ラットの脳卒中後うつ病を誘導するための中大脳動脈閉塞技術

要約

ここでは、内部頚動脈を介して中大脳動脈を閉塞させることによってラットに脳卒中後うつ病を誘導するプロトコールを提示する。私達は誘発された抑うつ気分を確認し、評価するために Porsolt 強制水泳テストおよびスクロースの好みテストを使用する。

要約

脳卒中後うつ病 (PSD) は、虚血性脳卒中に起因するすべての精神医学的合併症の最も再発性である。大多数 (約 60%)すべての虚血性脳卒中患者が PSD に罹患し、死亡および健康の低下に対する虚血性脳卒中関連前駆体であると考えられる障害である。PSD の病態生理学は依然として不明瞭である。さらに、PSD の発症・発生のメカニズムを研究し、治療法を見出すために、ラットの内部頸動脈 (ICA) を介して中大脳動脈 (MCA) を閉塞させることを必要とする新たなプロトコールの開発を試みた。このプロトコルは、中大脳動脈閉塞 (MCAO) を介してラットに誘発される PSD のモデルを記述する。また、実験に使用される Porsolt 強制水泳試験とショ糖の嗜好試験は、調査中のラットの抑うつ気分を確認し、評価することである。元の手順について規定されているように、外部頚動脈 (ECA) を通してカテーテルを挿入するのではなく、この MCAO 技術は、ICA を直接通過するモノフィラメントを有する。この MCAO 技術は数年前に開発され、死亡率と変動性の低下につながります。使用される基準が生物学的モデルの選択において好ましいことは一般に受け入れられている。このプロトコルで得られたデータは、MCAO のこのモデルは、ラットの PSD を誘発する方法である可能性があり、潜在的に新しい薬やその他の神経保護剤の病態生理学と将来の発展の理解につながる可能性があることを示しています。

概要

脳卒中は、米国^1、2、3の死-ルワンダ以後疾患のリストに第四であり、それは先進国⁴の成人における障害の大部分を引き起こします。これにより、脳卒中は世界で最も重要な健康問題の中でも有数の候補となります。脳卒中生存患者における正常は稀であり, 約 15%-40% が永久的な障害を患っている生存の犠牲者, 20% は脳卒中発症後3ヶ月⁵, そして、彼らを助けるために他の人を必要とする6ヶ月の生存の約3分の1各日を通して⁶.脳卒中はまた、国民健康支出の増加を考慮していると伝えられている⁷.アメリカ心臓協会からの推定値は、2010⁸の $500億以上で米国の打撃関連コストを持っています。

脳卒中は、個人の長期的な損害を引き起こすだけでなく、一部の生存者は、認知症、疲労、不安、抑うつ、せん妄、および攻撃性などの感情的および行動障害に苦しむ傾向があります^{9,10,11 、12、13、14}。脳卒中後の最も再発性の心理的な続編は、脳卒中後の抑うつ (PSD) であり、生存^15,16,17の約 40%-50% で診断されている。脳卒中誘発性うつ病は、^{18、19、20、21、22}の罹患率および死亡率の増加をもたらす。PSD の病態生理学は完全には知られていないが、それは明らかに複数の要因によって引き起こされ、障害、認知障害、および病変部位²³にリンクされている。

MCAO によって作成された病巣脳虚血のラットモデルは、脳卒中²⁴、^25、26、27の最も広範な動物モデルである。ICA を介して MCA を閉塞させることによりラットにおける PSD の誘導を実証する際に、MCAO モデルにおける死亡率および変動性を最小化する技術が採用されている²⁸.

このプロトコルの主な目的は、MCAO の修正モデルである ICA を介して MCA を閉塞させることによって、ラットの PSD を誘発する手順の概略を示すことであり、これにより死亡率と変動性²⁸の結果が減少する。具体的な目的としては、神経学的・組織学的検査 (神経性重症度スコア [NSS]、梗塞ゾーンの体積、脳浮腫) を実施し、MCAO の有効性を検証し、行動検査を用いてこの MCAO プロシージャが感情的障害の発症に及ぼす影響 (主に PSD)

プロトコル

ネゲブのベン・グリオン大学の動物管理委員会, イスラエルは、このプロトコルで使用されるすべての治療および試験手順を承認しました.

1. 実験手順におけるラットの作製

注:体重 300-350 g の成人男性スプレイグ-スプラーグラットを選択します。

1. ラットを、ケージあたり4個、22° c、40% の湿度でビバリウムで、逆12時間の明暗サイクル (午前8:00 時に消灯) で食品と水に無制限にアクセスします。
2. 2つのグループ、すなわち MCAO グループ (n = 24) と偽のグループ (n = 19) にランダムにラットを割り当てる。

2. 手術用ラットの作製

1. 変更された MCAO のプロシージャのためのラットを準備するためには、麻酔の混合物 (誘導のための 4%、外科のための 2%、および維持のための 1.3%) の 24% の酸素 (2 リットル/分) の誘導の部屋の各ラットを30分間、自発的に呼吸することを許可する^{29 、30}。
   注:鈍い鉗子を使用してつま先および/またはつま先のパッド間の皮膚をつまんでペダル離脱反射を刺激する。反射が消えるとき十分な麻酔の深さを考慮しなさい。
2. 熱板で37° c で芯体温を維持してください。
3. 外科的処置を開始する前に、ラットの直腸に置かれたプローブを通してすべてのラットの体温を測定する。
4. 全身の体温を一定に保つ (37 ° c) すべてのラットの神経学的な結果と神経損傷に低体温限界効果を最小限に抑えるために.
5. 彼らは準備テーブルの上に横たわっている間、各動物の目の両方に人工涙液軟膏を適用します。
6. 各ラットの首を剃り、70% アルコールのクロルヘキシジン (70% アルコールおよび 0.5% グルコン酸塩) で皮膚を消毒します。消毒手順をもう2回繰り返します。
7. ラットを滅菌外科用ドレープで覆う。

3. 手術 (MCAO 法)

注:ボイコ et al.²⁸によって説明されているように手術を行い、マクギャリー et al.²⁹および Uluç et al.³⁰によって提供する器具を使用する。

1. 腹側正中切開を行い、表面的な筋膜を解剖する。
2. 頚動脈 (ECA、ICA、および共通頸動脈 (CCA)) を識別するために、3つの三角形の筋肉 (sternohyoid、digastric、および sternomastoid 筋) の中で、鋭いおよび鈍い解剖を慎重に行います。
3. 適切な CCA と ICA を慎重に分析して公開します。
4. 右の CCA と、迷走神経から ICA を分離します。
   注:ステップ3.2 に規定されるように頸動脈を特定すると、ICA は、ECA とともに CCA の半分の枝として認められます。
5. カテーテル (熱平滑化またはシリコーンコーティングされた4-0 ナイロン) モノフィラメントを ICA を介して直接挿入し、右の CCA の分岐点から、抵抗力に達するまでの間、MCA を閉塞させるまでの間、-18.5-19 mm。
   注:熱平滑フィラメントとシリコーンコーティングの4-0 ナイロンは、同じ役割を果たし、彼らはプレーンナイロン糸^28,30よりも優れた閉塞を提供することを考えると、最近の時代には、より好ましいモノフィラメントです。
6. 4-0 のシルク縫合線を右 CCA の真上 (pterygopalatine 動脈) の分岐点の上に結んで、フィラメント挿入ポイントに ICA 近位を一時的に遮断する。
7. 管腔内糸の周りにイカを結び、出血を防ぐために絹の縫合糸を固定する。
8. MCAO ラットと同じ外科的処置に偽手術ラットを対象としたが、²⁸の代わりにナイロン糸を挿入します。
   注:ナイロン糸は、シリコン被覆ナイロンのように、ICA を重なっするが、後者ほど効果的ではない。
9. MCA を閉塞した後、ラットの首の傷を閉じ、麻酔をオフにし、それが目覚めるまで観察の下でインキュベーターの中にラットを置きます。
   注:近位結紮の必要性は、ICA を閉塞することであり、さらなる遠位結紮のことは、フィラメントの周りの出血を減少させ、適所でそれを固定することである。また、ラットは、傷口が閉じられてから数分後に目を覚ます必要があります。

4. 術後の回復

1. 各ラット腹腔内に 0.9% の食塩水溶液を5ml 投与し、手術直後、脱水を予防する。
2. 手術後1日目に無条件に鎮痛を投与する。メロキシカム 1 mg/kg SQ q24 h を使用して、最初の3日間に痛みの症状を示すラットに希釈アナルギン (0.5 g の飲料水400に溶解) を与えます。
3. 発作を伴う任意のラットを犠牲にする (発作は、脳浮腫または脳出血からの増加した頭蓋内圧によって引き起こされる²⁸)。

5. 神経学的重症度スコア³¹

注:この手順は、手術手続に参加していない2人のオブザーバーによって行われます。それらは 0-4³²の累積的なスコアの神経学的な欠陥および等級のモーター欠陥をテストする。このスコアの評価は、異なる時間間隔で実行することができます。この調査では、手術後50分、24時間、7、15、および30日後に実施した。NSS の評価手順は以下を参照してください。このような状況では必要ではないが、このスコアは、治療を管理するためにげっ歯類の脳卒中を確認するために必要とされます。

1. セラミックの床の上にラットを配置し、それが1分間自由に移動できるようにします。
2. 次のように尾と等級によって逆にラットを後方に引っ張ります。
   1. 神経学的な赤字なしのスコア0でラットをグレードします。.
   2. 前肢屈曲のためのスコア1とラットを採点します。
   3. 対弱い前肢グリップのためのスコア2でラットをグレード。
   4. 尾で引っ張られたときに paretic 側に旋回するためのスコア3とラットをグレード。
   5. 自発的な旋回³²のためのスコア4でラットをグレード。
      注:複数の反応が観察される場合、より高いスコアを有する作用に優先権が与えられる。

6. 梗塞量の決定 (Hhistologic 試験)

1. 梗塞量の測定
   注:前述の^{33、34のように、}この手順を実行します。2, 3, 5-トリフェニルテトラゾリウム・クロリド塩化物 (TTC) の染色を使用して脳梗塞量を測定し、再灌流後24時間。
   1. Euthanize は、各グループから5匹のラットを投与し、最後の NSS の後24時間、誘導チャンバ内のイソフルランの過剰摂取に曝露する。
   2. 斬るは、ラットを分離し、すぐに小さなはさみや鉗子を使用して自分の脳を隔離します。
   3. 0.9% の生理食塩水で孤立した脳を洗います。
   4. 脳の出血点を調べて、ウィリスの輪でくも膜下出血を受けたマウスを除外した。
   5. 20° c の氷パックの上にきれいなガラスのスライド上に各脳を置き、その後、脳をスライスしやすくするために、20° c の冷蔵庫に5分間置きます。
   6. 20° c の冷蔵庫の中の脳でガラスのスライドを取り出し、-20 ° c のアイスパックに戻し、ブレードと鉗子で前極と小脳を解剖します。
   7. 6つのスライスを生成するために、ブレードと水平に2ミリメートルの厚さに脳のセクションをスライスします。
   8. 犠牲に先立って、通常の食塩水の 500 mL に TTC 粉末の 1.25 g を添加することにより、0.05% の TTC 溶液を調製し、24ウェルプレート (1 ウェルあたり 1ml) に箔で覆われた溶液を転送し、4° c で保存します。
      注:TTC で染色された TTC と組織は、光感受性である。
   9. 鉗子を使用して、脳スライスを、TTC 溶液を含む24ウェルプレート (ウェルあたり1枚のスライス) に移し、溶液中のスライスを伸ばす。
   10. プレートの含有量を37° c の浅い水浴で30分間インキュベートします。
   11. このプレートからピペットで TTC 溶液を吸引し、洗脳流体で洗浄し、室温で30分インキュベートします。
   12. それらが実験室のガラスで切られた順序で置き、走査器が付いている区分を点検しなさい。
   13. 視覚的な識別に基づいて、ImageJ 分析ソフトウェアを使用して、脳スライス全体の割合として梗塞サイズを分析します。
2. 梗塞体積の分析³⁵
   1. 標準的な画像解析ソフトウェア (ImageJ) を用いて梗塞量を定量化し、梗塞脳体積を全脳サイズ³³の百分率で分析した。
   2. ガラス顕微鏡スライド上の脳のスライスを配置し、適切な分析のための高解像度 (1600 x 1600 dpi) で光学スキャナでそれらをスキャンします。
   3. スキャンしたイメージに含まれるメトリックルーラーを使用して、イメージをトリミングし、すべてのイメージのスケールを標準化します。
   4. ImageJ 1.37 v ソフトウェア³⁶で杖 (トレース) ツールとフリーハンド選択を使用して、6つの連続した 2 mm のコロナセクションで顕著な蒼白の面積を測定します。
   5. 次の式³⁷を用いて間接的な梗塞量を計算する。

7. 脳浮腫の測定³⁸

注:脳浮腫は最後の MCAO の後24時間測定された。 少なくとも3日間の摂食および/または飲酒を妨害する重度の神経学的欠損を有する Euthanize 動物は、20% 以上の体重減少、片麻痺またはけいれんを起こす。

1. Coronally にスライスされた領域の総和を用いて右半球と左半球の体積を任意の単位 (ピクセル) で計算することによって、右半円の浮腫の大きさを評価します。
   注:この計算には ImageJ 1.37 v ソフトウェアを使用します (解像度: 1600 x 1600 dpi)。対象エリアを選択し、[解析] メニューの [メジャー ] 機能を使用します。調査でマクロが使用されました。
2. 脳浮腫領域を、影響を受けていない対半球の標準領域のパーセンテージとして表現します。
3. 以前³⁹に開発された式を使用して膨潤の程度を計算します。

8. 行動パラダイム

1. 閉鎖した、静かな、および軽い調節された部屋の外科の後の30日と33の間の行動テストを行いなさい。
2. すべての実験的な手順に目をつぶっている調査員を割り当て、市販のプログラムですべての動作テストをビデオテープに録画する。
3. ショ糖のプリファレンステスト^40、41
   1. 彼らは暗いサイクル中に収容されている場所と同じ部屋で個々のケージにラットを配置します。
   2. 次の24時間のために、テストされ、ラットの適応を可能にするラットと各ケージに 1% (w/v) ショ糖溶液の 100 mL の1ボトルを置きます。
   3. 24時間後、ボトルを取り外すことにより、ラットの食物と水を12時間奪います。
   4. その後、12時間後、各ケージに2本のボトルを4時間、1つに 100 mL の水道水、100 mL のスクロース溶液 (1% [w/v]) を含有させる。
   5. ラットのスクロース溶液および水の消費量をミリリットルで記録します。ショ糖に対する親和性を次のように計算します。
4. Porsolt 強制水泳テスト⁴²
   注:Porsolt 強制水泳試験は、Zeldetz et al.⁴⁰およびボイコ et al.⁴²によって発行された以前のプロトコルで説明したように実施した。この試験の原理は、ラットがそこから制限された領域で泳いでいる場合、彼らは逃れることができず、最終的には不動になり、水^43、44を逃れる試みを止めるということを述べています。この試験は、暗サイクルの間に別の部屋で実施した。
   1. 馴化のために25° c の水の 80 cm を含んでいる縦のプレキシガラスのシリンダー (高さ: 100 cm; 直径:40 cm) の各ラットを置きなさい。
   2. ラットを取り出し、加熱された筐体 (32 ° c) で15分間乾燥するようにします。
   3. ラットをホーム (オリジナル) ケージに戻します。
   4. 8.4.1 24 時間後の手順を繰り返して、今回の調査のために、5分間。
   5. 5分間のテストを録画し、その期間中の不動の合計時間を計算します。

結果

組織学的所見 (表 1) は、偽対照群の動物と比較した場合の全脳 (p < 0.0001) MCAO に対する百分率として統計的有意な梗塞体積を明らかにした。また、実験群 (p < 0.0003) からの評価を偽対照群のものと並行して配置した場合には統計学的に有意な脳浮腫も報告された。

得られた NSS スコアは、表2に示さ...

ディスカッション

ここで提示された MCAO 技術が元の MCAO モデルよりも安全であると考えられる方法の1つは、後頭部動脈、末端舌、上顎動脈を含む ECA およびその枝が損なわれないという事実によって示されるICA によって MCA を閉塞するとき。ECA (およびその枝) の元の MCAO モデルのオフセットは、遠位に46それらを切開し、凝固させることによって、masticating 筋肉47への血管供給への妥協のために咀嚼の障害を?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Absorbent pad	-	-	-
Black lusterless perspex box	-	-	(120 cm × 60 cm × 60 cm), divided into a 25% central zone and the surrounding border zone
Bottles	Techniplast	ACBT0262SU	150 mL bottles filled with 100 mL of water and 100 mL 1%(w/v) sucrose solution
Electric Shock	Heat System Ultasonic Inc.	-	-
Horizon-XL	Mennen Medical Ltd
Imaging System	Kodak	-	For imaging and quantification
Monofilament	-	-	-
Paper towels	Pharmacy	-	Dry towels used for keeping rats dry after immersing them in water
Pexiglass cylinder	-	-	a 100 cm tall and 40 cm in diameter cylinder used for carrying out the forced swim test
Purina Chow	Purina	5001	Rodent laboratory chow given to rats, mice and hamster is a life-cycle nutrition that has been used in biomedical researc for over 5 decades. Provided to rats ad libitum in this experiment
Rat Cages	Techniplast	2000P	Conventional housing for rodents. Was used for housing rats throughout the experiment
Scanner	Canon CanoScan	4200F	-
Video Camera	ETHO-VISION (Noldus)	-	Digital video camera for high definition recording of rat behavior under open field test