쥐의 사후 뇌졸중 우울증을 유도 하기 위한 중간 대뇌 동맥 폐색 기술

요약

여기에서 우리는 내부 경 동맥을 통해 중간 대뇌 동맥을 폐색 하 여 쥐의 사후 뇌졸중 우울증을 유도 하는 프로토콜을 제시. 우리는 Porsolt 강제 수영 시험과 자당 기본 설정 테스트를 사용 하 여 유도 우울한 기분을 확인 하 고 평가 합니다.

초록

사후 뇌졸중 우울증 (PSD)은 허 혈 성 뇌졸중으로 인해 발생 하는 모든 정신병 합병증의 가장 재발입니다. 더 큰 (약 60%) 모든 허 혈 성 뇌졸중 환자는 PSD로 고생 하 고, 장애는 건강의 증가 된 죽음과 악화를 위한 허 혈 성 뇌졸중 관련 전 구체로 여겨진다. PSD의 이상 징후는 여전히 모호 합니다. PSD의 개발과 발생의 메커니즘을 연구 하 고 치료법을 발견 하기 위해 우리는 쥐의 내부 경 동맥 (ICA)을 통해 중간 대뇌 동맥 (MCA)을 폐색 해야 하는 새로운 프로토콜을 개발 하려고 시도 했습니다. 이 프로토콜은 중간 대뇌 동맥 폐색 (MCAO)을 통해 쥐에 유도 된 PSD의 모델을 기술 한다. 또한 실험에서 사용 되는 Porsolt 강제 수영 시험과 자당 선호도 검사는 조사 중인 쥐의 우울한 기분을 확인 하 고 평가 하는 것입니다. 원래 절차에 규정 된 것 처럼 외부 경 동맥 (ECA)을 통해 카 테 터를 삽입 하는 대신,이 MCAO 기술은 ICA를 통해 직접 전달 되는 모노 필 라 멘 트를가지고 있습니다. 이 MCAO 기술은 몇 년 전에 개발 되었으며 사망률과 가변성의 감소로 이어집니다. 일반적으로 사용 되는 기준은 생물학적 모델의 선택에서 선호 되는 것으로 받아들여진다. 이 프로토콜로 얻어진 데이터는 MCAO의이 모형은 쥐에 있는 PSD를 유도 하는 방법이 고 잠재적으로 병 리 생리학 및 새로운 약 및 그밖 신경 보호 에이전트의 미래 발달의 이해로 이끌어 낼 수 있다는 것을 보여줍니다.

서문

뇌졸중은 미국^1,2,3에 있는 죽음-가해자 질병의 목록에 넷째, 그것은 선진국에서 성인에서 장애의 대부분을 야기 하는 동안⁴; 이것은 뇌졸중 세계에서 가장 중요 한 건강 문제 중 선도적 인 경쟁자를 만든다. 뇌졸중 생존 환자에서 정상은 드문, 영구 장애를 겪고 생존 피해자의 약 15%-40%, 뇌졸중 발병⁵후 3 개월 기관 치료를 필요로 하는 20%, 그리고 6 개월 생존의 1/3은 그들이 사는 데 도움이 필요 매일⁶. 뇌졸중은 또한 상승 국가 건강 지출에 대 한 계정⁷. 미국 심장 협회의 추정치는 2010⁸에서 $500억 이상에서 미국에서 뇌졸중 관련 비용을가지고 있다.

뇌졸중은 개인의 장기적인 손상을 유발할 뿐만 아니라 치 매, 피로, 불안, 우울증, 정신 착 란 및 침략과 같은 정서적 및 행동 장애를 겪는 경향이 있습니다. ,¹³,¹⁴. 뇌졸중 후 가장 재발 심리적 속 편은 사후 뇌졸중 우울증 (PSD), 생존¹⁵의 50%에서 진단,¹⁷. 뇌졸중 유발 우울증은 발병 률과 사망률이 증가하 고,¹⁹,²⁰,²¹을 초래 한다. PSD의 병 태 생리학은 완전히 알려지지 않았지만, 여러 가지 요인에 의해 발생 하 고 장애, 인지 장애 및 변 부 부위²³에 연결 되어 있습니다.

MCAO에 의해 생성 된 초점 뇌 허 혈의 쥐 모델은 뇌졸중^24,25,²⁶,²⁷의 가장 광범위 한 동물 모델입니다. ICA를 통해 MCA를 폐색 하 여 쥐의 PSD를 유도 하는 것을 시연 하면서 MCAO 모델의 사망률과 가변성을 최소화 하는 기술은²⁸을 사용 합니다.

이 프로토콜의 주요 목적은 사망률과 변동성²⁸의 결과를 감소 시키는 MCAO의 수정 된 모델인 ICA를 통해 MCA를 폐색 하 여 쥐에서 PSD를 유도 하는 단계를 간략하게 설명 하는 것입니다. 특정 목표는 신경학 적 및 조직학 검사를 수행 하는 것을 포함 합니다 (신경학 적 심각도 점수 [NSS], 경색 영역의 부피 및 뇌 부 종을 결정) MCAO의 효능을 확인 하 고 행동 테스트를 사용 하 여 검사 정서적 장애, 주로 PSD의 개발에이 MCAO 절차의 영향.

프로토콜

이스라엘 네 게 브의 벤 구리 온 대학의 동물 관리 위원회는이 의정서에 사용 된 모든 치료 및 시험 절차를 승인 했습니다.

1. 실험 절차를 위한 쥐의 제조

참고: 300-350 g의 무게를 가진 성인 남성을 선택 합니다.

1. 1 개의 케이지 당 4 마리의 쥐를, 22 ° c의 비 바리 움과 40%의 습도에서 반전 된 12 시간 빛/어둠의 순환 (8:00 오전에 소등)과 음식과 물을 무제한으로 이용할 수 있습니다.
2. 래 트를 2 개의 그룹, 즉 MCAO 그룹 (n=24) 및 샴 그룹 (n=19) 에 임의로 할당 한다.

2. 수술을 위한 쥐의 준비

1. 수정 된 MCAO 절차를 위해 쥐를 준비 하기 위해, 각 쥐를 소이 소 루 란 (유도를 위한 4%, 수술을 위한 2% 및 유지 보수를 위한 1.3%)의 혼합물로 30 분 동안 마 취 시킵니다. 인덕 션 챔버 내에서 24% 산소 (2L/min)가 자발적으로 호흡 할 수 있습니다.^{29 ,30}.
   참고: 무딘 집게를 사용 하 여 발가락 및/또는 발가락 패드 사이의 피부를 꼬 집기 하 여 페달 철수 반사를 자극 합니다. 반사가 사라질 때 마 취의 깊이를 적절 하 게 고려 하십시오.
2. 가 열판을 사용 하 여 37 ° c에서 코어 체온을 유지 합니다.
3. 외과 수술을 시작 하기 전에 쥐의 직장에 배치 된 프로브를 통해 모든 쥐의 체온을 측정 하십시오.
4. 모든 쥐에 대해 체온 상수 (37 ° c)를 유지 하 여 신경학 적 결과 및 모든 신경학 적 부상에 대 한 hypothermic 효과를 최소화 합니다.
5. 그들은 준비 테이블에 거짓말을 하는 동안 각 동물의 눈 모두에 인공 눈물 연 고를 적용 합니다.
6. 각 쥐의 목을 면도 하 고 70% 알코올 클 로르 헥 딘 (70% 알코올 및 0.5%의 클 로르 헥 딘 글 루 콘)으로 피부를 소독 하십시오. 소독 단계를 두 번 더 반복 합니다.
7. 소독 된 수술 용 커튼과 함께 쥐를 덮으 십시오.

3. 수술 (MCAO 기술)

참고: 보이 코 외²⁸ 에 의해 설명 된 대로 수술을 수행 하 고, 맥 게리 외²⁹ 와 울 루 소 외³⁰에 의해 제공 되는 악기를 사용 한다.

1. 복 부 중간 선 절 개를 수행 하 고 피상적 근 막을 분해 합니다.
2. 경 동맥 (ECA, ICA 및 일반적인 경 동맥 [CCA])을 식별 하기 위해 세 개의 삼각형 모양의 근육 (sternohyoid,가 수 및 유 양 돌기 근육) 내의 날카로운 무딘 해 부를 조심 스럽게 수행 하십시오.
3. 조심 스럽게 분해 하 고 올바른 CCA와 ICA를 노출 합니다.
4. 미주 신경에서 오른쪽 CCA와 ICA를 분리 합니다.
   참고: 3.2 단계에서 규정 된 경 동맥을 확인 하면, ICA는 ECA와 함께 CCA 지점의 1/2로 인식 될 것입니다.
5. 카 테 터 (열 또는 실리콘 코팅 4-0 나일론) 모노 필 라 멘 트를 ICA를 통해 직접 삽입 하 고, 오른쪽 CCA의 분기에서 약 19 mm 사이에서 온화한 저항에 도달 할 때까지 윌리스의 원으로 들어갑니다.
   참고: 상기 열 중 합 된 필 라 멘 트와 실리콘 코팅 된 4-0 나일론은 동일한 역할을 하 고, 이들은 일반 나일론 실 (²⁸) 보다 더 우수한 폐색을 제공 하는 것을 감안 하 여 최근 보다 바람직한 모노 필 라 멘 트 이다.
6. 4-0 실크 봉합 사를 오른쪽 CCA 바로 위의 ICA 주변에 연결 (익 상 곱 동맥) 하 여 필 라 멘 트 삽입 지점에 대 한 ICA 근 위부를 일시적으로 그리고 원 위부로 차단 합니다.
7. 이 카를 내 알루 실 주위에 묶어 실크 봉합을 조여 출혈을 방지 하십시오.
8. MCAO 쥐와 같은 외과 수술에 가짜 작동 쥐를 대상으로 하지만 대신에 나일론 스레드를 삽입²⁸.
   참고: 실리콘 코팅 나일론 처럼 나일론 실은 ICA를 폐색 하지만 후자 만큼 효과적이 지는 않습니다.
9. MCA를 폐색 한 후 쥐의 목에 상처를 감고 마 취를 끄고 관찰 중인 인큐베이터에 쥐를 올려 놓으십시오.
   참고: 근 위부 결 찰의 필요성은 ICA를 폐색 하는 것이 고, 추가 말단 결 찰은 필 라 멘 트 주위의 출혈을 감소 시키고 제자리에 고정 시키는 것입니다. 또한, 쥐는 상처가 닫힌 후 몇 분 후에 일어나 야 합니다.

4. 수술 후 회복

1. 복 강 내 각 쥐에 게 5 mL의 0.9% 염 수 용액을 투여 하 고, 수술 직후에 탈수를 방지 합니다.
2. 사후 작업의 첫날에 무조건 진통 관리; 멜 록 시 캄 1 밀리 그램/kg SQ q24를 사용 하 여 희석 된 di 0.5 (식 수의 400 mL에 녹 인)을 첫 3 일 동안 통증의 증상을 보여주는 쥐에 게 주십시오.
3. 발작으로 모든 쥐를 희생 하십시오 (발작이 대뇌 부 종이나 뇌 출혈로 인 한 증가 된두개 내 압력에 의해 유발 됨).

5. 신경학 적 심각도 점수³¹

참고: 이 절차는 수술 절차에 참여 하지 않는 두 명의 관찰자에 의해 수행 됩니다. 그들은 0-4³²의 누적 점수에 신경 적자와 학년 모터 적자를 테스트 합니다. 이 점수에 대 한 평가는 상이한 시간 간격으로 수행 될 수 있다; 이 조사에서, 50 분, 24 시간, 7, 15 및 30 일 후 수술을 수행 하였다. NSS를 평가 하는 단계를 아래에서 찾습니다. 이 상황에서 필수품은 아니지만,이 점수는 치료를 관리 하기 위해 설치류에 뇌졸중을 확인 하는 데 필요한.

1. 쥐를 세라믹 바닥에 놓고 1 분 동안 자유롭게 움직일 수 있습니다.
2. 다음과 같이 꼬리와 경사면에 의해 쥐를 부드럽게 당깁니다.
   1. 신경 적자 없이 점수 0으로 쥐를 채 점 하십시오.
   2. Forelimb 굴곡을 위한 점수 1로 쥐를 채 점 하십시오.
   3. 반대편 약한 forelimb 그립에 대 한 점수 2와 쥐를 학년.
   4. 꼬리를 당길 때 파 레 틱 쪽으로 선회 하는 점수 3으로 쥐를 채 점 합니다.
   5. 자연 선회³²에 대 한 점수 4와 쥐를 학년.
      참고: 둘 이상의 반응이 관찰 되 면 선호도가 높은 점수를 가진 작업에 부여 됩니다.

6. 경색 체적 결정 (H조직학 시험)

1. 경색 부피 측정
   참고: 이전^33,34에 설명 된 대로이 절차를 수행 합니다. 재 관류 후 24 시간 동안 2, 3, 5 triphenyltetrazolium 염화 물 (TTC) 염색을 사용 하 여 뇌 경색 부피를 측정 한다.
   1. 각 그룹에서 다섯 마리의 쥐를 안락사 시키고, 마지막 NSS 후 24 시간 후, 유도 챔버에 있는 아이 소 포컬 과다 복용에 그들을 노출 시 킴으로써.
   2. 쥐를 욕 하 고 신속 하 게 작은가 위와 집게를 사용 하 여 뇌를 분리 합니다.
   3. 0.9% 염 분으로 분리 된 두뇌를 씻으십시오.
   4. 뇌의 출혈 점을 검사 하 여 윌리스 서클에서 지주 막의 출혈을 겪은 생쥐를 배제 합니다.
   5. 각 뇌를-20°c 얼음 팩에 깨끗 한 유리 슬라이드에 놓고 5 분간-20°c의 냉장고에 놓고 뇌를 쉽게 슬라이스 할 수 있도록 합니다.
   6. -20°c 냉장고 밖으로 뇌와 유리 슬라이드를 받아-20°c 얼음 팩에 다시 넣어, 그리고 블레이드와 집게로 정면 극과 소 뇌를 분해.
   7. 6 슬라이스를 생산 하는 블레이드와 2mm 두께로 수평으로 뇌 부분을 슬라이스.
   8. 1.25 g의 TTC 분말을 일반 생리 식 염 수의 500 mL에 추가 하 여 0.05% TTC 솔루션을 준비 하십시오. 희생 하기 전에 용액을 포 일에 덮여 있는 24 웰 플레이트 (우물 당 1Ml)로 이송 하 고 4°c에서 보관 하십시오.
      참고: Ttc와 ttc의 스테인드 티슈는 빛에 민감합니다.
   9. 집게를 사용 하 여 뇌 슬라이스를 TTC 솔루션 (웰 당 한 슬라이스)을 포함 하는 24 웰 플레이트에 전달 하 고 용액의 슬라이스를 늘립니다.
   10. 30 분간 얕은 수조에 37 ° c에서 플레이트 함량을 배양 합니다.
   11. 플레이트에서 TTC 용액을 피 펫으로 흡입 하 고, 세 뇌 세척 액체로 세척 하 고, 실 온에서 30 분간 배양 합니다.
   12. 실험실 유리에서 절단 된 순서 대로 슬라이스를 배치 하 고 스캐너로 세그먼트를 검사 합니다.
   13. 시각적 식별을 기반으로 ImageJ 분석 소프트웨어를 사용 하 여 전체 뇌 조각의 백분율로 경색 크기를 분석 합니다.
2. 경색 볼륨 분석³⁵
   1. 표준 이미지 분석 소프트웨어 (ImageJ)를 사용 하 여 경색 볼륨을 정량화 하 고 전체 뇌 크기³³의 백분율로 경색 뇌 볼륨을 분석 합니다.
   2. 뇌 슬라이스를 유리 현미경 슬라이드에 놓고 광학 스캐너를 사용 하 여 고해상도 (1600 x 1600 dpi)로 스캔 하 여 적절 한 해석을 실시 합니다.
   3. 스캔 한 이미지에 포함 된 메트릭 눈금자를 사용 하 여 이미지를 자르고 모든 이미지의 배율을 표준화 합니다.
   4. Imagej 1.37 v 소프트웨어³⁶에 지팡이 (추적) 도구와 프리 핸드 선택을 사용 하 여 6 연속 2mm 코 날 섹션의 표시 된 창백 영역을 측정 합니다.
   5. 다음 공식³⁷을 사용 하 여 간접 경색 체적을 계산 합니다.

7. 뇌 부 종의 측정³⁸

참고: 뇌 부 종은 마지막 MCAO 후 24 시간을 측정 하였다.  적어도 3 일 동안 식사 및/또는 음주를 방해 하는 심각한 신경학 적 결핍으로 동물을 안락사 시키고, 20% 이상의 체중 감량, 편 마비 또는 발작을 유발 한다.

1. 검 시 슬라이스 영역의 합을 사용 하 여 오른쪽 반구의 부 종의 크기를 평가 하 여 임의의 단위 (픽셀)에서 오른쪽 및 왼쪽 반구로의 체적을 계산 합니다.
   참고: 광학 스캐닝 (해상도: 1600 x 1600 dpi) 후이 계산을 위해 ImageJ 1.37 v 소프트웨어를 사용 하십시오. 관심 영역을 선택 하 고 분석 메뉴에서 측정 기능을 사용 합니다. 우리의 조사에 매크로가 사용 되었습니다.
2. 영향을 받지 않은 반대편 반구에서 표준 영역의 백분율로 뇌 부 종 영역을 표현.
3. 이전에 개발 된 방정식을 사용 하 여 팽 윤 정도를 계산³⁹.

8. 행동 패러다임

1. 폐쇄, 조용 하 고 빛이 제어 되는 방에서 수술 후 일 30 및 33 사이에 행동 테스트를 수행 합니다.
2. 모든 실험 절차에 눈이 멀게 된 조사자에 게 상업적으로 사용 가능한 프로그램으로 모든 행동 테스트를 비디오 테이프로 지정 합니다.
3. 자당 선호도 테스트^40,41
   1. 그들은 어두운 주기 동안 보관 되는 곳과 같은 방에 있는 개별 케이지에 쥐를 배치 합니다.
   2. 다음 24 시간 동안, 테스트 할 쥐와 함께 각 케이지에 100 mL의 1% (w/v) 자당 용액 한 병을 놓고 쥐의 적응을 허용 하십시오.
   3. 24 시간 후, 병을 제거 하 여 12 시간 동안 음식과 물의 쥐를 박탈.
   4. 그런 다음 12 시간 후에 각 케이지에 4 시간 동안 2 개의 병을 넣고 수돗물 100 mL를 포함 하 고 다른 하나는 100 mL의 자당 용액을 함유 합니다.
   5. 자당 용액과 물이 밀리 리터의 쥐에 의해 소비 되는 양을 기록 한다. 다음과 같이 자당 선호도에 대 한 친화도를 계산 한다.
4. Porsolt 강제 수영 테스트⁴²
   참고: Porsolt 강제 수영 시험은 Zeldetz et al.⁴⁰ 및 보이 코 외⁴²에 의해 출판 된 이전 프로토콜에서 설명한 바와 같이 수행 되었다. 이 시험의 원리는 쥐가 whence 제한 된 지역에서 수영을 강요 할 때, 그들은 탈출 할 수 없습니다, 그들은 결국 물^43,44을 탈출 하려는 시도를 중단, 비 이동이 될 것을 상태. 이 시험은 어두운 주기 동안 다른 방에서 수행 되었다.
   1. 수직 플 렉 시 유리 실린더에 각각의 쥐를 배치 (높이: 100 40 센티미터), 25 ° c의 물 80 cm을 포함 하 여 한 번에 15 분 동안.
   2. 쥐를 꺼내가 열 된 인클로저 (32 ° c)에서 15 분 동안 건조 시키십시오.
   3. 쥐를 집 (원본) 케이지에 반환 합니다.
   4. 24 시간 후에 8.4.1 단계를 반복 하 여 이번 조사를 위해 5 분간 진행 한다.
   5. 5 분 테스트를 비디오 테이프로 만들고 해당 기간 동안 부동의 총 기간을 계산 합니다.

결과

조직 학적 소견 (표 1)은 MCAO 군에서 동물에 비하여 통계적으로 유의 한 경색 부피를 총 뇌 (p < 0.0001)의 백분율로 밝혀 내었다. 또한 실험 군에서 평가 되 면 통계적으로 유의 한 뇌 부 종 (p < 0.0003)이 그를 샴 대조 군의 것과 나란히 배치 하였다 고 보고 하였다.

표 2에 나타난 바와 같이, 얻?...

토론

여기에 제시 된 MCAO 기술이 원래의 MCAO 모델 보다 안전 하다 고 간주 될 수 있는 방법 중 하나는 ECA 및 후 두 동맥, 터미널 언어, 및 상 악 동맥을 포함 한 그 가지가 손상 되지 않는다는 사실에 의해 예시 된다 ICA를 통해 MCA를 폐색 할 때. MCAO (및 해당 분기)의 원래 모델의 오프셋 (및 그 지점), 거리 해 부 및 응고 하 여⁴⁶, 손상 된 저작 원인, 혈관 공급에 타협으로 인해 근육을 저작 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Absorbent pad	-	-	-
Black lusterless perspex box	-	-	(120 cm × 60 cm × 60 cm), divided into a 25% central zone and the surrounding border zone
Bottles	Techniplast	ACBT0262SU	150 mL bottles filled with 100 mL of water and 100 mL 1%(w/v) sucrose solution
Electric Shock	Heat System Ultasonic Inc.	-	-
Horizon-XL	Mennen Medical Ltd
Imaging System	Kodak	-	For imaging and quantification
Monofilament	-	-	-
Paper towels	Pharmacy	-	Dry towels used for keeping rats dry after immersing them in water
Pexiglass cylinder	-	-	a 100 cm tall and 40 cm in diameter cylinder used for carrying out the forced swim test
Purina Chow	Purina	5001	Rodent laboratory chow given to rats, mice and hamster is a life-cycle nutrition that has been used in biomedical researc for over 5 decades. Provided to rats ad libitum in this experiment
Rat Cages	Techniplast	2000P	Conventional housing for rodents. Was used for housing rats throughout the experiment
Scanner	Canon CanoScan	4200F	-
Video Camera	ETHO-VISION (Noldus)	-	Digital video camera for high definition recording of rat behavior under open field test