu durumda orta 0,45 µm filtre, polybrene (30 µg/mL nihai toplama) ekleyin ve bu hücrelerde (Bu durumda protokol 5 adımda devam eder) ekleyin. Alternatif olarak, retrovirüs bir 50 mL şahin tüpe 1/5inci birimi % 50 PEG-8000/900 mm NaCl çözüm ekleme ve bir gecede bir rotator tekerlek üzerinde 4 ° C'de kuluçka çöktürülmüş.
  5. Ertesi gün, Pelet retrovirüsü moleküller tarafından Santrifüjü 2.000 x g 30 dk için de süpernatant kaldırmak ve Pelet serum olmadan F12K ortamda resuspend.
    Not: Virüs partikülleri içinde 1/100th orijinal süpernatant hacminin resuspended. Bir enfeksiyon test retrovirüsü verimli bir şekilde hücreleri enfekte için gereken en küçük birim doğrulamak için yapılmalıdır.

5. TERRA-MS2 transkript canlı hücrelerdeki görselleştirme

  1. TERRA-MS2 klonlar ve cam popolu yemekleri hücrelerde WT AGS plaka. Enfeksiyon günü, polybrene (30 µg/mL nihai toplama) orta ve MS2 GFP ifade retrovirüsü ekleyin.
  2. 24 saat sonra virüs içeren orta atın ve fenol kırmızısı olmadan taze orta ekleyin.
  3. Hücreler uygun mikroskop ayarı kullanarak bir ters mikroskobu, analiz. Görüntü 100 X hücrelerle veya 60 X amacı ile büyük sayısal diyafram (1.4 X) ve hassas kamera (EMCCD) kullanarak. Bir çevresel kontrol sistemi örnekleri CO2 37 ° C ve %5, görüntüleme sırasında korumak için kullanın.

Sonuçlar

Şekil 1 deneysel stratejisi genel bir bakış temsil eder. Protokol ve TERRA-MS2 klonlar AGS hücrelerdeki nesil için Gösterge niteliğindeki bir zaman çizelgesi ana adımları (Şekil 1A) gösterilir. Gün 1, 6 iyi tabakta birden çok kuyu MS2 kaset ve sgRNA/Cas9 ( Şekil 1'Bgösterilen) vektörel çizimler ifade ile transfected. İki farklı subte...

Tartışmalar

Bu makalede biz insan kanser hücre klonlar subtelomere 15q içinde entegre MS2 dizileri içeren oluşturmak için bir yöntem mevcut. Bu klonlar kullanma, subtelomere 15q transkripsiyonu MS2 öğesini TERRA molekülleri floresans mikroskobu tarafından MS2 GFP füzyon protein ortak ifade tarafından tespit edilir. Bu yaklaşım tek bir ifade TERRA dinamiklerini incelemek araştırmacılar sağlar telomer yaşayan hücreleri21. Bu protokol için TERRA-MS2 klonlar TERRA, TERRA ifade upregulated ins...

Açıklamalar

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının ilan

Teşekkürler

CIBIO Trento Üniversitesi, gelişmiş görüntüleme tesis ve Viyana BioOptics ışık mikroskobu tesiste Max F. Perutz Laboratuvarları (MFPL), personel için minnettarız. Bu sonuçlar için önde gelen araştırma Mahlke-Obermann Vakfı ve Avrupa Birliği'nin yedinci çerçeve programı araştırma, teknolojik gelişim ve gösteri için hibe sözleşmesi kapsamında hiçbir 609431 EC için fon aldı EC bir Rita Levi Montalcini bursu Eğitim Üniversite ve araştırma (MIUR) İtalyanca Bakanlığı tarafından desteklenmektedir.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
AGS cells--Gift from Christian Baron (Université de Montréal).
F12K Nut Mix 1XGIBCO21127022Culturing medium for AGS cells
L-Glutamine CORNINGMT25005CIComponent of cell culturing medium
Penicillin Streptomycin SolutionCORNING30-002-CIComponent of cell culturing medium
Fetal Bovine SerumSigma AldrichF2442Component of cell culturing medium
DMEM 1XGIBCO21068028culturing medium for phoenix cell
CaCl2Sigma AldrichC1016used in phoenix cell transfection
HEPESSigma AldrichH3375used in phoenix cell transfection (HBS solution)
KClSigma AldrichP9333used in phoenix cell transfection (HBS solution)
DextroseSigma AldrichD9434used in phoenix cell transfection (HBS solution)
NaClSigma AldrichS7653used in phoenix cell transfection (HBS solution) and retrovirus precipitation
Na2HPO4Sigma AldrichS3264used in phoenix cell transfection (HBS solution)
TRYPSIN EDTA SOLUTION 1XCORNING59430Cused in cell split
DPBS 1XGIBCO14190250Dulbecco's Phosphate Buffered Saline
DMSOSigma AldrichD8418Component of cell freezing medium (80% FBB and 20% DMSO)
G-418 DisulphateFormediumG4185selection drug for 
Gelatin solution BioreagentSigma AldrichG1393cotaing of 96 well DNA plate and freezing plate
Tris-baseFisher BioReagents10376743Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction
EDTASigma AldrichE6758Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction
SDSSigma Aldrich71729Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction
Proteinase KThermo FisherAM2546Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction
RNAse AThermo Fisher12091021RNA degradation during DNA extraction
AgaroseSigma AldrichA5304DNA gel preparation
Atlas ClearSightBioatlasBH40501Stain reagent used for detecting DNA and RNA samples in agarose gel
ethanolFisher BioReagentsBP28184DNA precipitation
Sodium Acetate Sigma Aldrich71196Used for DNA precipitation at a 3M concentration pH5.2
Wizard SV Gel and PCR clean-Up systemPromegaA9282Extraction of PCR fragments from agarose gel during PCR screening of neomycin positive clones
TrizolAMBION15596018Organic solvent used for RNA extraction
Dnase ITHERMO SCIENTIFIC89836degradation of genomic DNA from RNA 
dNTPs mixInvitrogen10297018used in RT and PCR reactions
DTTInvitrogen707265MLused in RT reactions
diethyl pyrocarbonateSigma AldrichD5758used to inactivate RNAses in water (1:1000 dilution)
RibolockThermo FisherEO0381RNase inhibitor
MOPSSigma AldrichM9381preparation of RNA gel
ParaformaldehydeElectron Microscopy Sciences15710preparation of denaturating RNA gel (1% PFA in 1x MOPS)
Superscript III Reverse transcriptaseInvitrogen18080-093Retrotranscription reaction
Pfu DNA polymerase (recombinant)Thermo ScientificEP0501PCR reaction
2X qPCRBIO SyGreen Mix Separate-ROXPCR BIOSYSTEMSPB 20.14qPCR reaction
Cre-GFP adenovirushttps://medicine.uiowa.edu/vectorcore1174-HTused to infect TERRA-MS2 clones in order to remove the neomycn gene
Sodium ButyrateSigma AldrichB5887used to promote retrovirus particles production in phoenix cells
PEG8000Sigma Aldrich89510Precipitation of retrovirus partcles
35µ-Dish Glass BottomIbidi81158used in live cell imaging analyses of TERRA-MS2 clones

Referanslar

  1. Azzalin, C. M., Reichenbach, P., Khoriauli, L., Giulotto, E., Lingner, J. Telomeric repeat containing RNA and RNA surveillance factors at mammalian chromosome ends. Science. 318 (5851), 798-801 (2007).
  2. Schoeftner, S., Blasco, M. A. Developmentally regulated transcription of mammalian telomeres by DNA-dependent RNA polymerase II. Nature Cell Biology. 10 (2), 228-236 (2008).
  3. Diman, A., Decottignies, A. Genomic origin and nuclear localization of TERRA telomeric repeat-containing RNA: from Darkness to Dawn. FEBS Journal. , (2017).
  4. Arnoult, N., Van Beneden, A., Decottignies, A. Telomere length regulates TERRA levels through increased trimethylation of telomeric H3K9 and HP1alpha. Nature Structural & Molecular Biology. 19 (9), 948-956 (2012).
  5. Montero, J. J., et al. TERRA recruitment of polycomb to telomeres is essential for histone trymethylation marks at telomeric heterochromatin. Nature Communications. 9 (1), 1548 (2018).
  6. Beishline, K., et al. CTCF driven TERRA transcription facilitates completion of telomere DNA replication. Nature Communications. 8 (1), 2114 (2017).
  7. Arora, R., et al. RNaseH1 regulates TERRA-telomeric DNA hybrids and telomere maintenance in ALT tumour cells. Nature Communications. 5, 5220 (2014).
  8. Balk, B., et al. Telomeric RNA-DNA hybrids affect telomere-length dynamics and senescence. Nature Structural & Molecular Biology. 20 (10), 1199-1205 (2013).
  9. Graf, M., et al. Telomere Length Determines TERRA and R-Loop Regulation through the Cell Cycle. Cell. 170 (1), 72-85 (2017).
  10. Lee, Y. W., Arora, R., Wischnewski, H., Azzalin, C. M. TRF1 participates in chromosome end protection by averting TRF2-dependent telomeric R loops. Nature Structural & Molecular Biology. , (2018).
  11. Moravec, M., et al. TERRA promotes telomerase-mediated telomere elongation in Schizosaccharomyces pombe. EMBO Reports. 17 (7), 999-1012 (2016).
  12. Cusanelli, E., Romero, C. A., Chartrand, P. Telomeric noncoding RNA TERRA is induced by telomere shortening to nucleate telomerase molecules at short telomeres. Molecular Cell. 51 (6), 780-791 (2013).
  13. Moradi-Fard, S., et al. Smc5/6 Is a Telomere-Associated Complex that Regulates Sir4 Binding and TPE. PLoS Genetics. 12 (8), e1006268 (2016).
  14. Chu, H. P., et al. TERRA RNA Antagonizes ATRX and Protects Telomeres. Cell. 170 (1), 86-101 (2017).
  15. Lai, L. T., Lee, P. J., Zhang, L. F. Immunofluorescence protects RNA signals in simultaneous RNA-DNA FISH. Experimental Cell Research. 319 (3), 46-55 (2013).
  16. Zhang, L. F., et al. Telomeric RNAs mark sex chromosomes in stem cells. Genetics. 182 (3), 685-698 (2009).
  17. Gallardo, F., Chartrand, P. Visualizing mRNAs in fixed and living yeast cells. Methods in Molecular Biology. 714, 203-219 (2011).
  18. Querido, E., Chartrand, P. Using fluorescent proteins to study mRNA trafficking in living cells. Methods in Cell Biology. 85, 273-292 (2008).
  19. Cusanelli, E., Chartrand, P. Telomeric noncoding RNA: telomeric repeat-containing RNA in telomere biology. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 5 (3), 407-419 (2014).
  20. Perez-Romero, C. A., Lalonde, M., Chartrand, P., Cusanelli, E. Induction and relocalization of telomeric repeat-containing RNAs during diauxic shift in budding yeast. Current Genetics. , (2018).
  21. Avogaro, L., et al. Live-cell imaging reveals the dynamics and function of single-telomere TERRA molecules in cancer cells. RNA Biology. , 1-10 (2018).
  22. Ran, F. A., et al. Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity. Cell. 154 (6), 1380-1389 (2013).
  23. Yamada, T., et al. Spatiotemporal analysis with a genetically encoded fluorescent RNA probe reveals TERRA function around telomeres. Scientific Reports. 6, 38910 (2016).
  24. Deng, Z., et al. Formation of telomeric repeat-containing RNA (TERRA) foci in highly proliferating mouse cerebellar neuronal progenitors and medulloblastoma. Journal of Cell Science. 125 (Pt 18), 4383-4394 (2012).
  25. Casini, A., et al. A highly specific SpCas9 variant is identified by in vivo screening in yeast. Nature Biotechnology. 36 (3), 265-271 (2018).
  26. Nergadze, S. G., et al. CpG-island promoters drive transcription of human telomeres. RNA. 15 (12), 2186-2194 (2009).
  27. Porro, A., et al. Functional characterization of the TERRA transcriptome at damaged telomeres. Nature Communications. 5, 5379 (2014).
  28. Farnung, B. O., Brun, C. M., Arora, R., Lorenzi, L. E., Azzalin, C. M. Telomerase efficiently elongates highly transcribing telomeres in human cancer cells. PLoS One. 7 (4), e35714 (2012).
  29. Flynn, R. L., et al. Alternative lengthening of telomeres renders cancer cells hypersensitive to ATR inhibitors. Science. 347 (6219), 273-277 (2015).
  30. Scheibe, M., et al. Quantitative interaction screen of telomeric repeat-containing RNA reveals novel TERRA regulators. Genome Research. 23 (12), 2149-2157 (2013).
  31. Bolland, D. J., King, M. R., Reik, W., Corcoran, A. E., Krueger, C. Robust 3D DNA FISH using directly labeled probes. Journal of Visualized Experiments. (78), (2013).
  32. Masui, O., et al. Live-cell chromosome dynamics and outcome of X chromosome pairing events during ES cell differentiation. Cell. 145 (3), 447-458 (2011).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Genetiksay 143uzun kodlamayan RNATERRAtelomerkanserCRISPR Cas9MS2 GFPcanl h cre g r nt leme

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır