جديدة محمولة في المختبر تعرض كاسيت لأخذ العينات الهباء الجوي

Summary

نقدم هنا، وضع بروتوكول لتنفيذ التعرض الأيروسول الخلوية المحمولة وقياس الاستجابة الخلوية. يستخدم الأسلوب الخلايا، نمت في واجهة الهواء السائل، ومحاكاة في فيفو فسيولوجيا. وقد لوحظ الاستجابة الخلوية للهباء الجوي نانوحبيبات النحاس الأكسدة عن طريق توليد أنواع الأكسجين التفاعلية وسيتوتوكسيسيتي كالإصدار نازعة لاكتات.

Abstract

ويدخل هذا البروتوكول في المختبر تعرض نظام جديد، يمكن أن يجري البالية، بما في ذلك في توصيف والأداء. واجهة الهواء السائل (على) في المختبر التعرض النظم غالباً ما تكون كبيرة وضخمة، مما يجعل النقل الميدانية والعملية في المصدر الانبعاث أو داخل منطقة التنفس صعباً. عن طريق تصغير هذه النظم، يمكن أن يمثل المختبر إلى الميدان، وتعجيل وقت المعالجة وتوفير أنسب أسلوب تعرض لا يغير الأيروسول قبل الاتصال الخلايا. المحمولة في المختبر كاسيت التعرض (بيفيك) تكيف كاسيت تصفية 37 ملم للسماح للسمية في المختبر على اختبار خارج إعداد مختبر تقليدية. بيفيك تميزت باستخدام ثلاثة أحجام من جسيمات نانوية النحاس لتحديد كفاءة الترسيب استناداً إلى قياس الجاذبية وتحليل تركيز عدد الجسيمات. وأجريت التجارب الأولية سيتوتوكسيسيتي مع خلايا الرئة المعرضة لتحديد قدرة النظام على إيداع الجسيمات مع المحافظة على بقاء الخلية. بيفيك يوفر من ترسب مماثلة أو زيادة كفاءة عند مقارنة بتدفق عمودي متوفرة في المختبر أجهزة التعرض. وعلى الرغم من انخفاض الإنتاجية عينة، يعطي صغر حجم بعض المزايا للحالي في المختبر على نظم للتعرض. وتشمل هذه القدرة على أن ترتديه للرصد الشخصي، والتنقل من المختبر إلى مصدر للانبعاثات، والخيار لإنشاء أنظمة متعددة للقرار المكانية مع الحفاظ على مستخدم أقل تكلفة. بيفيك نظام قادر على جمع الهباء الجوي في الميدان وداخل منطقة التنفس على الهواء-ربطه، نموذجا في المختبر .

Introduction

شخصية أخذ العينات باستخدام تقنيات في المختبر يمكن أن توفر معلومات شاملة بشأن الآثار البيولوجية للهباء الجوي في مكان العمل. ¹ التعرض للملوثات في الهواء وتشمل التعرض لهذه المادة الكيميائية ذاتها، أن عينات الهواء التي تم جمعها، تحت ظروف المغمورة حيث عرض الغاز إلى تعليق خلية، التعرض المتقطع استخدام جهاز مثل الروك، أو مباشرة التعرض في واجهة الهواء السائل (على). ² كثير من هذه التقنيات تجري مع الخلايا التي نمت في تعليق أو جمع العينات قبل التعرض، كل منها يمكن أن تؤثر على الدراسة السمية نظراً للتغيرات المحتملة في الأيروسول. ³ تجنب هذه التغييرات، المختبر يمكن نقله إلى الحقل باستخدام عدة في المختبر على الثقافة تعرض النظم المستخدمة في الأدب،^{،،من45،،من67 8،،}من^910،11،،من¹²¹³ ولكن قليلة متوفرة تجارياً. ^{8 , 9 , 12} هذه النظم غالباً ما تكون ضخمة، لا سيما عندما بما في ذلك أدوات لتنظيم درجة الحرارة والرطوبة للبيئة الخلوية ومعدل تدفق الأيروسول عينة. باستخدام بيفيك، التعرض للهباء الجوي يمكن أن يؤديها خارج إعداد مختبر تقليدية أو داخل منطقة التنفس أثناء محاكاة ظروف استنشاق.

أن تحديد من الهباء الجوي ترسب في المختبر مهم للتحقيق في الآثار الصحية بسبب استنشاق. منطقة التنفس، منطقة حدود 30 سم من الفم والأنف،¹⁴ حاسمة الأهمية لفهم التعرض للجسيمات النانوية وربط التأثيرات البيولوجية الموجودة في الرئتين. ² في كثير من الأحيان، الترسب في الخلايا يعرف كفاءة ترسيب، الجسيمات المودعة على وتناول الخلايا مقسوماً على الجسيمات التي تديرها إلى^6،نظام¹⁵ أو بصورة جماعية بنفس المبالغ. ^{4 , 16} الأساليب الحالية لقياس الهباء الجوي في منطقة التنفس هي عامل التصفية على أساس والتقاط الجزيئات على مدى فترة معينة أخذ عينات واستخدام عوامل التصفية لإجراء مزيد من التجارب. ¹⁷ الرصد الشخصي يتطلب نظام صغيرة التي تأتي مع المفاضلة العينات أقل.

هناك الكثير من النهج لتحديد الآثار الصحية الناجمة عن التعرض للهباء الجوي. النموذج على يسمح للأيروسول تدار مباشرة إلى الخلايا عن طريق الهواء كما هو الحال في سيناريو تعرض حقيقي، حتى الآن أكثر فعالية من حيث التكلفة ووقتاً أقل كثافة مما في فيفو الدراسات بينما يقلد الحواجز الهواء السائل مثل العيون، الجلد، والرئتين. خلايا الرئة نمت على لديها القدرة على توليد طبقة حاجز الاستقطاب،^18،19 التي تنتج الصفات الفسيولوجية التي تشبه في فيفو الرئة ظهارة، بما في ذلك إنتاج مخاط والفاعل بشكل خاص خطوط خلايا الشعب الهوائية أو التهاب، أهداب الضرب وتقاطعات ضيق¹⁹ ،^19،20 وخلية الاستقطاب. ¹⁸ تغييرات كهذه يمكن أن تؤثر على الاستجابة الخلوية قياسه في دراسات السمية. ²¹ بالإضافة إلى ذلك، على نموذج في المختبر نتائج يتعرضون غالباً أكثر حساسية من الخلايا عن طريق تعليق نماذج²² ، وهم قادرون لنموذج السمية الحادة في فيفو استنشاق. ^{23 , 24} لذلك، نظام تعرض على التي قادرة على إجراء قياسات داخل منطقة التنفس خطوة تالية طبيعية.

بتعريض الخلايا للهباء الجوي مباشرة على مصدر للانبعاثات، يحدث التحقيق في آثار جميع الغازات والمركبات شبه المتطايرة، والجسيمات المتورطين في الخليط. عندما يتم جمع الخليط في عامل تصفية، لم يتم التقاطها بالغازات والمركبات المتطايرة ولا يمكن التحقيق في الخليط كله. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يؤدي إعادة تشكيل الجزيئات في شكل مسحوق أو تعليق سائل إلى التجميع أو التفاعلات الموائع والجسيمات، مثل حل، في تعليق السائل. ^{25 , 26} عندما تتم إضافة جسيمات الهباء الجوي إلى السائل، هناك إمكانية أعلى للتكتل، وتشكيل^{27 25،}كورونا البروتين أو²⁸ أو التفاعل مع المركبات في السائل، التي يمكن أن تؤثر على الترسيب و تؤثر في استجابة بيولوجية. ^{29 , 30}

التعرض على يستند إلى ثلاثة ملامح الهباء الجوي الرئيسية وسحابة تسوية، موازية وتدفق وتدفق عمودي. سحابة تسوية، يستخدم قبل التعرض للخلية واجهة الهواء السائل (ALICE)،⁴ نظام مجموعة حيث إيداع الجسيمات من خلال الجاذبية وديفوسيونال تسوية كما الأيروسول تعامل كوحدة واحدة. تدفق مواز، يستخدمها الالكتروستاتيكي الهباء الجوي في المختبر نظام التعرض (الطنف)⁵ والتعدد الثقافي التعرض الدائرة (MEC) ثانيا،⁶ يسمح للترسيب من خلال إضافة البراونية من خلال الشخصية تدفق. تدفق عمودي، المستخدمة من قبل ميكروسبرايير،⁷ "نانو الأيروسول الدائرة" للسمية في المختبر (ناسيفت) و¹¹ والتجاريه على أنظمة^8،،من^910،12، يضيف انحشار من جسيمات داخل منطقة الترسيب. كثير من هذه النظم التعرض الكبيرة والضخمة، التي تتطلب نظم الزائدة للهباء الجوي قبل التكييف، مضخات للتدفق، أو حتى تدفئة الغرف للحضانة للخلايا. هذا الحجم الكبير يقلل من قابلية للنظام. بدلاً من أخذ العينات مباشرة على مصدر للانبعاثات، هذه النظم غالباً ما يكون إلى الهباء مختبر أو النموذج التي تم إنشاؤها لتحليل العينات. يمكن أن تضيع تعقيد الأيروسول المنبعثة في الترجمة من الميدان إلى المعمل. بيفيك أصغر من النظم الحالية، مع مساحة سطح خارجي حوالي 460 سم² وتزن 60 غراما فقط، مع التحكم في الحرارة والرطوبة تدمج في نظام يسمح لجهاز محمول للغاية. انخفاض حجم ووزن السماح للنظام بأن ترتديه أو اتخاذها مصدرا للتعرض، وتسمح بأخذ العينات مباشرة.

الحجم الكبير لنظم التعرض الحالي يقلل أيضا من قدرة على القيام بأخذ العينات للتحقيق في التدرجات المكانية في تركيزات. هذا القرار مفتاح عند تحديد الآثار السمية للعديد من الإمكانيات البيئية والمخاطر المهنية مثل أنشطة هذه المسألة أو مكان العمل جسيمات عوادم المركبات التي يحدث فيها هباء. فورا بعد انتهاء الانبعاثات، يصبح هناك تباين المكاني في تركيز الجسيمات. وهذا ينمو مع الوقت تفريق الجزيئات في جميع أنحاء الغلاف الجوي، ويمكن تغيير هذه الآثار استناداً إلى الظروف المحيطة، مثل درجة الحرارة والضغط والرياح والشمس. يمكن أن تبدأ جسيمات إلى سن وأكسدة كذلك مرة المنبعثة^31،32 ومعدلات تشتيت تتأثر بالتضاريس؛ سيتم العثور على تركيزات أعلى في الوديان والإنفاق، وهي تباطؤ آثار التشتت، حيث يمكن العثور على تركيزات أقل حيث هناك مساحة كبيرة للتشتت. ³³ هذه التغييرات في معدلات انتشارها يمكن أن تكون لها آثار كبيرة على صحة الإنسان ويتبين عند مقارنة عدد البالغين المصابين بالربو الذين يعيشون المناطق الحضرية مقابل في البيئات الريفية. ³⁴ بينما العديد من التعرض لنظم تقديم عينات متعددة في وقت واحد، أنظمة متعددة اللازمة مع وفرة معدات كبيرة لتنفيذ القرار المكانية.

من خلال جلب المختبر إلى الميدان، يمكن تقليل وقت التحليل باستخدام الخلية كله كجهاز استشعار. بعد الآليات البيولوجية المعروفة ونقاط النهاية يمكن أن تساعد في تحديد تكوين الهباء الجوي وحجم. بسبب أساليب إزالة بطيئة، بما في ذلك إزالة mucociliary والبلعمه إزفاء، غالباً ما تتفاعل هذه الجسيمات مع الخلايا تقريبا من أيام لأسابيع³ توليد الأكسدة والالتهابات، وموت الخلية حتى. هذه النهاية البيولوجية يمكن أن يكون نقطة انطلاق لمسارات النتيجة السلبية لأمراض القلب والأوعية الدموية أو مرض الانسداد الرئوي المزمن. وبالإضافة إلى ذلك، يقوم وييمين et al. صفيف فحوصات في المختبر لمقارنة مع قيم الأدب للمدى القصير في فيفو سمية الاستنشاق. ³⁵ وكان من المتوقع في فيفو استجابة مع اثنين من أربع نتائج إيجابية من اختبار سيتوتوكسيسيتي عن طريق الإفراج نازعة لاكتات، الأكسدة من الجلوتاثيون تشكيل الحد وفوق أكسيد الهيدروجين والإصدار، والتهاب المحتملة من الجينات عامل نخر الورم ألفا. من أصل عشرة أكاسيد معدنية نانوسيزيد اختبار، اختبار ستة كنشط (أكسيد التيتانيوم وأكسيد الزنك وأكسيد السيريوم مختلفة أربعة) استخدام التعرض في المختبر مع التأكيد في فيفو. 

من أجل دراسة آثار الهباء الجوي في بيئة مهنية، وضعت لدينا مختبر بيفيك للتعرض في الميدان. بالإضافة إلى ذلك، يمكن ارتداؤها بيفيك لأخذ العينات الشخصي رصدها والتحقيق فيها التعرض لاستنشاق مثل كاسيت تصفية مم 37³⁶ أو أنظمة متعددة يمكن استخدامها لتحقيق القرار المكانية داخل منطقة معينة. هذا البروتوكول، بتوصيف واستخدام بيفيك يناقش فيه. بعد التعرض، ولوحظت الآثار البيولوجية من خلال فحوصات سيتوتوكسيسيتي.

Protocol

مشغلي يجب ارتداء معدات الوقاية الشخصية (مثل مختبر معطف، قفازات، نظارات) عند تنفيذ الخطوات 1، 2، 3، 5 و 6.

1-إعداد المواد

1. إعداد مواد لنظام الجمعية والتعرض للتأكد من التكرار.
   1. تأكد من استخدام جديد أو الإيثانول 70 ٪ تنظيفها ¼ "القطر الداخلي موصلة الأنابيب و ¼" القطر الخارجي موصلات للجمعية النظام.
   2. تخزين مواد الاختبار بما في ذلك المرشحات ومكونات بيفيك، ملاقط ومساحيق الجسيمات في بيئة تسيطر عليها جيدا، وفيما يتعلق بدرجة الحرارة والرطوبة، على الأقل 24 ساعة قبل التجربة.
      ملاحظة: ينبغي أن تكون درجة الحرارة القرب من درجة حرارة الغرفة، حوالي 20 درجة مئوية، مع الرطوبة النسبية أقل من 35%. وهذا مهم جداً لتحقيق التكرار بين التجارب.
   3. تعد عدادات الجسيمات باستخدام الكحول لتنظيف الأجزاء والسماح للاحماء النظام وفقا لتوصيات الشركة المصنعة، بما في ذلك المسح تحجيم الجسيمات التنقل (المكاتب الصغيرة) وتحجيم الجسيمات الضوئية (OPS) لقياس.

2-توليد الهباء الجوي الجاف

ملاحظة: يجب إجراء مشغلي توليد الهباء الجوي في غطاء دخان.

1. تجميع نظام لتوليد الهباء الجوي الجاف
   ملاحظة: ينبغي أن تكون المناسبة لثقافة التطبيق وخلية على غرار تعليق الجسيمات في غاز أو سائل. يمكن تنفيذ الطريقة التالية باستخدام الهباء الجوي على أساس سائل. تصميم نظام الهباء الجوي الجاف من تيواري وآخرون. ³⁷ وتخطيطي للنظام تشتت الجافة يرد في الشكل 1.
   1. الاتصال صمام الكرة بكل نهاية الأنبوب حجم الخيوط 4 "1/8، وهذا سيكون بمثابة هوبر الجسيمات. قم بتوصيل 2 "1/8 حجم الأنابيب صمام واحد.
   2. وزن النحاس الجسيمات النانوية، في هذه الدراسة كان إبقاء التركيز الشامل لكل حجم من أحجام الجسيمات ثابتة أثناء تحديد كفاءة الترسيب. تقريبا استخدام 7.5 ملغ من 40 نانومتر النحاس nanoparticles و 7 مغ من 100 نانومتر النحاس جسيمات نانوية 13 ملغ 800 نانومتر النحاس nanoparticles الواحدة والتعرض. ضع جسيمات نانوية النحاس إلى هوبر الجسيمات من خلال نهاية مفتوحة.
      ملاحظة: كمية جسيمات نانوية النحاس وزنها ستكون بمثابة الكتلة التركز التي تدار على أساس.
   3. ضع 3 "قطعة من القطر الخارجي (OD) أنابيب ½" حول 2 الأنابيب ومكان هيبا تصفية داخل هذه الأنابيب قصيرة أن اتجاه التدفق من خلال صمام الكرة.
   4. قم بتوصيل مولد فراغ صمام الكرة الأخرى باستخدام مؤشر الترابط. الاتصال مولد فراغ خزان الهواء عن طريق وضع أنابيب OD 5/16 "إلى دفع لتأمين الاتصال. استخدام ¼ "OD أنابيب للاتصال منفذ مولد فراغ الإعداد التجريبية بوضع الأنابيب عبر منفذ مولد فراغ.
2. استخدام نظام الأيروسول الجافة لتوليد الهباء الجوي الجاف
   1. فتح خزان الهواء عن طريق تحويل الصمام الرئيسي، والسماح بتدفق الهواء إلى النظام. فتح الصمام على منظم التدفق على خزان الهواء وتعيين أن التدفق من خلال النظام يكافئ الإعدادات المطلوبة في مضخة فراغ.
   2. فتح صمام الكرة الأقرب إلى هيبا فلتر ثم فتح صمام الكرة الأقرب إلى مولد فراغ. إبقاء هذه مفتوحة لحوالي 3 ثانية للسماح للجسيمات ليتم سحبها في مجرى الهواء.
   3. إغلاق صمام الكرة الأقرب إلى فراغ مولد ثم إغلاق صمام الكرة الأقرب إلى مرشح هيبا. تسمح للهواء من خزان لتدفق طوال فترة التجربة حسب الضرورة.
   4. إغلاق الصمامات الرئيسية ومنظم في خزان الهواء لوقف التدفق. تنظيف الكرة الصمامات ومولد فراغ استخدام الإيثانول 70%. اﻷوتوكﻻف أنابيب معدنية للتعقيم.

3-ترسب قياس كفاءة استخدام بيفيك

ملاحظة: يجب إجراء عوامل التعرض الهباء الجوي في غطاء دخان.

1. قياس الترسيب بجمع الأيروسول نانوحبيبات النحاس التي تم إنشاؤها في الخطوة 2، 2 في عامل تصفية قبل موزون. استخدام الجرعة المودعة، تقاس باستخدام كتلة التي تم جمعها في عامل التصفية، والجرعة المعطاة، يتم قياسها باستخدام كمية جسيمات النحاس موزون، لتحديد كفاءة الترسيب.
   1. الحفاظ على الزجاج المسام ميكرومتر 1.00 الألياف المرشحات تحت ظروف الرطوبة المنخفضة، الموصوفة في 1.1.2, لمالا يقل عن 24 ساعة قبل التعرض قبل القياسات. وزن عامل تصفية غير مستخدمة ثلاث مرات وسجل الأوزان عامل التصفية. إدراج مكان عامل التصفية غير مستخدمة في ثقافة خلية.
   2. اختر الخلية المناسبة الثقافة إدراج محول (6 بئر أو بئر 24) بيفيك لدعم إدراج ثقافة الخلية مع عامل التصفية. مكان ثقافة الخلية إدراج قطعة محول على رأس القاعدة بيفيك، وضع موضع التنفيذ أن قاعدة قطعة محول أوسع من الأعلى.
   3. إدراج استخدام الملقط لوضع التصفية تحميل خلية ثقافة داخل قطعة محول. وضع رأس قطعة فوق قطعة محول، تسوية في مكان يكون قاعدة رأس قطعة أكبر من الأعلى. التفاف بيفيك مع طبقة واحدة من شريط لاصق.
   4. ربط قطعة كاسيت 37 ملم في أعلى وأسفل بيفيك طريق دفع في مكانها. ضع ¼ "الشائكة محولات في كاسيت مدخل ومخرج.
   5. لف سخان مقاوم حول بيفيك أن الأسلاك في الأساس. الشريط لتأمين.
   6. التفاف بيفيك ~ 8 جولات من رقائق الألومنيوم للعزل. تأمين مع الشريط.
   7. الاتصال 2 قطعة طويلة من 1/2 "القطر الخارجي أنابيب مرنة بالمحول على رأس بيفيك. إزالة الأنابيب المسامية من الماء المعقم ومكان داخل الأنابيب على رأس بيفيك.
   8. بيفيك مكان داخل المشبك العصابة على الوقوف وآمنة. اكتمال الإعداد مع مضخة فراغ وعدادات الجسيمات، والهباء الجوي الإنشاء.
      ملاحظة: يمكن تحديد الجرعة المودعة على أساس عدد إلا إذا عدادات الجسيمات يتم وضعها قبل بيفيك وبعد بيفيك في تشغيل منفصلة.
   9. كشف عوامل تصفية باستخدام الخطوة 2-2 من البروتوكول ومعدلات التعرض المطلوب الوقت والتدفق، في هذه الدراسة تم استخدامه لوقت تعرض 10 دقيقة في 0.5 LPM. إزالة بيفيك من الإنشاء. تأخذ بها إدراج ثقافة الخلية وتصفية المكشوفة في الفلتر تحت ظروف الرطوبة المنخفضة لمالا يقل عن 24 ساعة قبل القياسات.
   10. بيفيك نظيفة مع الإيثانول 70%. تعقيم بالأشعة فوق البنفسجية لمالا يقل عن 30 دقيقة قبل التجربة المقبلة.
   11. وزن عامل التصفية تعرض ثلاث مرات وسجل الأوزان عامل تصفية. مكان التصفية المكشوفة في حامل تصفية مسمى للتخزين.

4-حساب جرعة المودعة وكفاءة الترسيب

ملاحظة: معرفة الترسب أمر مهم للإدارة الهباء الجوي وتفسير الاستجابة الخلوية.

1. حساب ترسب من القياسات المستندة إلى كتلة
   1. حساب كتلة المودعة في عوامل التصفية كالفرق بين متوسط الوزن للتعرض لما قبل وبعد التعرض متوسط الوزن. هذه القيمة هي الجرعة المودعة المستندة إلى كتلة للتجربة.
   2. استخدام إدارة الإعلام، م_المشرف، والمستندة إلى كتلة أودعت الجرعة تحدد في 4.1.1، م_dep، لحساب كفاءة الترسيب المستندة إلى كتلة، η_م، للتجربة.
      
   3. متوسط القيم من 4.1.1 و 4.1.2 للتجارب على الأقل 3 لتحديد ترسب وترسب كفاءة بيفيك لحجم الجسيمات.
2. حساب ترسب من القياسات على أساس عدد
   1. التأكد من أن القياسات مع عدادات الجسيمات قد أجريت مع عدادات بعد بيفيك ولتحديد تركيز الجسيمات قبل بيفيك. دمج تركيز الجسيمات على مر الزمن للعداد الجسيمات ثم دمج أكثر الجسيمات القطر لتحديد المجموع الجسيمات قياسه.
   2. حساب عدد الجسيمات المودعة كالفرق بين الجسيمات التي تديرها والجسيمات قياس الوظيفة-بيفيك. هذه القيمة هي الجرعة المودعة على أساس عدد للتجربة.
   3. استخدام إدارة الجسيمات، ن_المشرف، على أساس عدد أودعت تي الجرعة، ن_dep، معدل التدفق الحجمي، والخامس، والوقت،، لحساب كفاءة الترسيب على أساس عدد, η_ن، للتجربة.
      
   4. متوسط القيم من 4.2.2 و 4.2.3 للتجارب على الأقل 3 لتحديد الترسب وكفاءة الترسيب بيفيك لحجم الجسيمات.

5-الأيروسول التعرض للخلايا

ملاحظة: للخلية يشار الثقافة في واجهة الهواء السائل القارئ فارغة وآخرون. ³⁸ مشغلي يجب إجراء إدراج ثقافة الخلية تحميل (الخطوات 5.1.2-5.1.4) داخل مجلس الوزراء السلامة الأحيائية. ينبغي أداء مشغلي التعرض الهباء الجوي في غطاء دخان.

1. خلايا الثقافة في واجهة الهواء السائل
   1. رفع خلايا A549 من قارورة الثقافة عن طريق إضافة التربسين-يدتا، 3 مل لقارورة T75 أو 1 مل لقارورة T25 واحتضان لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية. إضافة مل 7 وسائط كاملة لقارورة T75 أو 4 مل من وسائل الإعلام كاملة T25 قارورة بقارورة وشطف الجدار قارورة مع تعليق خلية إلى أقصى حد عدد الخلايا المستردة. نقل تعليق خلية أنبوب مخروطي عقيمة 15 مل ثم خلايا أجهزة الطرد المركزي في 800 x ز لمدة 3 دقائق.
   2. إزالة طافية المحتوية على التربسين-يدتا وريسوسبيند بيليه الخلية في 10 مل من وسائل الإعلام كاملة. إزالة 10 ميليلتر من تعليق خلية، وإضافة إلى هيموسيتوميتير. حساب عدد الخلايا باستخدام هيموسيتوميتير لتحديد التركيز والعدد الكلي للخلايا.
   3. ضع 0.5 مل وسائط كاملة لكل بئر داخل صفيحة جيدا 24. مكان إدراج ثقافة الخلايا غير المستخدمة في الآبار. إدراج ثقافة الخلية البذور على الجانب قمي في كثافة خلية قرب 1 × 10⁵ خلايا/سم² لأنواع الخلايا التي تنمو بمعدل قرب مضاعفة في اليوم الواحد. للبذور A549 إدراج الخلايا ضمن 24 جيدا، وإدراج خلايا البذور في كثافة 1 × 10⁵ خلايا/سم² بإضافة خلايا 35,000 في ثقافة الخلية.
      ملاحظة: يمكن المصنف الخلايا بمعدل نمو أبطأ في بكثافة خلية زيادة.
   4. إضافة وسائط كاملة إلى جانب قمي إدراج ثقافة الخلية للوصول إلى وحدة التخزين النهائي (للوحة جيدا 24 الحجم النهائي 0.25 مل).
   5. الثقافة لمدة 7 أيام في ظروف المغمورة، واستبدال وسائط الإعلام كل يوم 1-2. بعد 7 أيام، إزالة قمي وسائط الإعلام والثقافة لمدة يوم واحد على الأقل في ظروف على، واستبدال وسائط الإعلام باسولاتيرال فقط.
2. تجميع بيفيك
   1. السماح بحجته إلى واجهة الهواء السائل لمالا يقل عن 24 ساعة قبل التعرض للخلايا.
   2. اختر الخلية المناسبة الثقافة إدراج محول بيفيك لدعم إدراج ثقافة الخلية مع عامل التصفية. إدراج ثقافة الخلية مكان قطعة محول على رأس بيفيك قاعدة، وضع موضع التنفيذ أن قاعدة قطعة محول أوسع من الأعلى. إضافة 4 مل من خلية ثقافة وسائل الإعلام من قاعدة بيفيك جيدا.
   3. إدراج استخدام الملقط لوضع ثقافة الخلية داخل قطعة محول وضعت في الخطوة 5.2.3. وضع رأس قطعة فوق قطعة محول، تسوية في مكان يكون قاعدة رأس قطعة أكبر من الأعلى. بعناية، التفاف بيفيك مع طبقة واحدة من شريط لاصق.
   4. ربط قطعة كاسيت 37 ملم في أعلى وأسفل بيفيك، عن طريق دفع في مكانها. ضع ¼ "الشائكة محولات في كاسيت مدخل ومخرج.
   5. لف سخان مقاوم حول بيفيك أن الأسلاك في الأساس. الشريط لتأمين.
   6. التفاف بيفيك ~ 8 جولات من رقائق الألومنيوم للعزل. تأمين مع الشريط.
   7. قم بتوصيل قطعة قصيرة من 1/2 "القطر الخارجي أنابيب مرنة للمحول على رأس بيفيك. إزالة الأنابيب المسامية من الماء المعقم ومكان داخل الأنابيب على رأس بيفيك.
   8. بيفيك مكان داخل المشبك العصابة على الوقوف وآمنة. إكمال إنشاء مضخة فراغ والهباء الجوي الإنشاء.
3. تعرض الخلايا على استخدام بيفيك
   1. استخدام كفاءة الترسيب المحدد في الخطوة 2 لحساب كتلة الجزيئات لتكون الضبوبيه. وزن الكتلة المناسبة وإضافة إلى النظام الأيروسول أنشئت في أعقاب الخطوة 2 داخل غطاء الدخان.
   2. فضح الخلايا عن طريق اتباع الخطوة 2، 2، وفي هذه الدراسة من نقاط النهاية البيولوجية الخلايا قد تعرضت لحوالي 3.5 ملغ من جسيمات نانوية النحاس بمعدل تدفق 0.5 LPM ومدة تعرض للحد الأدنى 10 دراسات مراقبة أداء استخدام الهواء هوميديفيد لتحديد تأثير الهواء وحدها. إزالة بيفيك من الإنشاء. تأخذ بها إدراج ثقافة الخلية ومكان في لوحة جيدا العقيمة والعودة إلى الحاضنة₂ CO (37 درجة مئوية، 5% CO₂، 90% رطوبة نسبية).
   3. نضح وسائل الإعلام من بيفيك. إذا كان إجراء المزيد من التجارب، مخزنة أسفل شطف بيفيك مع الفوسفات الحل ثم كرر الخطوة 5، 1 و 5-2.
   4. بيفيك نظيفة مع الإيثانول 70% عند الانتهاء. تعقيم بالأشعة فوق البنفسجية لمالا يقل عن 30 دقيقة قبل التجربة المقبلة.
4. إجراءات المقايسة البيولوجية
   ملاحظة: فحوصات القيام في هذه الدراسة تم توليد الأكسدة عن طريق التحليل دا دكفه وسيتوتوكسيسيتي من خلال إطلاق سراح نازعة لاكتات (رابطة حقوق الإنسان).
   1. حل 24.4 مغ من دكفه دا في الميثانول 50 مل لجعل الحل 1 مم دكفه دا. ويمكن تخزين هذا الحل في-20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 4 أشهر. تمييع 1 مم دكفه دا الحل عن طريق خلط 0.1 مل من 1 مم دا دكفه حل مع 9.9 مل حبس جعل 10 مل من 10 ميكرون دكفه-da.
   2. إزالة إدراج الثقافة خلية الإعلام الثقافة والغسيل الخلية مع حوالي 1 مل من برنامج تلفزيوني. إضافة 0.5 مل من 10 ميكرون دا دكفه حل لكل بئر، الاستعاضة عن إدراج عند الانتهاء. وتغطي اللوحة برقائق الألومنيوم لمنع فوتواكتيفيشن الصبغة والعودة إلى 37 درجة مئوية حاضنة ح 1.
   3. إزالة خلايا من الحاضنة ونضح الحل العامل دكفه دا من الآبار. إضافة 0.5 مل حبس للآبار واستبدال إدراج ثقافة الخلية.
   4. تحميل لوحة جيدا في لوحة قارئ والتدبير الأساس الفلورية استخدام أطوال موجية الإثارة/الانبعاثات من 485/530 نانومتر. إزالة لوحة من إدراج القارئ وتحميل لوحة إلى بيفيك للتعرض.
   5. تعرض الخلايا لمدة التعرض المرجوة. إزالة إدراج من بيفيك والعودة إلى لوحة جيدا. إزالة 50 ميليلتر من السوائل basolateral من لوحة جيدا والمكان في اللوحة البيضاء 96 جيدا. قياس الأسفار من منتدى التعاون الإنمائي استخدام أطوال موجية الإثارة/الانبعاثات من 485/530 نانومتر كل 30 دقيقة بعد التعرض ح 2.
   6. واسمحوا السائل basolateral حجته إلى درجة حرارة الغرفة عن 20-30 دقيقة إضافة 50 ميليلتر من رابطة حقوق الإنسان المقايسة الحل، بروتوكول الشركة المصنعة التالية مختلطة، والسوائل basolateral من لوحة جيدا وترك الرد للحد الأدنى 10 إضافة 25 ميليلتر من موقف حل جيد. قراءة الأسفار منتج ريسوروفين باستخدام موجات الإثارة/الانبعاثات من 560/590 نانومتر.
   7. إزالة السوائل باسولاتيرال إضافية وكرر الخطوة 5.4.6 في ح 4 و 24 ساعة بعد التعرض.

6 الأساليب الإحصائية

1. تحليل بيانات المقايسة البيولوجية
   1. تقرير الإنتاج روس كزيادة كثافة fluorescence الخلايا المعالجة بالنسبة لقياسات أساسية. تقرير نشاط رابطة حقوق الإنسان كزيادة كثافة fluorescence الخلايا المعالجة بالنسبة للخلايا غير المعالجة.
   2. أداء عامل وحيد ANOVA لتحديد الفروق الإحصائية بين مجموعات البيانات. عند الاقتضاء، إجراء الطالب تي-اختبارات في قيمة الأهمية 0.05. الإبلاغ عن البيانات يعني ± الانحراف المعياري للقياسات التعرض ثلاثة على الأقل.

النتائج

علم السموم المهنية في المختبر ينطوي على الحفاظ على استمرارية الخلوية أثناء أداء التعرض الهباء الجوي. ويرد النظام بيفيك في الشكل 2، بما في ذلك درجة الحرارة والرطوبة المراقبة بيفيك البالية. وأبقى درجة الحرارة باستخدام سخان مقاوم البطارية وزيادة الأير...

Discussion

أشرطة الكاسيت تصفية توفر طريقة بسيطة وغير مكلفة لجمع الهباء الجوي في منطقة التنفس؛ غير أن الهباء الجوي العينات المستخرجة من المرشحات تمثل الأيروسول كاملة (أي غازات والتطاير والجسيمات) وبالتالي الحد من تقييم الآثار البيولوجية ذات الصلة. استخدام التصميم الأولى للكاسيت تصفية 37 ملم، بيفيك ي...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Scanning mobility particle sizer (SMPS)	TSI, Inc.	3910	NanoSMPS
Optical particle sizer (OPS)	TSI, Inc.	3330
Stainless Steel Pipe, 4" Long	McMaster-Carr	4830K116	Standard-Wall 304/304L, Threaded on Both Ends, 1/8 Pipe Size
Brass Ball Valve with Lever Handle	McMaster-Carr	4112T12	Compact High-Pressure Rating, 1/8 NPT Female
Steel Pipe, 2" Long	McMaster-Carr	7753K121	Standard Wall, Threaded on One End, 1/8 Pipe Size
HEPA filter	GE Healthcare	09-744-12	HEPA-Cap Disposable Air Filtration Capsule
Vacuum Generator	PISCO USA	VCH10-018C
PIVEC	VCU		For design please contact authors
Resistive heater
1/4" barbed connectors	Zefon International, Inc.	459743
Porous tubing	Scientific Commodities, Inc.	BB2062-1814A	Hydrophilic 10 um pores
Battery power bank
Cell culture insert	Fisherbrand	353095	24 well plate insert
Filter Forceps	Fisherbrand	09-753-50
Transfer Pipette	ThermoScientific	13-711-27
Glass Fiber Filters	SKC	225-7	Binder-Free Type AE Filter 37 MM 1.00 um pore
Ultra Micro Balance	A&D	BM-22	Housed in environmental chamber
37 mm filter cassette	SKC	225-3250	Filter Cassette Blank, 37 mm, Clear Styrene
Variable flow vacuum pump	SKC	220-5000TC	AirChek TOUCH, 5 to 5000 mL/min
Copper Particles	U.S. Research Materials, Inc.	US1090	40 nm
Copper Particles	U.S. Research Materials, Inc.	US1088	100 nm
Copper Particles	U.S. Research Materials, Inc.	US1117M	800 nm