Generazione di cloni delle cellule di cancro per visualizzare Telomeric Repeat-contenente RNA TERRA espresso da un singolo dei telomeri nelle cellule viventi

Riepilogo

Qui, presentiamo un protocollo per generare cloni delle cellule di cancro che contiene un tag di sequenza MS2 presso un singolo subtelomeriche. Questo approccio, basandosi sul sistema MS2-GFP, permette la visualizzazione delle trascrizioni endogene di telomerica ripetizione-contenente RNA (TERRA) espresso da un singolo telomero in cellule viventi.

Abstract

I telomeri sono trascritti, dando luogo a telomeric repeat-contenente RNA lunghi non codificanti (TERRA), che sono state proposte per svolgere un ruolo importante nella biologia del telomero, tra cui la formazione dell'eterocromatina e nell'omeostasi di lunghezza del telomero. Recenti scoperte hanno rivelato che TERRA molecole interagiscono anche con interne regioni cromosomiche per regolare l'espressione genica in cellule staminali embrionali (ES) del topo. In linea con questa prova, RNA fluorescenza in situ di ibridazione (RNA-pesce) analisi hanno mostrato che solo un sottoinsieme di TERRA trascrizioni localizzare alle estremità del cromosoma. Una migliore comprensione delle dinamiche di molecole TERRA vi aiuterà a definire la loro funzione e meccanismi di azione. Qui, descriviamo un metodo per etichettare e visualizzare trascrizioni TERRA di singolo-telomero in cellule di cancro usando il sistema di MS2-GFP. A questo scopo, vi presentiamo un protocollo per generare cloni stabili, utilizzando la linea cellulare del cancro AGS stomaco umano, che contiene le sequenze di MS2 integrate a un singolo subtelomeriche. Trascrizione di TERRA dal telomero MS2-etichetta provoca l'espressione di molecole TERRA MS2-Tag che vengono visualizzate da microscopia di fluorescenza di cellule vive al momento di co-espressione di una proteina di legame al RNA MS2-fusa a GFP (MS2-GFP). Questo approccio consente ai ricercatori di studiare la dinamica delle single-telomero TERRA molecole nelle cellule tumorali, e può essere applicato ad altre linee cellulari.

Introduzione

La TERRA di RNA lunghi non codificanti è trascritto dalla regione subtelomerica dei cromosomi e la trascrizione procede verso le estremità del cromosoma, che chiude all'interno del tratto di ripetizione telomerica^1,2. Per questo motivo, trascrizioni TERRA sono costituiti da sequenze subtelomeric derivata alla loro estremità 5' e terminare con ripetizioni telomeriche (UUAGGG nei vertebrati)³. Importanti ruoli sono stati proposti per TERRA, tra cui la formazione dell'eterocromatina presso i telomeri^4,5, DNA replication⁶, promuovendo una ricombinazione omologa tra cromosoma termina^{7,8 , 9}, regolazione del telomero struttura¹⁰e lunghezza del telomero omeostasi^2,11,12,13. Inoltre, trascrizioni TERRA interagiscono con numerosi siti di extratelomeric alla regolazione dell'espressione genica diffusa di cellule staminali embrionali (ES) del mouse¹⁴. In linea con queste prove, ibridazione in situ di fluorescenza RNA (RNA-pesce) analisi hanno mostrato che solo un sottoinsieme delle trascrizioni TERRA di localizzare a telomeri^1,2,15. Inoltre, la TERRA è stata segnalata a formare aggregati nucleari localizzazione presso i cromosomi X e Y del mouse le celle^2,16. Questi risultati indicano che le trascrizioni TERRA subiscono complesse dinamiche all'interno del nucleo. Comprensione delle dinamiche delle molecole TERRA vi aiuterà a definire la loro funzione e meccanismi di azione.

Il sistema di MS2-GFP è stato ampiamente utilizzato per visualizzare le molecole di RNA in cellule viventi da vari organismi^17,18. Questo sistema è stato utilizzato in precedenza per tag e visualizzare le molecole TERRA di singolo-telomero in S. cerevisiae^12,19. Utilizzando questo sistema, è stato recentemente dimostrato che le trascrizioni TERRA di lievito localizzare all'interno del citoplasma durante la fase di spostamento post-Coelho, suggerendo che la TERRA possa esercitare funzioni extranucleari²⁰. Noi abbiamo recentemente utilizzato il sistema di MS2-GFP per studiare le trascrizioni TERRA di singolo-telomero in cancro cellule²¹. A questo scopo, abbiamo impiegato lo strumento di modifica di genoma CRISPR/Cas9 di integrare MS2 sequenze a un singolo telomero (telomero 15q, qui di seguito Tel15q) ed abbiamo ottenuto cloni che esprimono MS2-etichettate endogene Tel15q TERRA (TERRA-MS2 cloni). Co-espressione di una proteina legante il RNA MS2 fusi con GFP (MS2-GFP) che riconosce e lega RNA MS2 sequenze consente visualizzazione delle trascrizioni di singolo-telomero TERRA in vita cellule²¹. Lo scopo del protocollo illustrato qui è quello di descrivere in dettaglio i passaggi necessari per la generazione di cloni di TERRA-MS2.

Per generare cloni di TERRA-MS2, una cassetta di MS2 è integrata all'interno della regione subtelomerica del telomero 15q, a valle del sito di inizio TERRA promotore regione e trascrizione. La cassetta di MS2 contiene un gene di resistenza di neomicina affiancato da siti lox-p, e la sua integrazione a subtelomeriche 15q viene eseguita utilizzando il sistema CRISPR/Cas9²². Dopo trasfezione di MS2 cassetta, singolo cloni sono selezionati e subtelomeric integrazione della cassetta è verificato mediante PCR, DNA sequencing e Southern blot. Cloni positivi sono infettati con un adenovirus che esprimono Cre al fine di rimuovere il marcatore di selezione nel cassetto, lasciando solo sequenze di MS2 e un sito singolo lox-p a subtelomeriche 15q. Espressione delle trascrizioni TERRA MS2-contrassegnati da Tel15q è verificata da RT-qPCR. Infine, si esprime la proteina di fusione GFP-MS2 in TERRA-MS2 cloni tramite infezione retrovirale per visualizzare trascrizioni MS2-TERRA mediante microscopia a fluorescenza. Trascrizioni TERRA possono essere facilmente individuate da RNA-pesce e cellule vive imaging utilizzando telomeric repeat specifiche sonde^1,2,15,23. Questi approcci forniscono importanti informazioni sulla localizzazione della popolazione totale di molecole TERRA a risoluzione di singola cellula. La generazione di cloni contenenti sequenze di MS2 presso un singolo subtelomeriche permetterà ai ricercatori di studiare le dinamiche delle trascrizioni TERRA di singolo-telomero in cellule viventi, che contribuiranno a definire la funzione e meccanismi di azione di TERRA.

Protocollo

1. Selezione di cloni resistenti neomicina

1. Crescere le cellule AGS in medium F-12_K di Ham (Kaighn) completate con 10% siero bovino fetale (FBS), 2 mM L-Glutammina, penicillina (0,5 unità per mL di terreno) e streptomicina (0,2 µ g / mL di medium) a 37 ° C e 5% CO₂. Transfect le cellule in una confluenza di 50-60% con il sgRNA/Cas9 esprimendo vettoriale e la cassetta di MS2 presso un 01:10 rapporto molare²¹.
   Nota: In un esperimento parallelo, verificare l'efficienza di trasfezione di trasfezione un vettore che esprimono GFP (cioè, Cas9-GFP vector). Almeno 60-70% di efficienza di trasfezione dovrebbe essere realizzato.
2. Il giorno seguente, sostituire il mezzo di coltura con mezzo contenente neomicina alla concentrazione finale a 0,7 µ g/mL (mezzo selettivo).
   Nota: Spaccare le cellule e li semina in terreno selettivo il giorno dopo trasfezione permetterà di accelerare il processo di selezione. Tutte le cellule trasfettate con non morirà immediatamente. Se transfezione avviene in 6 piastre a pozzetti, nel qual caso ciascun pozzetto a un 60% confluenza dovrebbe contenere circa 0,7 x 10⁶ celle, il giorno seguente che le celle possono essere suddivise da un singolo pozzo di terreno selettivo contenente 10 cm piatto.
3. Mantenere le cellule in terreno selettivo per 7-10 giorni, cambiando mezzo ogni uno o due giorni, fino al singolo cloni sono visibili.
4. Raccolta di cloni cellulari
   1. Preparare un piatto ben 96 contenente 10 µ l di 0,25% tripsina in ciascun pozzetto.
      Nota: Preparare due 96 pozzetti nel caso in cui più di 96 cloni devono essere selezionati.
   2. Con l'uso di un microscopio, segnare la posizione di ogni clone visibile nel piatto 10 cm facendo un punto nella parte inferiore del piatto con un pennarello. Ogni punto corrisponderà ad una colonia di essere raccolti.
   3. Sostituire il mezzo di coltura con appena sufficiente fosfato tamponata (PBS) forma una pellicola sottile di liquido sui cloni e non lasciare che le celle a secco durante la raccolta di clone.
   4. Scegliere singole colonie utilizzando una pipetta 10 µ l. Collegare il puntale contenente 5 µ l di tripsina alla Colonia e rilasciare lentamente la tripsina che rimarrà localizzata sulla Colonia. Consentire la tripsina staccare le cellule per 1 min, poi raschiare la Colonia con la punta e succhiano la punta.
      Nota: Durante questa procedura, lanciando il piatto un po' su un lato quindi per diminuire il volume di PBS attorno alla Colonia essendo scelto aiuterà il processo di prelievo evitando di diluire la tripsina attorno alla Colonia. Utilizzando un anello di clone può anche aiutare a raccogliere singoli cloni.
   5. Inserire le celle dalla Colonia in un pozzetto della piastra ben 96 contenente 10 µ l di 0,25% tripsina.
   6. Incubare per 5 minuti a temperatura ambiente, quindi riempire il pozzetto con 150 µ l di terreno selettivo (medio F - 12K di Ham (Kaighn) completati con 10% FBS, 2 mM L-Glutammina, penicillina (0,5 unità per mL di terreno), streptomicina (0,2 µ g / mL di medium) e contenenti neomicina presso una concentrazione di 0,7 µ g/mL.
      Nota: Durante il periodo di incubazione possono essere selezionati altri cloni. Si raccomanda di prendere come molti cloni come possibile. Vengono raccolti i cloni più maggiore sarà la probabilità di identificare quelli positivi.
   7. Una volta che tutti i cloni sono raccolti e trasferiti nella piastra ben 96, permettono alle cellule di crescere per un paio di giorni in mezzo selettivo F - 12K di Ham (Kaighn), supplementato con 10% FBS, 2 mM L-Glutammina, penicillina (0,5 unità per mL di terreno), streptomicina (0,2 µ g / mL del mezzo) e contenenti neomicina ad una concentrazione di 0,7 µ g/mL a 37 ° C e 5% CO₂, fino a raggiungere la confluenza del 90%.
5. Suddivisione dei cloni
   1. Preparare tre 96 pozzetti rivestiti con gelatina aggiungendo 100 µ l di gelatina per pozzetto, incubare a temperatura ambiente per 30 minuti, quindi lavare due volte con PBS. Queste piastre verranno utilizzate per l'estrazione del DNA (piastra di DNA) e per clone congelamento (piastre di congelamento).
      Nota: Gelatina promuoverà l'allegato delle cellule e del DNA ai pozzetti. In particolare, il rivestimento di gelatina consentirà il DNA di attaccare nella parte inferiore dei pozzetti durante l'estrazione di DNA e lavare le procedure (discusse sotto). Durante la procedura di divisione di clone, si consiglia di utilizzare una pipetta multicanale.
   2. Una volta che cloni raggiungono 90% confluenza, aspirare medio da ciascun pozzetto della piastra ben 96, lavare con PBS, aggiungere 30 µ l di 0,25% tripsina per pozzetto e incubare per 5 min a 37 ° C.
      Nota: Cloni crescerà a ritmi diversi, che dipenderanno anche il numero di cellule raccolte al clone. Così, questo passaggio verrà eseguito durante i diversi giorni quando i diversi cloni raggiungono la confluenza del 90%.
   3. Aggiungere 70 µ l di terreno selettivo per pozzetto, perturbare grumi di cellule pipettando su e giù all'interno dei pozzetti, quindi trasferire 30 µ l della 100 µ l alla piastra di DNA gelatinizzata preriempita con 120 µ l di terreno selettivo per bene e 30 µ l al wit preriempita piastre congelamento gelatinizzato medio di µ l di h 50 (senza selezione).
   4. Posizionare la piastra di DNA nell'incubatrice e permettono alle cellule di crescere a 37 ° C e 5% CO₂ fino al 90% confluenza.
   5. Aggiungere 80 µ l di ghiacciata preparata 2x congelamento medio (80% FBS e 20% solfossido dimetilico (DMSO)) in ciascun pozzetto della piastra congelamento, parafilm (spruzzato con etanolo al 70%) sopra la piastra così per sigillare ogni bene, mettere il coperchio sulla parte superiore e avvolgere la piastra con un foglio di alluminio. Posizionare le piastre di congelamento a-80 ° C.
   6. Aggiungere 90 µ l di terreno selettivo per pozzetto alla piastra ben 96 originale contenente i cloni che sono stati suddivisi e tenerlo in coltura fino al PCR risultati dello screening. Piastrina d'appoggio fungerà da questo piatto.

2. lo screening di cloni resistenti neomicina

1. Estrazione del DNA dalla piastra di DNA ben 96.
   1. Una volta che i cloni coltivati nella piastra di DNA raggiungono 90% confluenza, lavare 2 volte con PBS, quindi lisare con 50 µ l di tampone lisi (10 mM Tris-HCl pH 7.5, 10 mM EDTA, 10 millimetri di NaCl, 0,5% SDS e proteinasi K di 1 mg/mL). Coprire la piastra con parafilm, sigillando ogni bene, mettere il coperchio, coprire con pellicola trasparente e posto a 37 ° C durante la notte.
   2. Aggiungere 100 µ l di etanolo freddo (Et-OH) / soluzione di NaCl (0,75 M di NaCl in 100% etanolo) a ciascun bene e precipitare per 6 h o una notte a temperatura ambiente.
      Nota: Il protocollo può essere messo in pausa qui.
   3. Rimuovere la soluzione di NaCl/Et-OH invertendo la piastra e lavare 3 volte con 200 µ l di etanolo al 70% per pozzetto.
   4. Aggiungere 25 µ l di soluzione di RNasi A in acqua distillata e incubare a 37 ° C per 1 h.
2. Utilizzare 3 µ l di DNA genomico per l'amplificazione di PCR. Eseguire lo screening di PCR dei cloni selezionati utilizzando primers ricottura all'interno del gene di resistenza di neomicina e subtelomeriche 15q. L'amplificazione di PCR viene eseguita utilizzando gli enzimi della polimerasi standard e protocolli PCR²¹.
   Nota: Condizioni di PCR per MS2 primer (primer MS2-subtel15q-primer-S e MS2 come) e gli iniettori CTR (CTR prime S e primer CTR come) sono i seguenti: 98 ° C per 20 s come punto di denaturazione e quindi 34 cicli a 98 ° C 10 s, 58° C 20 s, 72 ° C 15 s , utilizzando enzima polimerasi in un 25 µ l reazione mescolare (Vedi Tabella materiali). Sequenze dell'iniettore sono indicati nella tabella 1.
3. Eseguire reazioni di PCR su gel di agarosio ed estrarre fasce PCR ottenuti da cloni positivi utilizzando le procedure di estrazione standard del gel (Vedi Tabella materiali per reagenti di estrazione del gel).
4. Eseguire analisi di sequenziamento del DNA del prodotto della PCR gel-estratta per la conferma della presenza di sequenze MS2²¹.
   Nota: L'analisi di sequenziamento possono essere eseguite utilizzando i primers utilizzati per lo screening di PCR.
5. Proiezione del sud della macchia di cloni positivi di PCR
   1. Crescere i cloni positivi alla PCR e di sequenziamento screening dalla piastra ben 96 originale (la piastrina d'appoggio) per ben 6 piastre in F - 12K di Ham (Kaighn), supplementato con 10% FBS, 2 mM L-Glutammina, penicillina (0,5 unità per mL di terreno), streptomicina (0,2 µ g / mL di terreno) e contenenti neomicina ad una concentrazione di 0,7 µ g/mL a 37 ° C 5% CO₂.
      Nota: In alternativa, se alcuni di questi cloni sono stati persi, scongelare li da una delle piastre congelamento (Vedi protocollo 2.6).
   2. Una volta che i cloni sono al 90% confluenza nella piastra ben 6, lavare le cellule con PBS e aggiungere 250 µ l di tampone di lisi contenente 0,5 µ g proteinasi K per pozzetto.
   3. Raschiare le celle utilizzando un raschietto di cella e trasferire il lisato in una provetta da 1,5 mL.
   4. Incubare a 37 ° C per 16 h.
   5. Aggiungere 1 mL di etanolo al 100%, agitare vigorosamente e consentire il DNA per precipitare almeno 2 ore o durante la notte a-20 ° C.
      Nota: Il protocollo può essere messo in pausa qui.
   6. Spin a 13.400 x g a 4 ° C per 10 minuti, eliminare il surnatante e lavare il pellet con etanolo al 70%. Lasciare asciugare a temperatura ambiente l'aria di pellet. In alternativa, utilizzare un concentratore a vuoto.
   7. Risospendere il pellet di DNA in 50 µ l di acqua distillata contenente RNasi A e incubare per 1h a 37 ° C.
   8. Digerire il 5-10 µ g di DNA genomico mediante enzimi di restrizione NcoI e BamHI (due digestioni indipendente) in 100 µ l di reazione incubando le reazioni di digestione a 37 ° C durante la notte.
   9. Eseguire 4 µ l della digestione su gel di agarosio (0,8% agarosio) per la conferma di digestione completa.
   10. Aggiungere 1/10 di volume di sodio acetato 3M soluzione pH 5.2 e 2 volumi di etanolo al 100% per le reazioni di digestione di limitazione e incubare almeno 2 ore o durante la notte a-20 ° C per precipitare il DNA.
       Nota: Il protocollo può essere messo in pausa qui.
   11. Centrifugare a 13.400 x g a 4 ° C per 20 min, eliminare i sovranatante e lavare il pellet con etanolo al 70%. Lasciare asciugare il pellet all'aria a temperatura ambiente. In alternativa, utilizzare un concentratore a vuoto.
   12. Risospendere il pellet in 20 µ l di acqua distillata e caricare il DNA digerito su gel di agarosio 0.8%.
       Nota: Per una migliore risoluzione del DNA digerito, preparare un gel almeno 15 cm lungo ed eseguire durante la notte a bassa tensione (Volt ̴30). L'elettroforesi impostata deve essere ottimizzato.
   13. Il giorno seguente, macchia il gel con un agente di etichettatura del DNA, come il bromuro di etidio alla concentrazione finale di 1 µ l/10 mL, per 30 min a temperatura ambiente e scattare una foto con un righello vicino il gel su un gel di strumento di imaging.
   14. Impostare il trasferimento di DNA su una membrana di nylon ed eseguire l'ibridazione della membrana con una sonda di sequenza-specific MS2 utilizzando le procedure standard²¹.
   15. Scongelare i cloni che sono positivi alla PCR, DNA sequencing e Southern blot da una delle due piastre congelamento (Vedi punto successivo).
6. Lo scongelamento dei cloni
   1. Preparare una provetta da 15 mL contenente 5 mL di pre-riscaldato di Ham F - 12K medium (di Kaighn) supplementato con 10% FBS, 2 mM L-Glutammina, penicillina (0,5 unità per mL di terreno) e streptomicina (0,2 µ g / mL di medium) per ogni clone essere scongelati.
   2. Rimuovere una delle piastre congelamento da-80 ° e aggiungere 100 µ l di terreno completo di pre-riscaldato F12K al bene contenente il clone positivo per essere scongelati.
      Nota: Questa procedura deve essere eseguita rapidamente e appoggiare la piastra ben 96 su ghiaccio secco dopo ogni clone è scongelato, al fine di consentire gli altri cloni di rimanere congelati. Ciò è particolarmente importante se più cloni devono essere scongelati dallo stesso piatto ben 96.
   3. Trasferire le cellule per il tubo da 15 mL contenente 5 mL di medium e centrifuga a 800 x g per 5 min a temperatura ambiente.
   4. Aspirare il mezzo, risospendere le cellule in 500 µ l di terreno F12K completo pre-riscaldato e trasferire ogni clone in un unico pozzetto di una piastra ben 12.
7. Eliminazione del gene di resistenza neomicina dal cassetto MS2 integrata a subtelomeriche 15q.
   1. Consentire i cloni a crescere di un piatto ben 12 in un piatto di 10 cm nel terreno F12K completo.
      Nota: Neomicina non deve essere inclusi nel mezzo se non diversamente indicato.
   2. Aggiungere l'adenovirus Cre-esprimendo le cellule coltivate in un piatto di 10 cm alla confluenza del 70% in 10 mL di terreno completo di F12K.
      Nota: Utilizzando un adenovirus che esprimono Cre-GFP permetterà la valutazione dell'efficienza di infezione, che dovrebbe raggiungere il 100%. L'adenovirus replica-difettoso andranno perso dopo pochi passaggi in coltura.
   3. 48 ore dopo l'infezione, dividere le celle in tre piatti di 10 cm. Due piatti saranno utilizzati per la verifica della rimozione gene neomicina da selezione negativa, le celle contenenti neomicina in crescita medio (primo piatto) e da Southern blot (secondo piatto).
   4. Il terzo piatto contenente il clone per congelamento delle cellule e l'estrazione di RNA della coltura.

3. Verifica della TERRA-MS2 espressione della trascrizione di RT-qPCR

1. Al momento della verifica della rimozione del gene di neomicina, eseguire l'estrazione di RNA totale da TERRA-MS2 cloni utilizzando solventi organici (fenolo e guanidina soluzione isothiocynate)²¹.
   1. Risospendere il RNA Estratto da un piatto di 10 cm in 100 µ l di acqua di dietil pirocarbonato (DEPC).
   2. Eseguire 3 µ l di RNA su un gel di acido (MOPS) propansulfonico di denaturanti (1% formaldeide-contenenti) 1 x 3-(N-Morpholino) per verificare la concentrazione e l'integrità del RNA. Anche analizzare la concentrazione di RNA usando uno spettrofotometro.
   3. Trattare 3 µ g di RNA con dnasi I utilizzando 1 unità della dnasi I enzima in 60 µ l di reazione finale.
   4. Incubare la reazione per 1h a 37 ° C.
2. Invertire le analisi di reazione e qPCR di trascrizione
   1. Aggiungere i seguenti componenti di un tubo del microcentrifuge nucleasi-free: 2 µ l di un primer specifico di 1 µM TERRA, 1 µ l di dNTP mix (10 mM), 6 µ l di dnasi I trattati RNA (corrispondente a ̴300ng RNA). Regolare il volume a 13 µ l con 4 µ l di acqua DEPC.
      Nota: Per ogni RNA devono essere analizzate, una seconda provetta contenente i reagenti stessi ma un primer specifico di riferimento, invece di primer specifici di TERRA, deve essere preparata.
   2. Riscaldare la miscela a 65 ° C per 5 min e incubare in ghiaccio per almeno 1 min.
   3. Raccogliere il contenuto dei tubi mediante centrifugazione breve e 4 µ l di enzima 5 X RT Buffer, 1 µ l 0,1 M ditiotreitolo (DTT), 1 µ l (4 unità) dell'inibitore di RNAsi e 1 µ l della trascrittasi inversa (Vedi Tabella materiali).
   4. Incubare i campioni a 42 ° C per 60 min, quindi utilizzare 2 µ l della reazione di RT per analisi qPCR.
3. Preparare la miscela di reazione di qPCR in un volume finale di 20 µ l composto da 10 µ l di mix master di 2 x qPCR, 2 µ l di modello di cDNA, 1 µ l di primer forward (10 µM), 1 µ l di primer reverse (10 µM) e 6 µ l di acqua.
4. Eseguire qPCR reazione in un termociclatore utilizzando protocolli standard²¹.

4. produzione di un Retrovirus esprimendo MS2-GFP

1. Per generare il retrovirus esprimenti MS2-GFP, transfect 80% confluenti phoenix imballaggio di cellule con una proteina di fusione GFP-MS2 esprimendo retrovirus vettoriali (pBabe-MS2-GFP PURO) e un gene env esprimendo vettore (ad esempio pCMV-VSVG) utilizzando un rapporto molare 4:1 di i due vettori.
2. Il giorno seguente, è necessario sostituire il mezzo di coltura (DMEM supplementato con 10% FBS, 2 mM L-Glutammina e Pen/Strep) con fresca Media contenente 10mM del butirrato del sodio.
3. Incubare per 8 h a 37 ° C, 5% CO₂, quindi sostituire il mezzo con mezzo di coltura fresco da cui il virus saranno raccolto.
4. Dopo 48 h, è necessario rimuovere il mezzo contenente retrovirus dalle cellule di phoenix. Questo mezzo può essere utilizzato direttamente per l'infezione di TERRA-MS2 cloni, nel qual caso il mezzo di filtrare attraverso un filtro da 0,45 µm, aggiungere polybrene (concentrazione finale di 30 µ g/mL) e aggiungerlo alle cellule (in questo caso il protocollo continua al passo 5). In alternativa, i retrovirus possono essere precipitati in un tubo falcon 50 mL aggiungendo volume^th 1/5 del 50% PEG-8000/900 mM NaCl soluzione e incubazione overnight a 4 ° C su una ruota di rotatore.
5. Il giorno seguente, le particelle di retrovirus pellet mediante centrifugazione a 2.000 x g per 30 min, rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in F12K medium senza siero.
   Nota: Le particelle di virus possono essere risospesi in 1/100^th del surnatante volume originale. Un'infezione test dovrebbe essere eseguito al fine di verificare il volume minimo del retrovirus per infettare efficientemente le cellule necessaria.

5. visualizzazione delle trascrizioni di TERRA-MS2 in cellule viventi

1. Piastra di TERRA-MS2 cloni e cellule WT AGS in piatti con fondo di vetro. Il giorno di infezione, è necessario aggiungere polybrene il medium (concentrazione finale di 30 µ g/mL) ed il retrovirus esprime MS2-GFP.
2. Dopo 24 ore, eliminare il terreno contenenti virus e aggiungere mezzo fresco senza rosso fenolo.
3. Analizzare le cellule al microscopio invertito utilizzando l'impostazione di microscopio appropriato. Immagine delle cellule con un 100 X o obiettivo 60x con grande apertura numerica (1.4 X) e utilizzando una telecamera sensibile (EMCCD). Utilizzare un sistema di controllo ambientale per mantenere i campioni a 37 ° C e 5% CO₂ durante la formazione immagine.

Risultati

Figura 1 rappresenta una panoramica della strategia sperimentale. I passaggi principali del protocollo e un calendario indicativo per la generazione di cloni di TERRA-MS2 in cellule AGS sono illustrati (Figura 1A). Giorno 1, più pozzetti di una piastra ben 6 transfected con la cassetta di MS2 e sgRNA/Cas9 esprimendo vettori (illustrati nella Figura 1B)...

Discussione

In questo articolo presentiamo un metodo per generare cloni di cellule tumorali umane contenenti sequenze di MS2 integrati all'interno di subtelomeriche 15q. Utilizzando questi cloni, le molecole di MS2-etichetta TERRA trascritte da subtelomeriche 15q vengono rilevate da microscopia di fluorescenza di co-espressione di una proteina di fusione GFP-MS2. Questo approccio consente ai ricercatori di studiare la dinamica della TERRA espressa da un singolo dei telomeri in vita cellule²¹. In questo protoc...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
AGS cells	-	-	Gift from Christian Baron (Université de Montréal).
F12K Nut Mix 1X	GIBCO	21127022	Culturing medium for AGS cells
L-Glutamine	CORNING	MT25005CI	Component of cell culturing medium
Penicillin Streptomycin Solution	CORNING	30-002-CI	Component of cell culturing medium
Fetal Bovine Serum	Sigma Aldrich	F2442	Component of cell culturing medium
DMEM 1X	GIBCO	21068028	culturing medium for phoenix cell
CaCl2	Sigma Aldrich	C1016	used in phoenix cell transfection
HEPES	Sigma Aldrich	H3375	used in phoenix cell transfection (HBS solution)
KCl	Sigma Aldrich	P9333	used in phoenix cell transfection (HBS solution)
Dextrose	Sigma Aldrich	D9434	used in phoenix cell transfection (HBS solution)
NaCl	Sigma Aldrich	S7653	used in phoenix cell transfection (HBS solution) and retrovirus precipitation
Na2HPO4	Sigma Aldrich	S3264	used in phoenix cell transfection (HBS solution)
TRYPSIN EDTA SOLUTION 1X	CORNING	59430C	used in cell split
DPBS 1X	GIBCO	14190250	Dulbecco's Phosphate Buffered Saline
DMSO	Sigma Aldrich	D8418	Component of cell freezing medium (80% FBB and 20% DMSO)
G-418 Disulphate	Formedium	G4185	selection drug for
Gelatin solution Bioreagent	Sigma Aldrich	G1393	cotaing of 96 well DNA plate and freezing plate
Tris-base	Fisher BioReagents	10376743	Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction
EDTA	Sigma Aldrich	E6758	Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction
SDS	Sigma Aldrich	71729	Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction
Proteinase K	Thermo Fisher	AM2546	Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction
RNAse A	Thermo Fisher	12091021	RNA degradation during DNA extraction
Agarose	Sigma Aldrich	A5304	DNA gel preparation
Atlas ClearSight	Bioatlas	BH40501	Stain reagent used for detecting DNA and RNA samples in agarose gel
ethanol	Fisher BioReagents	BP28184	DNA precipitation
Sodium Acetate	Sigma Aldrich	71196	Used for DNA precipitation at a 3M concentration pH5.2
Wizard SV Gel and PCR clean-Up system	Promega	A9282	Extraction of PCR fragments from agarose gel during PCR screening of neomycin positive clones
Trizol	AMBION	15596018	Organic solvent used for RNA extraction
Dnase I	THERMO SCIENTIFIC	89836	degradation of genomic DNA from RNA
dNTPs mix	Invitrogen	10297018	used in RT and PCR reactions
DTT	Invitrogen	707265ML	used in RT reactions
diethyl pyrocarbonate	Sigma Aldrich	D5758	used to inactivate RNAses in water (1:1000 dilution)
Ribolock	Thermo Fisher	EO0381	RNase inhibitor
MOPS	Sigma Aldrich	M9381	preparation of RNA gel
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15710	preparation of denaturating RNA gel (1% PFA in 1x MOPS)
Superscript III Reverse transcriptase	Invitrogen	18080-093	Retrotranscription reaction
Pfu DNA polymerase (recombinant)	Thermo Scientific	EP0501	PCR reaction
2X qPCRBIO SyGreen Mix Separate-ROX	PCR BIOSYSTEMS	PB 20.14	qPCR reaction
Cre-GFP adenovirus	https://medicine.uiowa.edu/vectorcore	1174-HT	used to infect TERRA-MS2 clones in order to remove the neomycn gene
Sodium Butyrate	Sigma Aldrich	B5887	used to promote retrovirus particles production in phoenix cells
PEG8000	Sigma Aldrich	89510	Precipitation of retrovirus partcles
35µ-Dish Glass Bottom	Ibidi	81158	used in live cell imaging analyses of TERRA-MS2 clones