Farelerde inme sonrası depresyon Inducing için orta serebral arter tıkanıklığı tekniği

Özet

Burada iç karotis arter üzerinden orta serebral arter yuvasını kapatıp tarafından fareler sonrası felç depresyon teşvik etmek için bir protokol sunuyoruz. İndüklenen depresif ruh hali onaylamak ve değerlendirmek için Porsolt zorla yüzme testi ve sakaroz tercih testi kullanıyoruz.

Özet

İnme sonrası depresyon (PSD), iskemik inme kaynaklanan tüm psikiyatrik komplikasyonların en tekrarlayan olduğunu. Büyük bir çoğunluk (yaklaşık% 60) Tüm iskemik inme hastaların PSD muzdarip, bir hastalık artan ölüm ve sağlık bozulması için iskemik inme ile ilgili öncü olarak kabul. PSD 'nin patofizyolojisi hala belirsiz. PSD 'nin geliştirilmesi ve oluşumu ile ilgili mekanizmayı daha fazla incelemek ve bir terapi bulmak için, Orta serebral arter (MCA) ile iç karotis arter (ICA) aracılığıyla sıçanlarda okcluding gerektiren yeni bir protokol geliştirmeye çalıştık. Bu protokol, Orta serebral arter tıkanıklığı (MCAO) yoluyla fareler içinde indüklenen PSD modeli açıklanmaktadır. Ayrıca deneyde kullanılan Porsolt zorunlu yüzme testi ve teyit etmek ve soruşturmada fareler depresif ruh değerlendirmek için sakaroz tercih testi vardır. Orijinal prosedür için öngörülen gibi dış karotis arter (ECA) yoluyla kateter takmak yerine, bu MCAO tekniği doğrudan ICA üzerinden geçen monofilament vardır. Bu MCAO tekniği birkaç yıl önce geliştirilmiştir ve mortalite ve değişkenlik bir azalma yol açar. Kullanılan kriterlerin biyolojik modellerin seçiminde tercih edildiği genellikle kabul edilir. Bu protokol ile elde edilen veriler, bu MCAO modelinin, fareler içinde PSD 'nin inducing bir yolu olabilir ve potansiyel olarak patofizyoloji ve yeni ilaçların ve diğer nörokoruyucu ajanlar gelecekteki gelişimi anlayışına yol açabilir gösterir.

Giriş

Stroke, Amerika Birleşik Devletleri^1,2,3' te ölüm-işlenen hastalıklar listesinde dördüncü, gelişmiş ülkelerde yetişkinler Engelli çoğunluğu neden iken⁴; Bu, dünyanın en önemli sağlık sorunları arasında inme bir lider rakip yapar. Normal inme-hayatta kalan hastalarda nadirdir, yaklaşık 15%-40% hayatta kalma kurbanlarının kalıcı özürlülük acı, 20% inme başlangıcı⁵sonra 3 ay kurumsal bakım gerektiren, ve yaklaşık 6 aylık sağkalım başkalarına ihtiyaç onlara yaşamak yardımcı olmak için Her gün⁶. İnme bildirildi de yükselen Ulusal Sağlık harcamaları için hesaplar⁷. Amerikan Kalp Derneği tahminler $50.000.000.000 üzerinde 2010⁸yılında Amerika Birleşik Devletleri 'nde inme ile ilgili maliyetleri vardır.

Sadece inme bireylerin uzun vadeli zararlara neden değil, ancak bazı kurtulan demans, yorgunluk, anksiyete, depresyon, deliryum ve saldırganlık gibi duygusal ve davranışsal bozukluklar, acı eğilimindedir^{9,10,11 ,12,13,14}. Bir inme sonrası en tekrarlayan psikolojik devamı, felç sonrasında depresyon (PSD), yaklaşık% 40-50% hayatta kalma^15,16,17tanısı. İnme kaynaklı depresyon morbidite ve mortalitenin artması ile sonuçlanır^{18, 19,20,21,22}. PSD 'nin patofizyolojisi tamamen bilinmemektedir, ancak görünüşte birden fazla faktörden kaynaklanır ve özürlülük, bilişsel bozukluk ve lezyon sitesi²³' e bağlıdır.

Odak beyin iskemi, MCAO tarafından oluşturulan sıçan modeli, inme en yaygın hayvan modeli^24,25,26,27. Indor ile MCA okcluding tarafından fareler PSD indüksiyon gösteren, mortalite ve değişkenlik MCAO modelinde en aza indirmek teknikleri istihdam edilmektedir²⁸.

Bu protokolün birincil amacı, MCA 'yı, mortaliteyi ve değişkenlik sonucunu azaltan modifiye edilmiş bir model olan ICA 'dan atlayarak PSD 'nin farelerde inducing adımlarını özetlemektedir²⁸. Spesifik hedefler arasında nörolojik ve histolojik Sınavlar (nörolojik önem puanlarını belirleme [NSS], infarktüs bölgesinin hacmi ve beyin ödem), MCAO 'nun etkinliğini doğrulamak ve davranışsal testler kullanarak duygusal bozuklukların gelişimi üzerinde bu MCAO prosedürün etkisi, özellikle PSD.

Protokol

Ben-Gurion Üniversitesi 'nin hayvan bakım Komitesi, Israil Bu protokolde kullanılan tüm tedavi ve test prosedürlerini onayladı.

1. deneysel prosedür için Rats hazırlanması

Not: Seçin yetişkin erkek Sprague-Dawley Rats tartım 300-350 g.

1. Sıçan ev, kafes başına dört, 22 °C bir Vivarium ve 40% Nem, ters bir 12 h ışık/karanlık döngüsü (ışıklar kapalı 8:00 a.m.) ve gıda ve suya sınırsız erişim.
2. Fareleri, yani MCAO grubu (n = 24) ve Sham Grubu (n = 19) gibi iki gruba rasgele atayın.

2. cerrahi için Rats hazırlanması

1. Değiştirilmiş MCAO prosedürü için fareler hazırlamak için, bir indüksiyon odasında 24% oksijen (2 L/dak) ısofluran karışımı (indüksiyon için% 4, cerrahi için% 2 ve bakım için% 1,3) ile 30 dakika boyunca her sıçan anestezize ve kendiliğinden 29 nefes izin ^,30.
   Not: Ayak parmakları ve/veya parmak pedleri arasında künt forseps kullanarak cilt pinching tarafından pedal çekilme refleks uyarmak. Refleks kaybolduğunda anestezi derinliği yeterli düşünün.
2. 37 °C ' de ısıtma plakası ile çekirdek vücut sıcaklığını koruyun.
3. Cerrahi prosedür başlamadan önce sıçan rektum yerleştirilen bir prob aracılığıyla tüm fareler vücut sıcaklığını ölçmek.
4. Tüm farelerin nörolojik sonuç ve herhangi bir nörolojik yaralanma üzerindeki hipotermik etkiyi en aza indirmek için vücut sıcaklığını sabit (37 °C) tutun.
5. Onlar hazırlık masasında yalan iken her iki hayvanın gözlerine suni gözyaşı merhem uygulayın.
6. Her sıçan boyun tıraş ve 70% alkol klorheksidin ile cildi dezenfekte (70% alkol ve 0,5% klorheksidin Gluconate). Dezenfeksiyon adımını iki kez daha tekrarlayın.
7. Fareler sterilize cerrahi perdeler ile koruyun.

3. cerrahi (MCAO tekniği)

Not: Boyko ve ark.²⁸ tarafından açıklandığı gibi ameliyat yapın ve McGarry et al.²⁹ ve uluç et al.³⁰tarafından sağlanan enstrümanları kullanın.

1. Bir ventral orta hat kesi gerçekleştirin ve yüzeysel fasya incelemek.
2. Dikkatle üç üçgen şeklinde kas içinde keskin ve künt diseksiyon gerçekleştirmek (sternohyoid, digastrik, ve sternomastoid kas) karotis arterlerin tanımlamak için (ECA, ICA, ve ortak karotis arter [CCA]).
3. Dikkatle gözden ayırıp doğru CCA ve ICA maruz.
4. Doğru CCA ve ICA 'yı vagus sinirinden ayırın.
   Not: Adım 3,2 öngörülen olarak karotis arterlerin belirlenmesi üzerine, ICA ECA yanında CCA dalları bir buçuk olarak kabul edilecektir.
5. Ekle bir kateter (ısı-Blunted veya silikon kaplı 4-0 naylon) doğrudan ICA üzerinden monofilament, ~ 18.5-19 mm sağ CCA çatallanma noktasından Willis daire içine hafif bir direnç ulaşıncaya kadar, occlude MCA.
   Not: Isı-Blunted filament ve silikon kaplı 4-0 naylon aynı rolü oynamak ve onlar düz naylon iplik daha iyi oklüzyon sağlamak göz önüne alındığında, son zamanlarda daha tercih edilen monofilamler^28,30.
6. Doğru CCA (Pterygopalatine arter) hemen üzerinde ICA etrafında bir 4-0 ipek dikiş Tie filament ekleme noktasına geçici olarak ve distal için ICA proksimal engellemek için çatallanma.
7. Kanamayı önlemek için ipek sütür tutturmak için intraluminal iplik etrafında ICA bağlayın.
8. Sahte çalışan fareler MCAO fareler aynı cerrahi prosedür konu ama yerine bir naylon iplik eklemek²⁸.
   Not: Silikon kaplı naylon gibi naylon iplik, ICA okcludes, ama ikincisi kadar etkili değildir.
9. MCA 'yı okcluding sonra sıçan boynundaki yarayı kapatın, anestezi kapatın, ve uyanana kadar gözlem altında bir kuluçka yere sıçan yerleştirin.
   Not: Proksimal ligasyon için ihtiyaç ICA okclude, ve ek distal ligasyon filament çevresindeki kanama azaltmak ve yerinde güvenli etmektir. Ayrıca, sıçan yara kapalı sonra birkaç dakika uyanmak gerekir.

4. cerrahi sonrası Iyileşme

1. Yönetmek 5 mL 0,9% tuz çözeltisi her sıçan intraperitoneally, hemen ameliyattan sonra, dehidrasyon önlemek için.
2. İlk gün operasyon sonrası koşulsuz olarak analjezi yönetin; Kullanım Meloksikam 1 mg/kg sq Q24 h. ilk 3 gün içinde ağrı belirtileri gösteren fareler için seyreltilmiş dipiron (0,5 gr içme suyu 400 ml çözünür) verin.
3. Nöbet geçiren herhangi bir sıçan feda etme (nöbetler, serebral ödem veya serebral hemoraj²⁸' den artan intrakranial basınç nedeniyle oluşur).

5. nörolojik önem Puanını³¹

Not: Bu prosedür, cerrahi davalarda yer almayan iki gözlemci tarafından gerçekleştirilir; Onlar 0-4³²toplu bir puan üzerinde nörolojik açıkları ve Grade motor açıkları test. Bu puanın değerlendirilmesi farklı zaman aralıklarında gerçekleştirilebilir; Bu soruşturmada, 50 dk, 24 saat, 7, 15 ve 30 gün ameliyat sonrası gerçekleştirildi. NSS değerlendirmek için adımları aşağıda bulun. Bu durumda bir zorunluluk olmasa da, bu puan tedavi yönetmek için kemirgenler içinde inme tespit etmek için gereklidir.

1. Sıçan bir seramik zemin üzerine yerleştirin ve serbestçe yaklaşık 1 dakika hareket etmesini sağlar.
2. Sıçan kuyruğunu ve notu aşağıdaki gibi yavaşça geri çekin.
   1. Hiçbir nörolojik açığı için puan 0 ile sıçan notu.
   2. Forelimb fleksiyon için 1 puan ile sıçan notu.
   3. Kontralateral zayıf forelimb kavrama için puan 2 ile sıçan notu.
   4. Kuyruk tarafından çekilen Paretik tarafına çember için puan 3 ile sıçan notu.
   5. Notu 4 spontan yuvarlak³²için puan ile sıçan.
      Not: Reaksiyonlar birden fazla gözlenen ise, tercih daha yüksek bir puanı ile eyleme verilir.

6. ınfarct hacminin belirlenmesi (Hhistolojik muayene)

1. İnfarkit hacminin ölçümü
   Not: Daha önce^33,34açıklandığı gibi bu yordamı gerçekleştirin. Ölçmek beyin infarkt hacmi kullanarak 2, 3, 5-triphenyltetrazolium klorür (TTC) boyama 24 h reperfüzyon sonra.
   1. Her gruptan beş sıçan, son NSS sonra 24 saat, bir indüksiyon odasında bir izofluran aşırı dozda onları açığa tarafından ötenize.
   2. Fareler deapitate ve hızlı bir şekilde küçük makas ve forseps kullanarak beyni izole.
   3. İzole beyin% 0,9 tuz içinde yıkayın.
   4. Willis çemberinde subaraknoid kanama uygulanan fareler dışlamak için beynin kanama noktalarını inceleyin.
   5. Her beyni bir-20 °C ' lik buz paketinde temiz bir cam kaydırağa yerleştirin ve daha sonra beynin dilimlemeyi kolaylaştırmak için 5 dakika boyunca-20 °C ' lik buzdolabına yerleştirin.
   6. Üzerinde beyin ile cam slayt alın-20 °C buzdolabı, geri koymak-20 °C buz paketi, ve ön kutup ve bıçak ve forseps ile serebellum incelemek.
   7. Altı dilim üretmek için, beyin bölümlerini yatay olarak 2 mm kalınlığında bir bıçak ile dilimleyin.
   8. Kurban etmeden önce normal tuz çözeltisi 500 mL 'ye 1,25 g TTC tozu ekleyerek% 0,05 TTC solüsyonu hazırlayın, çözümü folyoyla kaplı 24 kuyu plakasına (1 mL başına) aktarın ve 4 °C ' de saklayın.
      Not: TTC ile lekelenmiş doku ve TTC hafif hassastır.
   9. Forseps kullanarak, beyin dilimleri TTC çözeltisi (iyi başına bir dilim) içeren 24-kuyu plaka aktarmak ve çözelti dilimleri dışarı uzatmak.
   10. 37 °C ' de plaka içeriğini 30 dakika boyunca sığ bir su banyosuna inkulatın.
   11. TTC çözeltisi tabandan bir pipet ile aspirate, onları bir beyin yıkama sıvısı ile yıkayın ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inküye.
   12. Dilimleri bir laboratuar camında kesildikleri sıraya yerleştirin ve segmentleri tarayıcıyla inceleyin.
   13. Görsel kimlik dayalı ımagej analiz yazılımı kullanarak, tüm beyin dilim bir yüzdesi olarak infarkt boyutunu analiz.
2. Infarkct hacmi³⁵ Analizi
   1. Standart bir görüntü analiz yazılımı (ımagej) kullanarak infarkıt hacmi ölçmek ve tüm beyin büyüklüğü³³bir yüzdesi olarak infarkt beyin hacmi analiz.
   2. Beyin dilimleri cam mikroskop slaytlar üzerine yerleştirin ve yüksek çözünürlükte bir optik tarayıcı ile tarama (1.600 x 1.600 dpi) yeterli bir analiz için.
   3. Taranan görüntüye dahil edilen metrik cetvel kullanarak görüntüleri kırpın ve tüm görüntüler için ölçeği standartlaştırın.
   4. Bir Wand (izleme) aracı ve ımagej 1.37 v yazılım³⁶üzerinde FreeHand seçimi kullanarak altı ardışık 2 mm koronal bölümlerde işaretlenmiş paletleme alanını ölçün.
   5. Aşağıdaki formül³⁷kullanarak dolaylı infarkct hacmi hesaplayın.

7. beyin ödem³⁸ ölçümü

Not: Beyin ödem son MCAO sonra 24 saat ölçülmüştür.  Şiddetli nörolojik eksikliği ile ötenize hayvanlar yeme ve/veya en az üç gün için içme ile müdahale, daha fazla 20% kilo kaybı, hemipleji veya nöbetler.

1. Sağ ve sol hemisferlerin keyfi birimler (piksel) hacimlerini hesaplamak için Cor, dilimlenmiş alanların toplamını kullanarak doğru Yarımküre ödem büyüklüğünü değerlendirmek.
   Not: Optik Tarama (çözünürlük: 1.600 x 1.600 dpi) sonra bu hesaplama için ımagej 1,37 v yazılımını kullanın. İlgi alanını seçin ve analiz menüsünden Ölçü işlevini kullanın. Soruşturmada makrolar kullanıldı.
2. Beyin ödem alanını etkilenmeyen kontralateral Yarımküre 'deki standart alanların yüzdesi olarak ifade edersiniz.
3. Hesaplamak daha önce³⁹geliştirilen denklem kullanarak şişme derecesi.

8. davranışsal paradigmalar

1. Kapalı, sessiz ve hafif kontrollü bir odada ameliyattan sonra 30 ve 33 gün arasında davranış testleri gerçekleştirin.
2. Tüm deneysel prosedürlere, ticari olarak kullanılabilen bir programla tüm davranışsal testleri videoya kaydetmiş olan müfettişlerle kör olarak atayın.
3. Sucrose tercih testi^40,41
   1. Fareleri, karanlık döngüsünde barındırdıkları yerde olduğu gibi aynı odada ayrı kafeslere yerleştirin.
   2. Sonraki 24 h için, 100 mL bir şişe yer 1% (w/v) sukroz solüsyonu sıçan ile her kafeste test edilecek ve sıçan adaptasyon için izin.
   3. 24 saat sonra, şişe kaldırarak 12 saat boyunca gıda ve su fareler mahrum.
   4. Sonra 12 h, 4 h için her kafeste iki şişe yerleştirin, biri 100 mL musluk suyu ve başka bir içeren 100 mL sakaroz çözeltisi (1% [w/v]).
   5. Mililitre içinde fareler tarafından tüketilen sukrose çözeltisi ve su miktarını kaydedin. Benzeşimi aşağıdaki gibi sukrose tercihine göre hesaplayın.
4. Porsolt zorla Swim test⁴²
   Not: Porsolt zorla yüzme testi Zeldetz ve al.⁴⁰ ve Boyko vd.⁴²tarafından yayınlanan bir önceki protokolde açıklandığı gibi yürütülmüştür. Bu testin prensibi, fareler yasak bir alanda yüzmeye zorlandığı zaman, onlar kaçamaz, onlar sonunda hareketli hale, su^43,44kaçmak için herhangi bir girişim durduruldu. Bu test karanlık döngüsünde farklı bir odada yürütülmüştür.
   1. Her bir fareyi, habituasyon için 15 dakika boyunca 25 °C ' de 80 cm su içeren dikey Pleksiglas silindir (Yükseklik: 100 cm; çap: 40 cm) içine yerleştirin.
   2. Sıçan dışarı alın ve ısıtmalı muhafaza (32 °C) 15 dakika kurumasına izin.
   3. Onun ev (orijinal) kafes için sıçan dönün.
   4. 5 dakika için, soruşturma için bu kez, 24 saat sonra 8.4.1 adım tekrarlayın.
   5. 5 dk test video ve bu dönemde hareketsizlik toplam süresini hesaplayın.

Sonuçlar

Histolojik bulgular (Tablo 1) toplam beyin yüzdesi olarak istatistiksel olarak anlamlı infarkt hacmi ortaya (p < 0,0001) Post-MCAO zaman sahte kontrol grubunda Hayvanlar ile karşılaştırıldığında. Ayrıca deneysel gruptan (p < 0,0003) değerlendirme, sahte kontrol grubu ile yan yana konulduğunda istatistiksel olarak anlamlı bir beyin ödem olduğunu bildirdi.

Tablo 2...

Tartışmalar

MCAO tekniğinin burada sunulan yollarından biri, orijinal MCAO modelinden daha güvenli kabul edileceği, oksipital arter, Terminal lingual ve maksiller arter dahil olmak üzere ECA ve dalları, tehlikeye atmaz. ICA üzerinden MCA yuvasını kapatıp zaman. ECA (ve dalları) orijinal MCAO modelinin ofset, distale kesme aleti ve onları⁴⁶pıhtılaşma, kaslar⁴⁷masticating vasküler tedarik için bir uzlaşma nedeniyle, bozulmuş mastication neden olur. Kas imha sonunda ek ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Absorbent pad	-	-	-
Black lusterless perspex box	-	-	(120 cm × 60 cm × 60 cm), divided into a 25% central zone and the surrounding border zone
Bottles	Techniplast	ACBT0262SU	150 mL bottles filled with 100 mL of water and 100 mL 1%(w/v) sucrose solution
Electric Shock	Heat System Ultasonic Inc.	-	-
Horizon-XL	Mennen Medical Ltd
Imaging System	Kodak	-	For imaging and quantification
Monofilament	-	-	-
Paper towels	Pharmacy	-	Dry towels used for keeping rats dry after immersing them in water
Pexiglass cylinder	-	-	a 100 cm tall and 40 cm in diameter cylinder used for carrying out the forced swim test
Purina Chow	Purina	5001	Rodent laboratory chow given to rats, mice and hamster is a life-cycle nutrition that has been used in biomedical researc for over 5 decades. Provided to rats ad libitum in this experiment
Rat Cages	Techniplast	2000P	Conventional housing for rodents. Was used for housing rats throughout the experiment
Scanner	Canon CanoScan	4200F	-
Video Camera	ETHO-VISION (Noldus)	-	Digital video camera for high definition recording of rat behavior under open field test