أسلوب انسداد الشريان الدماغي الأوسط للحث علي الاكتئاب بعد السكتة الدماغية في الفئران

Summary

هنا نقدم بروتوكول للحث علي الاكتئاب بعد السكتة الدماغية في الفئران عن طريق انسداد الشريان الدماغي الأوسط عن طريق الشريان السباتي الداخلي. نحن نستخدم Porsolt اختبار السباحة القسري واختبار تفضيل السكروز لتاكيد وتقييم امزجه الاكتئاب المستحث.

Abstract

الاكتئاب بعد السكتة الدماغية (PSD) هو الأكثر تكرارا من جميع المضاعفات النفسانية الناجمة عن السكتة الدماغية. اغلبيه أكبر (حوالي 60%) من جميع المرضي السكتة الدماغية تعاني من PSD, اضطراب يعتبر ان يكون السلائف السكتة الدماغية ذات الصلة لزيادة الموت وتدهور في الصحة. الفيزيولوجيا المرضية من PSD لا تزال غامضه. لدراسة اليه التنمية وحدوث مزيد من شعبه القطاع الخاص ، ولمعرفه العلاج ، حاولنا وضع بروتوكول جديد يتطلب انسداد الشريان الدماغي الأوسط (MCA) عبر الشريان السباتي الداخلي (ICA) في الفئران. يصف هذا البروتوكول نموذجا لل PSD المستحثة في الفئران من خلال انسداد الشريان الدماغي الأوسط (MCAO). تستخدم أيضا في التجربة هي Porsolt القسري اختبار السباحة واختبار تفضيل السكروز لتاكيد وتقييم المزاج الاكتئاب من الفئران تحت التحقيق. بدلا من إدخال القسطرة من خلال الشريان السباتي الخارجي (ECA) ، كما هو منصوص عليه في الاجراء الأصلي ، فان تقنيه MCAO هذه لديها الحيدة التي تمر مباشره عبر ICA. وقد وضعت هذه التقنية MCAO قبل بضع سنوات ، ويؤدي إلى انخفاض في معدل الوفاات والتقلبات. ومن المقبول عموما ان المعايير المستخدمة مفضله في اختيار النماذج البيولوجية. وتبين البيانات التي تم الحصول عليها مع هذا البروتوكول ان هذا النموذج من MCAO يمكن ان يكون وسيله للحث علي PSD في الفئران ، ويمكن ان يؤدي إلى فهم الفيزيولوجيا المرضية والتنمية في المستقبل من الادويه الجديدة وغيرها من عوامل نيوروبروتكتيف.

Introduction

السكتة الدماغية هي الرابعة علي قائمه الامراض التي ترتكب الموت في الولايات المتحدة^1،2،3، في حين انها تسبب معظم الإعاقات لدي البالغين في البلدان المتقدمة⁴؛ هذا يجعل السكتة الدماغية المنافس الرئيسي بين القضايا الصحية الأكثر اهميه في العالم. الحياة الطبيعية في المرضي الناجيين من السكتة الدماغية نادره ، مع حوالي 15 ٪-40 ٪ من ضحايا البقاء علي قيد الحياة يعانون من العجز الدائم ، 20 ٪ تتطلب الرعاية المؤسسية 3 أشهر بعد بداية السكتة الدماغية⁵، وحوالي ثلث الناجيين 6 أشهر الذين يحتاجون إلى الآخرين لمساعدههم من خلال كل يوم⁶. وتفيد التقارير بان السكتة الدماغية تمثل أيضا ارتفاع النفقات الصحية الوطنية⁷. التقديرات من جمعيه القلب الامريكيه لديها التكاليف المتعلقة بالسكتة الدماغية في الولايات المتحدة في أكثر من $50,000,000,000 في 2010⁸.

ليس فقط السكتة الدماغية تسبب الاضرار الطويلة الأجل للافراد ، ولكن بعض الناجيين يميلون إلى المعاناة من الاضطرابات العاطفية والسلوكية ، مثل الخرف ، والتعب ، والقلق ، والاكتئاب ، والهذيان ، والعدوان^{9،10،11 ،12،13،14}. تتمه النفسانية الأكثر تكرارا بعد السكتة الدماغية هو الاكتئاب بعد السكتة الدماغية (PSD) ، تشخيص في حوالي 40 ٪-50 ٪ من الناجيين^15،16،17. يؤدي الاكتئاب الناجم عن السكتة الدماغية إلى زيادة المراضه والوفاات^{18، 19،20،21،22}. لا يعرف الفيزيولوجيا المرضية من PSD تماما ، ولكن يبدو انه ناجم عن عوامل متعددة ويرتبط بالاعاقه ، والضعف المعرفي ، وموقع آلافه²³.

نموذج الفئران من الاسكيميه الدماغ البؤري ، التي انشاتها mcao ، هو النموذج الحيواني الأكثر انتشارا من السكتة الدماغية²⁴،²⁵،^26،27. وفي إثبات التحريض علي المديرية العامة لقطاع الطرق في الجرذان عن طريق انسداد MCA عبر التحالف ، تستخدم التقنيات التي تقلل إلى ادني حد من الوفاات والتغير في نموذج MCAO²⁸.

والهدف الرئيسي من هذا البروتوكول هو تحديد الخطوات اللازمة لحمل المديرية العامة في الفئران عن طريق انسداد MCA عبر التحالف الكتروني الخاص ، وهو نموذج معدل من MCAO ، مما يقلل من معدل الوفاات ونتيجة التغير²⁸. وتشمل الأهداف المحددة أداء الفحوص العصبية والنسيجية (تحديد درجه الخطورة العصبية [NSS] ، وحجم منطقه الاحتشاء ، وذمه الدماغ) للتحقق من فعاليه MCAO واستخدام الاختبارات السلوكية لفحص تاثير هذا الاجراء MCAO علي تطوير الاضطرابات العاطفية ، وأساسا PSD.

Protocol

وافقت اللجنة المعنية برعاية الماشية في جامعه بن غوريون في النقب علي جميع إجراءات العلاج والاختبار المستخدمة في هذا البروتوكول.

1. اعداد الفئران للإجراءات التجريبية

ملاحظه: حدد الذكور الكبار Sprague-Dawley الفئران وزنها 300-350 ز.

1. منزل الفئران ، أربعه في القفص ، في مائي فيفاريوم في 22 درجه مئوية و 40 ٪ الرطوبة ، مع عكس 12 ح ضوء/دوره الظلام (أضواء قباله في 8:00 صباحا) والوصول غير المحدود إلى الغذاء والماء.
2. بشكل عشوائي تعيين الفئران إلى مجموعتين ، وهي مجموعه MCAO (n = 24) ومجموعه الشام (n = 19).

2. اعداد الفئران للجراحة

1. لاعداد الفئران لاجراء MCAO المعدلة ، تخدير كل الفئران لمده 30 دقيقه مع خليط من ايزوفلوان (4 ٪ للاستقراء ، 2 ٪ للجراحة ، و 1.3 ٪ للصيانة) في 24 ٪ الأكسجين (2 لتر/دقيقه) في غرفه الحث والسماح لها بالتنفس تلقائيا^{29 ،30}.
   ملاحظه: تحفيز المنعكس الانسحاب دواسة عن طريق معسر الجلد بين أصابع القدم و/أو منصات اصبع باستخدام ملقط حاد. النظر في عمق التخدير كافيه عندما يختفي منعكس.
2. الحفاظ علي درجه حرارة الجسم الاساسيه في 37 درجه مئوية مع لوحه التدفئة.
3. قياس درجه حرارة الجسم من جميع الفئران من خلال مسبار وضعت في المستقيم الفئران قبل البدء في العملية الجراحية.
4. الحفاظ علي درجه حرارة الجسم ثابت (37 درجه مئوية) لجميع الفئران للتقليل من اي تاثير نقص الأكسجين علي النتيجة العصبية وأي أصابه عصبيه.
5. تطبيق مرهم الدموع الاصطناعية علي كل من عيون الحيوانية في حين انها تقع علي طاوله الاعداديه.
6. حلق الرقبة من كل الفئران وتطهير الجلد مع 70 ٪ الكحول كلوهيكسيدين (70 ٪ الكحول و 0.5 ٪ الكلوركهيكسيدين غلوكونات). كرر الخطوة التطهير مرتين أكثر.
7. تغطيه الفئران مع الستائر الجراحية المعقمة.

3. الجراحة (تقنيه MCAO)

ملاحظه: اجراء عمليه جراحيه علي النحو الموصوف من قبل Boyko et al.²⁸ واستخدام الاداات التي قدمها ماكغاري وآخرون²⁹ و اولتش وآخرون³⁰.

1. اجراء شق الخط الأوسط البطني وتشريح اللفافة السطحية.
2. بعناية اجراء تشريح حاده وغير حاده داخل العضلات مثلث علي شكل (sternohyoid ، هاضم ، والعضلات sternohyoid) لتحديد الشرايين السباتية (اللجنة الاقتصادية لافريقيا ، و ICA ، والشريان السباتي المشترك [CCA]).
3. تشريح بعناية وفضح الحق CCA و ICA.
4. فصل الحق CCA و ICA من العصب المبهم.
   ملاحظه: وعند تحديد الشرايين السباتية علي النحو المنصوص عليه في الخطوة 3.2 ، سيتم الاعتراف بالتحالف كنصف من فروع التقديرات القطرية إلى جانب اللجنة الاقتصادية لافريقيا.
5. ادراج القسطرة (الحرارة التي قللت أو سيليكون المغلفة 4-0 النايلون) حيده مباشره من خلال ICA ، ~ 18.5-19 مم من نقطه التشعب من الحق CCA في دائره ويليس حتى التوصل إلى مقاومه خفيفه ، لاوككلودي MCA.
   ملاحظه: الشعيرات الحرارية الطنانة والنايلون 4-0 المغلفة بالسيليكون تلعب نفس الدور وهي الأكثر تفضيلا خيوط أحاديه في الاونه الاخيره ، نظرا لأنها توفر أفضل انسداد من النايلون عادي الموضوع^28،30.
6. اربط خيطا من الحرير 4-0 حول التحالف الكتروني الخاص فوق الشريان التاجي الأيمن (الشرايين المجنحة) لحجب النقطة القريبة للنقطة التالية لإدخال الخيوط بشكل دائم وبعيد اليها مؤقتا.
7. ربط التحالف الخاص حول الخيط داخل الخيوط لربط خياطه الحرير لمنع النزيف.
8. تخضع الفئران التي تديرها الشام لنفس العملية الجراحية مثل الفئران MCAO ولكن ادراج خيط النايلون بدلا²⁸.
   ملاحظه: الخيط النايلون ، مثل النايلون المغلفة بالسيليكون ، يسد ICA ، ولكنها ليست فعاله مثل هذا الأخير.
9. إغلاق الجرح علي عنق الجرذ بعد انسداد MCA ، إيقاف التخدير ، ووضع الفئران في حاضنه تحت الملاحظة حتى يستيقظ.
   ملاحظه: الحاجة إلى الربط القريب هو لاوككلودي ICA ، وان من ربط اضافيه البعيدة للحد من النزيف حول خيوط وتامينه في المكان. أيضا ، يجب ان يستيقظ الجرذ بعد بضع دقائق من إغلاق الجرح.

4. التعافي بعد الجراحة

1. أداره 5 مل من محلول ملحي 0.9 ٪ لكل الفئران داخل الصفاق ، علي الفور بعد الجراحة ، لمنع الجفاف.
2. أداره تسكين دون قيد أو شرط في اليوم الأول بعد العملية ؛ استخدام ميلوكسيكام 1 مغ/كغ SQ q24 h. إعطاء ديبيرون المخفف (0.5 g المذاب في 400 mL من مياه الشرب) إلى الفئران تظهر اعراض الم خلال الأيام الثلاثة الاولي.
3. التضحية بأي الفئران مع النوبات (المضبوطات ناجمه عن زيادة الضغط داخل الجمجمة من الوذمه الدماغية أو نزيف الدماغ²⁸).

5. الخطورة العصبية نقاط³¹

ملاحظه: يتم تنفيذ هذا الاجراء من قبل اثنين من المراقبين الذين لا يشاركون في الإجراءات الجراحية. يختبرون العجز العصبي والعجز الحركي الصف علي النتيجة التراكمية 0-4³². ويمكن اجراء تقييم هذه النتيجة في فترات زمنيه مختلفه ؛ في هذا التحقيق ، تم تنفيذه 50 دقيقه ، 24 ساعة ، 7 ، 15 ، و 30 يوما بعد الجراحة. تجد أدناه الخطوات اللازمة لتقييم NSS. علي الرغم من ان ليست ضرورة في هذه الحالة ، مطلوب هذه النتيجة للتاكد من السكتة الدماغية في القوارض من أجل أداره العلاج.

1. وضع الفئران علي أرضيه من السيراميك والسماح لها بالتحرك بحريه لمده 1 دقيقه.
2. سحب بلطف الفئران إلى الوراء من قبل الذيل والصف علي النحو التالي.
   1. الصف الفئران مع نقاط 0 لعدم وجود عجز العصبية.
   2. الصف الفئران مع درجه 1 لثني الأطراف الاماميه.
   3. صف الجرذ مع النتيجة 2 لقبضه الأطراف الاماميه الضعيفة المعاكسة.
   4. الصف الفئران مع درجه 3 لتحلق علي الجانب الخزلي عندما سحبت من الذيل.
   5. الصف الفئران مع درجه 4 لعفويه تحلق³².
      ملاحظه: إذا لوحظ أكثر من واحد من ردود الفعل ، وتعطي الافضليه للعمل مع درجه اعلي.

6. تحديد حجم الاحتشاء (الفحص النسيجي)

1. قياس من الاحتشاء حجم
   ملاحظه: تنفيذ هذا الاجراء كما هو موضح سابقا^33،34. قياس الدماغ احتشاء الحجم باستخدام 2, 3, 5-كلوريد ثلاثي فينيلبيراسيتام (عقاري) تلطيخ 24 ح بعد ضخ.
   1. موت ببطء خمسه فئران من كل مجموعه ، 24 ساعة بعد NSS الاخيره ، من خلال تعريضهم لجرعه زائده ايزوفلواني في غرفه الحث.
   2. قطع رؤوس الفئران وعزل أدمغتهم بسرعة باستخدام مقص صغير وملقط.
   3. غسل العقول المعزولة في 0.9 ٪ المالحة.
   4. فحص نقاط النزيف علي العقول لاستبعاد الفئران التي خضعت لنزيف تحت العنكبوتية في دائره ويليس.
   5. وضع كل الدماغ علي شريحة زجاجيه نظيفه علي-20 درجه مئوية حزمه الجليد ومن ثم وضعها في الثلاجة-20 درجه مئوية لمده 5 دقائق لجعل الدماغ أسهل لشريحة.
   6. خذ الشريحة الزجاجية مع الدماغ عليها من-20 درجه مئوية الثلاجة ، ووضعها مره أخرى علي-20 درجه مئوية حزمه الجليد ، وتشريح القطب الامامي والمخيخ مع شفره وملقط.
   7. شريحة الأقسام الدماغ أفقيا إلى سماكه 2 ملم مع شفره لإنتاج سته شرائح.
   8. اعداد 0.05 ٪ الحل العقاري عن طريق أضافه 1.25 g من مسحوق عقاري إلى 500 mL من محلول ملحي العادي قبل التضحية ، ونقل الحل إلى لوحه 24 بئر (1 مل لكل بئر) مغطاه في إحباط ، وتخزينه في 4 درجه مئوية.
      ملاحظه: والانسجه الملونة مع عقاري حساسة للضوء.
   9. باستخدام ملقط ، ونقل شرائح الدماغ إلى لوحه 24 جيدا التي تحتوي علي حل عقاري (شريحة واحده في بئر) وتمتد من شرائح في الحل.
   10. احتضان محتوي لوحه في 37 درجه مئوية في حمام المياه الضحلة لمده 30 دقيقه.
   11. يستنشق المحلول من لوحه مع ماصه ، يغسل لهم سائل غسيل المخ ، واحتضان في درجه حرارة الغرفة لمده 30 دقيقه.
   12. ضع الشرائح في الترتيب الذي تم قطعها علي زجاج المختبر وافحص الشرائح باستخدام ماسح ضوئي.
   13. تحليل حجم احتشاء كنسبه مئوية من شريحة الدماغ كله ، وذلك باستخدام برنامج تحليل ImageJ ، استنادا إلى التعريف البصري.
2. تحليل من الاحتشاء حجم³⁵
   1. قياس حجم احتشاء باستخدام برنامج تحليل الصور القياسية (ImageJ) وتحليل حجم الدماغ احتشاء كنسبه مئوية من حجم الدماغ كله³³.
   2. ضع شرائح الدماغ علي الشرائح المجهر الزجاجي ومسحها ضوئيا باستخدام ماسح ضوئي بدقه عاليه (1,600 × 1,600 نقطه في البوصة) لاجراء تحليل مناسب.
   3. اقتصاص الصور وتوحيد المقياس لجميع الصور ، وذلك باستخدام المسطرة المترية المضمنة في الصورة الممسوحة ضوئيا.
   4. قياس منطقه شحوب ملحوظ في سته متتالية 2 مم المقاطع الاكليليه باستخدام أداه العصا (تتبع) واختيار اليد الحرة علي ImageJ 1.37 v البرمجيات³⁶.
   5. حساب وحده التخزين احتشاء غير مباشر باستخدام الصيغة التالية³⁷.

7. قياس وذمه الدماغ³⁸

ملاحظه: وقد تم قياس وذمه الدماغ 24 ساعة بعد MCAO الماضي.  موت ببطء الحيوانية مع العجز العصبي الشديد التدخل في الأكل و/أو الشرب لمده ثلاثه أيام علي الأقل ، وأكثر من 20 ٪ من فقدان الوزن ، الهيبليجيا أو النوبات.

1. تقييم حجم وذمه النصف الأيمن من الكره الارضيه باستخدام الجمع من المناطق شرائح الإكليل لحساب كميات من نصفي اليمين واليسار في الوحدات التعسفية (بكسل).
   ملاحظه: استخدم برنامج ImageJ 1.37 v لهذا الحساب ، بعد المسح الضوئي (الدقة: 1,600 × 1,600 نقطه في البوصة). حدد منطقه الاهتمام واستخدم وظيفة القياس من قائمه التحليل. تم استخدام وحدات الماكرو في تحقيقنا.
2. التعبير عن منطقه وذمه الدماغ كنسبه مئوية من المناطق القياسية في نصف الكره الارضيه المعاكس غير متاثر.
3. احسب درجه التورم باستخدام المعادلة التي تم تطويرها سابقا³⁹.

8. النماذج السلوكية

1. اجراء الاختبارات السلوكية بين الأيام 30 و 33 بعد الجراحة في غرفه مغلقه ، هادئه ، والتي تسيطر عليها الضوء.
2. تعيين المحققين المكفوفين لجميع الإجراءات التجريبية لشريط فيديو جميع الاختبارات السلوكية مع برنامج متاح تجاريا.
3. السكروز اختبار تفضيل^40،41
   1. وضع الفئران في أقفاص الفردية في نفس الغرفة حيث انها تقع اثناء الدورة المظلمة.
   2. لل 24 ساعة القادمة ، وضع زجاجه واحده من 100 مل من 1 ٪ (ث/الخامس) محلول السكروز في كل قفص مع الفئران ليتم اختبارها وتسمح للتكيف من الفئران.
   3. بعد 24 ساعة ، وحرمان الفئران من الطعام والماء لمده 12 ساعة عن طريق أزاله الزجاجات.
   4. ثم بعد 12 ساعة ، وضع زجاجتين في كل قفص ل 4 h ، واحده تحتوي علي 100 mL من ماء الصنبور واخر يحتوي علي 100 mL من محلول السكروز (1 ٪ [w/v]).
   5. تسجيل كميه محلول السكروز والمياه المستهلكة من قبل الفئران في ملليلتر. حساب التقارب إلى تفضيل السكروز علي النحو التالي.
4. Porsolt القسري اختبار السباحة⁴²
   ملاحظه: واجري اختبار السباحة القسري Porsolt علي النحو الموصوف في بروتوكول سابق نشرته Zeldetz et al.⁴⁰ و boyko et al.⁴². وينص مبدا هذا الاختبار علي انه عندما تجبر الجرذان علي السباحة في منطقه محظوره من أين ، فانها لا تستطيع الهرب ، وتصبح في نهاية المطاف غير متحركة ، وتوقف اي محاولات للهروب من المياه^43،44. وقد اجري هذا الاختبار في غرفه مختلفه خلال الدورة المظلمة.
   1. وضع كل جرذ في اسطوانه عمودي شبكي (الارتفاع: 100 سم ؛ القطر: 40 سم) تحتوي علي 80 سم من الماء عند 25 درجه مئوية لمده 15 دقيقه للسكن.
   2. إخراج الفئران والسماح لها لتجف لمده 15 دقيقه في الضميمه ساخنه (32 درجه مئوية).
   3. أعاده الفئران إلى القفص المنزل (الأصلي).
   4. كرر الخطوة 8.4.1 24 ساعة في وقت لاحق ، وهذه المرة للتحقيق ، لمده 5 دقائق.
   5. شريط فيديو للاختبار 5 دقائق وحساب المدة الاجماليه لعدم الجمود خلال تلك الفترة.

النتائج

كشفت النتائج النسيجية (الجدول 1) عن حجم احتشاء كبير إحصائيا كنسبه مئوية من إجمالي المخ (p < 0.0001) بعد mcao بالمقارنة مع الماشية في مجموعه السيطرة علي الشام. وذكر أيضا ان وذمه الدماغ ذات دلاله احصائيه عندما تم وضع التقييم من المجموعة التجريبية (p < 0.0003) جنبا إلى ...

Discussion

واحده من الطرق التي التقنية MCAO المقدمة هنا يمكن ان تعتبر أكثر أمانا من نموذج MCAO الأصلي ويتضح من حقيقة ان اللجنة الاقتصادية لافريقيا وفروعها ، بما في ذلك الشريان القذالي ، محطه اللغة ، والشريان الفكي العلوي ، لا تتعرض للخطر عندما انسداد ال [MCA] عن طريق ال [أيكا]. أزاحه نموذج MCAO الأصلي للجنة ال?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Absorbent pad	-	-	-
Black lusterless perspex box	-	-	(120 cm × 60 cm × 60 cm), divided into a 25% central zone and the surrounding border zone
Bottles	Techniplast	ACBT0262SU	150 mL bottles filled with 100 mL of water and 100 mL 1%(w/v) sucrose solution
Electric Shock	Heat System Ultasonic Inc.	-	-
Horizon-XL	Mennen Medical Ltd
Imaging System	Kodak	-	For imaging and quantification
Monofilament	-	-	-
Paper towels	Pharmacy	-	Dry towels used for keeping rats dry after immersing them in water
Pexiglass cylinder	-	-	a 100 cm tall and 40 cm in diameter cylinder used for carrying out the forced swim test
Purina Chow	Purina	5001	Rodent laboratory chow given to rats, mice and hamster is a life-cycle nutrition that has been used in biomedical researc for over 5 decades. Provided to rats ad libitum in this experiment
Rat Cages	Techniplast	2000P	Conventional housing for rodents. Was used for housing rats throughout the experiment
Scanner	Canon CanoScan	4200F	-
Video Camera	ETHO-VISION (Noldus)	-	Digital video camera for high definition recording of rat behavior under open field test