Uma técnica de oclusão da artéria cerebral média para induzir A depressão pós-AVC em ratos

Resumo

Aqui nós apresentamos um protocolo para induzir a depressão do borne-curso nos ratos obstruindo a artéria cerebral média através da artéria carotídea interna. Utilizamos o teste de nadada forçada de Porsolt e o teste de preferência de sacarose para confirmar e avaliar o humor depressivo induzido.

Resumo

A depressão pós-AVC (PSD) é a mais recorrente de todas as complicações psiquiátricas resultantes de um AVC isquêmico. Uma maior maioria (cerca de 60%) de todos os pacientes com AVC isquêmico sofrem de PSD, um distúrbio considerado um precursor isquêmico relacionado ao AVC para aumento da morte e degradação na saúde. A fisiopatologia do PSD ainda é obscura. Para estudar o mecanismo de desenvolvimento e ocorrência de PSD ainda mais, e para descobrir uma terapia, tentamos desenvolver um novo protocolo que requer a oclusão da artéria cerebral média (MCA) através da artéria carótida interna (ICA) em ratos. Este protocolo descreve um modelo de PSD induzido em ratos através da oclusão da artéria cerebral média (MCAO). Também utilizado no experimento estão o teste de nadada forçada de Porsolt e o teste de preferência de sacarose para confirmar e avaliar o humor depressivo dos ratos investigação. Em vez de inserir o cateter através da artéria carótida externa (ECA), conforme estipulado para o procedimento original, esta técnica de MCAO tem o monofilamento passando diretamente pela AIC. Esta técnica de MCAO foi desenvolvida alguns anos há e conduz a uma redução na mortalidade e na variabilidade. É geralmente aceito que os critérios utilizados são preferidos na seleção de modelos biológicos. Os dados obtidos com este protocolo mostram que este modelo de MCAO poderia ser uma forma de induzir PSD em ratos e poderia potencialmente levar à compreensão da fisiopatologia e do desenvolvimento futuro de novas drogas e outros agentes neuroprotetores.

Introdução

O AVC é o quarto na lista de doenças perpetradores da morte nos Estados Unidos^1,2,3, enquanto provoca a maioria das deficiências em adultos nos países desenvolvidos⁴; Isto faz o curso um candidato principal entre as edições de saúde as mais significativas do mundo. A normalidade no acidente vascular cerebral-os pacientes sobreviventes é rara, com cerca de 15%-40% das vítimas de sobrevivência que sofrem de incapacidade permanente, 20% exigindo cuidados institucionais 3 meses após o início do AVC⁵, e cerca de um terço dos sobreviventes 6-mês precisando de outros para ajudá-los a viver através de cada dia⁶. O curso declaradamente esclarece também os gastos nacionais crescentes da saúde⁷. As estimativas da associação americana do coração têm custos do curso-relacionados nos Estados Unidos em mais de $50000000000 em 2010⁸.

Não só o AVC causa danos a longo prazo dos indivíduos, mas alguns sobreviventes tendem a sofrer distúrbios emocionais e comportamentais, como demência, fadiga, ansiedade, depressão, delirium e agressão^{9,10,11 ,12,13,14}. A sequela psicológica mais recorrente após um AVC é a depressão pós-AVC (PSD), diagnosticada em cerca de 40%-50% das sobrevivências^15,16,17. A depressão induzida por AVC resulta em aumento da morbidade e mortalidade^{18,19,20,21,22}. A fisiopatologia do PSD não é conhecida completamente, mas aparentemente é causada por múltiplos fatores e está ligada à incapacidade, comprometimento cognitivo e local da lesão²³.

O modelo do rato da isquemia cerebral focal, criado por mcao, é o modelo animal o mais difundido do curso^24,25,26,27. Ao demonstrar a indução de PSD em ratos por oclusar a MCA através da ICA, empregam-se técnicas que minimizam a mortalidade e a variabilidade no modelo de MCAO²⁸.

O objetivo principal deste protocolo é delinear os passos para induzir PSD em ratos, oclusando o MCA através da AIC, um modelo modificado de MCAO, que reduz a mortalidade e o desfecho da variabilidade²⁸. Os objetivos específicos incluem a realização de exames neurológicos e histológicos (determinando o escore de severidade neurológica [NSS], o volume da zona de infarto e o edema cerebral) para verificar a eficácia do MCAO e usar testes comportamentais para examinar a influência deste procedimento de MCAO no desenvolvimento de desordens emocionais, principalmente PSD.

Protocolo

O Comitê de cuidado animal da Universidade de Ben-Gurion do Negev, Israel aprovou todos os procedimentos do tratamento e de teste usados neste protocolo.

1. preparação de ratos para o procedimento experimental

Nota: Selecione ratos machos adultos Sprague-Dawley pesando 300-350 g.

1. Abrigar os ratos, quatro por gaiola, em um Biotério a 22 ° c e 40% de umidade, com um ciclo de luz invertida de 12 h/escuro (luzes fora em 8:00 a.m.) e acesso ilimitado a alimentos e água.
2. Atribua aleatoriamente os ratos a dois grupos, ou seja, um grupo de MCAO (n = 24) e um grupo Sham (n = 19).

2. preparação de ratos para cirurgia

1. Para preparar os ratos para o procedimento modificado de mcao, anestesiam cada rato por 30 minutos com uma mistura do isoflurano (4% para a indução, 2% para a cirurgia, e 1,3% para a manutenção) no oxigênio de 24% (2 L/min) em uma câmara de indução e permitem que respire espontâneamente^{29 ,30}.
   Nota: Estimular reflexo de retirada do pedal por beliscar a pele entre os dedos dos pés e/ou almofadas do dedo do pé usando fórceps sem corte. Considere a profundidade da anestesia adequada quando o reflexo desaparece.
2. Manter a temperatura corporal central a 37 ° c com uma placa de aquecimento.
3. Meça a temperatura corporal de todos os ratos através de uma sonda colocada no reto do rato antes de iniciar o procedimento cirúrgico.
4. Mantenha a temperatura corporal constante (37 ° c) para todos os ratos para minimizar qualquer efeito hipotérmico sobre o desfecho neurológico e qualquer lesão neurológica.
5. Aplique lágrimas artificiais pomada para ambos os olhos de cada animal, enquanto eles se encontram na mesa de preparação.
6. Raspar o pescoço de cada rato e desinfectar a pele com 70% de clorexidina alcoólica (70% de álcool e 0,5% de gluconato de clorexidina). Repita a etapa de desinfecção mais duas vezes.
7. Cubra os ratos com cortinas cirúrgicas esterilizadas.

3. cirurgia (a técnica de MCAO)

Nota: Realize a cirurgia descrita por Boyko et al.²⁸ e use os instrumentos fornecidos por McGarry et al.²⁹ e uluç et al.³⁰.

1. Realize uma incisão ventral da linha média e dissecar a fáscia superficial.
2. Realize com cuidado uma dissecção afiada e contundente dentro dos três músculos triângulo-dados forma (o sternohyoid, o Digastric, e o músculo sternomastoid) para identificar as artérias carotídeas (o ECA, o AIC, e a artéria carotídea comum [CCA]).
3. Dissecar cuidadosamente e expor o CCA direito e o ICA.
4. Separe o CCA e o AIC direito do nervo vago.
   Nota: Ao identificar as artérias carótidas, conforme estipulado na etapa 3,2, a ICA seria reconhecida como metade dos ramos CCA ao lado do TCE.
5. Inserir um cateter (calor-Blunted ou silicone-revestido de nylon 4-0) monofilamento diretamente através do ICA, ~ 18.5-19 mm a partir do ponto de bifurcação do CCA direito para o círculo de Willis até atingir uma resistência leve, para oclusde MCA.
   Nota: O filamento Heat-Blunted e o nylon silicone-revestido de 4-0 jogam o mesmo papel e são os monofilamentos mais preferidos nos tempos recentes, dado que fornecem a melhor oclusão do que a linha de nylon Lisa^28,30.
6. Amarre uma sutura de seda 4-0 em torno do ICA logo acima da bifurcação direita do CCA (artéria pterygopalatine) para obstruir o ICA proximal ao ponto de inserção do filamento permanentemente e distal a ele temporariamente.
7. Amarrar o ICA em torno da rosca intraluminal para prender a sutura de seda para evitar o sangramento.
8. Sujeitar os ratos Sham-operated ao mesmo procedimento cirúrgico que os ratos de MCAO mas introduzir uma linha de nylon preferivelmente²⁸.
   Nota: O fio de nylon, como o nylon revestido com silício, fecha o ICA, mas não é tão eficaz como o último.
9. Feche a ferida no pescoço do rato depois de oclusar o MCA, desligue a anestesia e coloque o rato numa incubadora observação até que acorde.
   Nota: A necessidade para a ligadura proximal é oclusar o ICA, e aquele da ligadura longe do ponto de origem adicional é reduzir o sangramento em torno do filamento e fixá-lo no lugar. Além disso, o rato deve acordar alguns minutos após a sua ferida foi fechada.

4. recuperação pós-cirúrgica

1. Administrar 5 mL de solução salina a 0,9% para cada rato intraperitonealmente, imediatamente após a cirurgia, para evitar a desidratação.
2. Administrar a analgesia incondicionalmente no primeiro dia pós-operação; Use Meloxicam 1 mg/kg SQ Q24 h. dar dipirona diluída (0,5 g dissolvido em 400 mL de água potável) para ratos que apresentam sintomas de dor durante os primeiros 3 dias.
3. Sacrifique todos os ratos com apreensões (as apreensões são causadas pela pressão intracranial aumentada do edema cerebral ou da hemorragia cerebral²⁸).

5. escore de gravidade neurológica³¹

Nota: Este procedimento é realizado por dois observadores que não participam do processo cirúrgico; testam os deficits neurológicos e os deficits do motor da classe em uma contagem cumulativa de 0-4³². A avaliação desse escore pode ser realizada em diferentes intervalos de tempo; nesta investigação, realizou-se 50 min, 24 h, 7, 15 e 30 dias após a cirurgia. Encontre abaixo as etapas para avaliar o NSS. Embora não seja uma necessidade nesta situação, este escore é necessário para verificar AVC em roedores, a fim de administrar o tratamento.

1. Coloc o rato em um assoalho cerâmico e deixe-o mover-se aproximadamente livremente por 1 minuto.
2. Puxe delicadamente o rato para trás pela cauda e pela classe como segue.
   1. Classific o rato com contagem 0 para nenhum deficit neurológico.
   2. Classific o rato com contagem 1 para a flexão do membro torácico.
   3. Classific o rato com a contagem 2 para o aperto fraco contralateral do membro torácico.
   4. Classific o rato com a contagem 3 para circundar ao lado parético quando puxado pela cauda.
   5. Classific o rato com a contagem 4 para circular espontânea³².
      Nota: Se mais de uma das reações forem observadas, a preferência é dada à ação com uma pontuação mais alta.

6. determinação do volume do enfarte (exame Hhistológico)

1. Medição do volume do enfarte
   Nota: Execute este procedimento conforme descrito anteriormente^33,34. Meça o volume do infarto do cérebro usando o cloreto 2, 3, 5-triphenyltetrazolium (TTC) que mancha 24 h após o reperfusion.
   1. Eutanizar cinco ratos de cada grupo, 24 h após a última NSS, expondo-os a uma overdose de isoflurano em uma câmara de indução.
   2. Decapitar os ratos e rapidamente isolar seus cérebros usando pequenas tesouras e fórceps.
   3. Lave os cérebros isolados em 0,9% de soro fisiológico.
   4. Examine os pontos de sangramento nos cérebros para excluir os camundongos que se submeteram à hemorragia subaracnóidea no círculo de Willis.
   5. Coloc cada cérebro em uma corrediça de vidro limpa em um bloco de gelo de-20 ° c e coloc-os então em um refrigerador de-20 ° c por 5 minutos para fazer o cérebro mais fácil de fatiar.
   6. Tome a corrediça de vidro com o cérebro nele fora do refrigerador de-20 ° c, põr a para trás no bloco do gelo-20 ° c, e dissecar o pólo frontal e o cerebelo com lâmina e fórceps.
   7. Corte as secções cerebrais horizontalmente em 2 mm de espessura com uma lâmina para produzir seis fatias.
   8. Prepare uma solução de TTC de 0, 5% adicionando 1,25 g de pó de TTC a 500 mL de solução salina normal antes do sacrifício, transfira a solução para uma placa de 24 poços (1 mL por poço) coberta em folha e armazene-a a 4 ° c.
      Nota: TTC e tecido manchado com TTC são sensíveis à luz.
   9. Usando fórceps, transfira as fatias cerebrais para a placa de 24 poços contendo a solução TTC (uma fatia por poço) e esticar as fatias na solução.
   10. Incubar o conteúdo da chapa a 37 ° c em um banho de água rasa por 30 min.
   11. Aspirar a solução TTC da placa com uma pipeta, lave-as com um fluido de lavagem cerebral e incubar à temperatura ambiente durante 30 min.
   12. Coloque as fatias na ordem em que foram cortadas em um vidro de laboratório e examine os segmentos com um scanner.
   13. Analise o tamanho do infarto como uma porcentagem de toda a fatia cerebral, usando o software de análise ImageJ, baseado na identificação visual.
2. Análise do volume de infarto³⁵
   1. Quantifique o volume do infarto usando um software de análise de imagem padrão (ImageJ) e analise o volume cerebral do infarto como uma porcentagem do tamanho do cérebro inteiro³³.
   2. Coloque as fatias cerebrais em lâminas de microscópio de vidro e Digitalize-as com um scanner óptico em alta resolução (1.600 x 1.600 dpi) para uma análise adequada.
   3. Recorte as imagens e padronize a escala para todas as imagens, usando a régua métrica incluída na imagem digitalizada.
   4. Meça a área de palito marcado em seis seções coronais consecutivas de 2 mm usando uma ferramenta de varinha (rastreamento) e uma seleção à mão livre no software ImageJ 1.37 v³⁶.
   5. Calcule o volume de enfarte indireto usando a seguinte fórmula³⁷.

7. medição do edema cerebral³⁸

Nota: O edema cerebral foi medido 24 h após o último MCAO.  Eutanizar animais com déficit neurológico grave interferindo em comer e/ou beber por pelo menos três dias, mais de 20% de perda de peso, hemiplegia ou convulsões.

1. Avalie a magnitude do edema do hemisfério direito usando a somatória das áreas coronárias cortadas para calcular os volumes dos hemisférios direito e esquerdo em unidades arbitrariamente (pixels).
   Nota: Use o software ImageJ 1.37 v para este cálculo, após a digitalização óptica (resolução: 1.600 x 1.600 dpi). Selecione a área de interesse e use a função Measure no menu análise . As macros foram usadas em nossa investigação.
2. Expresse a área do edema cerebral como uma porcentagem das áreas padrão no hemisfério contralateral não afetado.
3. Calcule o grau de inchaço usando a equação desenvolvida anteriormente³⁹.

8. paradigmas comportamentais

1. Realize testes comportamentais entre os dias 30 e 33 após a cirurgia em um quarto fechado, silencioso e controlado por luz.
2. Atribua investigadores cegos a todos os procedimentos experimentais para filmar todos os testes comportamentais com um programa comercialmente disponível.
3. Teste de preferência de sacarose^40,41
   1. Coloque os ratos em gaiolas individuais na mesma sala onde estão alojados durante o ciclo escuro.
   2. Para os próximos 24 h, coloque uma garrafa de 100 mL de solução de sacarose a 1% (p/v) em cada gaiola com o rato a ser testado e permita a adaptação do rato.
   3. Após 24 h, privar os ratos de alimentos e água para 12 h, removendo as garrafas.
   4. Depois de 12 h, coloque duas garrafas em cada gaiola por 4 h, uma contendo 100 mL de água da torneira e outra contendo 100 mL de solução de sacarose (1% [w/v]).
   5. Registre a quantidade de solução de sacarose e água consumida por ratos em mililitros. Calcule a afinidade com a preferência de sacarose da seguinte maneira.
4. Porsolt forçado nadar teste⁴²
   Nota: O teste de nadada forçada de Porsolt foi realizado como descrito em um protocolo prévio publicado por Zeldetz et al.⁴⁰ e Boyko et al.⁴². O princípio deste teste afirma que, quando os ratos são forçados a nadar em uma área restrita de onde, eles não podem escapar, eles eventualmente se tornam imóveis, cessar qualquer tentativa de escapar da água^43,44. Este teste foi realizado em uma sala diferente durante o ciclo escuro.
   1. Coloque cada rato em um cilindro de plexiglass vertical (altura: 100 cm; diâmetro: 40 cm) contendo 80 cm de água a 25 ° c por 15 min para habituação.
   2. Tome o rato para fora e deixe-o secar por 15 minutos em um cerco aquecido (° c 32).
   3. Retorne o rato a sua gaiola Home (original).
   4. Repita a etapa 8.4.1 24 h mais tarde, esta vez para a investigação, por 5 minutos.
   5. Filmar o teste de 5 min e calcular a duração total da imobilidade durante esse período.

Resultados

Os achados histológicos (tabela 1) revelaram um volume de infarto estatisticamente significante como percentual do cérebro total (p < 0, 1) pós-mcao quando comparados aos animais do grupo Sham-controle. Também foi relatado um edema cerebral estatisticamente significante quando a avaliação do grupo experimental (p < 0, 3) foi colocada lado a lado com a do grupo Sham-controle.

Os escores do...

Discussão

Uma das maneiras pelas quais a técnica de MCAO aqui apresentada pode ser considerada mais segura do que o modelo original de MCAO é ilustrada pelo fato de que o TCE e seus ramos, incluindo a artéria occipital, o terminal lingual e a artéria maxilar, não estão comprometidos ao oclusar o MCA através do ICA. O offset original do modelo de mcao do ECA (e de suas filiais), desdissecando distalmente e coagulando os⁴⁶, causa a mastigação danificada, devido a um acordo à fonte vascular aos músc...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Absorbent pad	-	-	-
Black lusterless perspex box	-	-	(120 cm × 60 cm × 60 cm), divided into a 25% central zone and the surrounding border zone
Bottles	Techniplast	ACBT0262SU	150 mL bottles filled with 100 mL of water and 100 mL 1%(w/v) sucrose solution
Electric Shock	Heat System Ultasonic Inc.	-	-
Horizon-XL	Mennen Medical Ltd
Imaging System	Kodak	-	For imaging and quantification
Monofilament	-	-	-
Paper towels	Pharmacy	-	Dry towels used for keeping rats dry after immersing them in water
Pexiglass cylinder	-	-	a 100 cm tall and 40 cm in diameter cylinder used for carrying out the forced swim test
Purina Chow	Purina	5001	Rodent laboratory chow given to rats, mice and hamster is a life-cycle nutrition that has been used in biomedical researc for over 5 decades. Provided to rats ad libitum in this experiment
Rat Cages	Techniplast	2000P	Conventional housing for rodents. Was used for housing rats throughout the experiment
Scanner	Canon CanoScan	4200F	-
Video Camera	ETHO-VISION (Noldus)	-	Digital video camera for high definition recording of rat behavior under open field test