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  • Déclarations de divulgation
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  • matériels
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  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Nous présentons ici un protocole pour effectuer des expositions portable cellulaire aérosol et mesurer la réponse cellulaire. La méthode utilise des cellules, cultivées à l’interface air-liquide, imitant en vivo physiologie. Réponse cellulaire aux aérosols de nanoparticules de cuivre a été observée dans le stress oxydatif grâce à la génération d’espèces réactives de l’oxygène et la cytotoxicité dans le communiqué de la lactate déshydrogénase.

Résumé

Ce protocole introduit un nouveau in vitro l’exposition système, pouvant être portés, y compris de sa caractérisation et performance. Systèmes de l’interface air-liquide (ALI) in vitro exposition sont souvent grands et encombrants, rendant le transport au champ et au fonctionnement à la source de l’émission ou la zone de respiration difficile. Grâce à la miniaturisation de ces systèmes, le laboratoire peut être amené au champ, accélérer les temps de traitement et en fournissant une méthode plus appropriée d’exposition qui n’altère pas l’aérosol avant de communiquer avec les cellules. Le Portable In vitro l’exposition Cassette (HONZÁK) s’adapte une cassette de filtre 37 mm pour permettre in vitro des essais de toxicité à l’extérieur du laboratoire traditionnel. Le HONZÁK a été caractérisée à l’aide de trois tailles de nanoparticules de cuivre afin de déterminer l’efficacité de dépôts basée sur gravimétrique et analyse de concentration nombre de particules. Cytotoxicité initiale expériences ont été réalisées avec des cellules pulmonaires exposées afin de déterminer la capacité du système de dépôt des particules tout en préservant la viabilité des cellules. Le HONZÁK offre une efficacité similaire ou une augmentation des dépôts lors de la comparaison d’appareils disponibles écoulement perpendiculaire in vitro d’exposition. Malgré le débit d’échantillon inférieur, la petite taille donne certains avantages au courant in vitro ALI systèmes d’exposition. Il s’agit de la capacité à être portés pour la surveillance personnelle, la mobilité du laboratoire à la source d’émission et l’option de mettre en place plusieurs systèmes de résolution spatiale tout en conservant un utilisateur plus faible coûtent. Le HONZÁK est un système capable de recueillir des aérosols sur le terrain et au sein de la zone de respiration sur un modèle air-relié, in vitro .

Introduction

Échantillonnage individuel en utilisant des techniques in vitro pourrait fournir des informations complètes concernant les effets biologiques des aérosols sur le lieu de travail. 1 exposition à des contaminants dans l’air inclure l’exposition au produit chimique lui-même, pour les échantillons d’air recueillis, dans des conditions submergées, où le gaz est introduit à la suspension cellulaire, exposition intermittente à l’aide d’un périphérique comme un rocker, ou direct expositions à l’interface air-liquide (ALI). 2 plusieurs de ces techniques sont effectuées avec des cellules cultivées en suspension ou de la collecte d’échantillons avant l’exposition, dont chacun peut affecter l’étude toxicologique à cause de changements potentiels dans l’aérosol. 3 pour éviter ces changements, le laboratoire peut être amené à ce champ en utilisant plusieurs in vitro systèmes d’exposition de la culture ALI qui sont utilisés dans la littérature,4,5,6,7, 8,9,10,11,12,13 cependant, peu sont disponibles dans le commerce. 8 , 9 , 12 ces systèmes sont souvent volumineux, surtout quand les instruments pour réguler la température et l’humidité de l’environnement cellulaire et du débit de l’aérosol d’échantillon. En utilisant le HONZÁK, expositions de l’aérosol peuvent être réalisées en dehors d’un paramètre de laboratoire traditionnel ou la zone de respiration en imitant les conditions de l’inhalation.

La détermination de l’aerosol deposition in vitro est importante pour l’étude des effets de santé en raison de l’inhalation. La zone de respiration, la zone de moins de 30 cm de la bouche et le nez,14 est cruciale pour comprendre l’exposition aux nanoparticules et un lien vers les effets biologiques dans les poumons. 2 souvent, les dépôt sur les cellules est défini comme un rendement de dépôts, les particules déposées sur et absorbé par les cellules divisés par les particules administrées au système6,15 , ou sur une base massive des mêmes montants. 4 , 16 les méthodes actuelles pour mesurer les aérosols présents dans la zone de respiration sont filtre basé, capturant les particules sur une période donnée d’échantillonnage en utilisant les filtres de mener des essais supplémentaires. 17 surveillance personnelle nécessite un petit système qui vient avec le compromis de moins d’échantillons.

Il existe de nombreuses approches pour déterminer les effets sur la santé d’une exposition à un aérosol. Le modèle ALI permet l’aérosol à administrer directement aux cellules par l’intermédiaire de l’air comme dans un scénario d’exposition réelle, mais il est plus rentable et moins intensif de temps qu’in vivo études tout en imitant les barrières d’air liquide tels que les yeux, peau et les poumons. Poumon cellules cultivées à l’ILA ont la capacité de générer une couche barrière polarisée,18,19 , qui produit des caractéristiques physiologiques qui ressemblent à l’épithélium de poumon en vivo , y compris la production de mucus et agent tensio-actif en particulier lignées de cellules bronchiques ou alvéolaire, cils,19 des jonctions serrées,19,20 et cellules de polarisation. 18 changements comme ceux-ci peuvent affecter la réponse cellulaire mesurée dans les études de toxicité. 21 en outre, modèle, ALI in vitro résultats sont souvent plus sensibles que les cellules exposées par suspension modèles22 et sont capables de modèle aiguë in vivo toxicité par inhalation. 23 , 24 c’est pourquoi, un système d’exposition ALI qui est capable d’effectuer des mesures au sein de la zone de respiration est une étape naturelle.

En exposant les cellules à aérosols directement à la source d’émission, étude sur les effets de tous les gaz, les composés semi-volatils et particules impliquées dans le mélange se produit. Lorsque le mélange est recueilli sur un filtre, les gaz et les composés volatils ne sont pas capturés et le mélange entier ne peut pas être l’objet d’une enquête. En outre, reconstitution des particules dans une poudre ou une suspension liquide peut conduire à l’agrégation ou interactions particule-fluide, comme la dissolution, en suspension liquide. 25 , 26 lorsque des particules d’aérosol sont ajoutés au liquide, il y a un potentiel plus élevé d’agglomération, formation27 25,de corona de protéines,28 ou interaction avec des composés dans le liquide, qui peut affecter des dépôts et influencer la réponse biologique. 29 , 30

Exposition à l’ILA repose sur trois profils principaux aérosol, nuage des flux parallèles, décantation et écoulement perpendiculaire. Cloud s’installant, utilisé par exposition de cellule pour l’Interface Air-liquide (ALICE),4 est un système de traitement par lots où déposent des particules par gravitation et diffusion s’installer comme l’aérosol est traité comme une seule unité. Les flux parallèle, utilisée par les aérosols électrostatiques in vitro l’exposition système (gouttières)5 et Multiculture exposition chambre (MEC) II,6 permet pour les dépôts par le biais de l’ajout du mouvement brownien par le profil d’écoulement. Écoulement perpendiculaire, utilisé par un microsprayer,7 Nano aérochambre pour toxicité In Vitro (NACIVT),11 et commercial ALI systèmes8,9,10,12, ajoute l’impaction de particules dans la zone de dépôt. Beaucoup de ces systèmes d’exposition sont grands et encombrants, exigeant des systèmes excédentaires pour aérosol pré conditionnement, pompes pour l’écoulement, ou même de chauffage des chambres pour l’incubation des cellules. Cette grande taille diminue la portabilité du système. Au lieu de prélèvement à la source d’émission, ces systèmes ont souvent apportés à des aérosols de laboratoire ou modèle générés pour l’analyse des échantillons. La complexité de l’aérosol émis peut être perdue dans la traduction sur le terrain au laboratoire. Le HONZÁK est plus petit que les systèmes actuels, avec une surface extérieure d’environ 460 cm2 et ne pesant que 60 grammes, avec contrôle thermique et d’humidité intégré dans le système permettant à un périphérique portable. La diminution de taille et le poids permettent au système d’être porté ou prises à la source d’exposition, permettant le prélèvement direct.

La grande taille des systèmes actuels de l’exposition diminue également la capacité d’effectuer l’échantillonnage pour enquêter sur des gradients spatiaux dans les concentrations. Cette résolution est la clé pour déterminer les effets toxicologiques de nombreux risques pour l’environnement et des risques professionnels tels que les activités de matière ou lieu de travail particules d’échappement véhicules où aérosolisation se produit. Immédiatement après émission, il devient une variance spatiale dans la concentration de particules. Cela se développe avec le temps que les particules se dispersent dans l’atmosphère et ces effets peuvent changer selon les conditions ambiantes, tels que température, pression, vent et soleil. Les particules peuvent commencer à l’âge et oxyder ainsi une fois émis31,32 et taux de dispersion sont affectés par la topographie ; On trouvera des concentrations plus élevées dans les canyons et les tunnels, où les effets de dispersion sont ralenties, et des concentrations plus faibles se trouvent là où il y a une grande surface de dispersion. 33 ces changements dans les taux de dispersion peuvent avoir des effets importants sur la santé humaine et peuvent être vu quand on compare le nombre d’asthmatiques adultes vivant en urbain ou en milieu rural. 34 alors que de nombreux systèmes d’exposition fournissent plusieurs échantillons à la fois, plusieurs systèmes sont nécessaires avec une abondance de gros équipements pour effectuer la résolution spatiale.

En apportant le laboratoire sur le terrain, le temps d’analyse peut être diminué en utilisant la cellule entière comme un capteur. Suite de points de terminaison et les mécanismes biologiques connus peut aider à la détermination de la composition des aérosols et de la taille. En raison de méthodes de dégagement lent, y compris la clairance mucociliaire, phagocytose et translocation, ces particules sont souvent en interaction avec les cellules pour quelque jours à semaines3 génératrices de stress oxydatif, l’inflammation et même la mort des cellules. Ces points de terminaison biologiques peuvent être les points de départ pour les voies d’issue défavorable pour les maladies cardiovasculaires ou les maladies pulmonaires obstructives chroniques. En outre, Wiemenn et coll. réalisé un tableau in vitro tests à comparer avec les valeurs de la littérature à court terme en vivo toxicité par inhalation. 35 In vivo la réponse a été prévue avec deux des quatre résultats positifs des tests de cytotoxicité par communiqué de la lactate déshydrogénase, stress oxydatif, de réduction et peroxyde d’hydrogène la formation de glutathion et libération et inflammation potentielle de le gène de facteur de nécrose tumorale alpha. Hors des oxydes métalliques dix taille nano testés, six testées comme active (oxyde de titane, oxyde de zinc et quatre l’oxyde de cérium différents) à l’aide d’expositions in vitro avec confirmation en vivo. 

Afin d’étudier les effets des aérosols dans un milieu professionnel, notre laboratoire a développé le HONZÁK pour des expositions dans le domaine. En outre, le HONZÁK peut être porté pendant l’échantillonnage individuel de surveiller et d’enquêter sur l’exposition par inhalation comme le 37 mm filtre cassette36 ou plusieurs systèmes peuvent être utilisés pour obtenir une résolution spatiale dans une zone donnée. Dans ce protocole, la caractérisation et l’utilisation de la HONZÁK est discutée. Après l’exposition, les effets biologiques sont observés à travers des analyses de cytotoxicité.

Protocole

Les opérateurs doivent porter les équipements de protection individuelle (blouse, gants, lunettes) lorsque les étapes 1, 2, 3, 5 et 6.

1. préparation des matériaux

  1. Préparer du matériel pour l’assemblage du système et l’exposition à assurer la répétabilité.
    1. Assurez-vous d’utilisation nouvelle ou 70 % éthanol nettoyé ¼" diamètre intérieur conducteur tube et ¼" diamètre extérieur connecteurs pour l’assembly system.
    2. Magasin matériaux d’essai y compris les filtres, les composants HONZÁK, pince à épiler et poudres de particules dans un environnement bien contrôlé, en ce qui concerne la température et l’humidité, pendant au moins 24 h avant l’expérience.
      Remarque : La température doit être à température ambiante, environ 20 ° C, avec une humidité relative inférieure à 35 %. C’est très important pour obtenir la répétabilité entre les expériences.
    3. Préparer des compteurs de particules à l’aide d’alcool isopropylique pour nettoyer les pièces et permettre le warm-up du système selon les recommandations du fabricant, y compris la numérisation sizer de particule de mobilité (SMPS) et sizer de particules optique (OPS) pour la mesure.

2. génération d’aérosols secs

Remarque : Les opérateurs devraient effectuer la génération d’aérosol sous une hotte.

  1. Assembler un système permettant de générer des aérosols secs
    Remarque : La suspension des particules dans les gaz ou un liquide doit être adaptée pour la culture modélisée de demande et de la cellule. La méthode suivante peut être effectuée à l’aide d’un aérosol à base de liquide. La conception du système aérosol sec provient de Tiwari et al. 37 une représentation schématique du système sec de dispersion est illustrée à la Figure 1.
    1. Raccorder la vanne à bille à chaque extrémité de la tubulure de taille fileté 4" 1/8, cela servira la trémie de la particule. Raccorder 2" 1/8 taille tuyau à un robinet.
    2. Peser les nanoparticules de cuivre, dans cette étude, la concentration en masse pour chaque taille de particule est maintenue constante tout en déterminant l’efficacité du dépôt. Environ utiliser 7,5 mg de 40 nm cuivre nanoparticules, 7 mg de nanoparticules de cuivre nm 100 et 13 mg de 800 nm cuivre nanoparticules par exposition. Placez les nanoparticules de cuivre dans la trémie de particules à travers l’extrémité ouverte.
      Remarque : La quantité de cuivre nanoparticules pesées servira la masse fonction concentration administrée.
    3. Placer un 3" ½" diamètre extérieur (OD) tube autour du tuyau de 2" et place un HEPA filtre à l’intérieur de ce tube court telle que la direction de l’écoulement soit par l’intermédiaire de la valve à bille.
    4. Connecter le générateur de vide à autre robinet à tournant sphérique à l’aide de filetage. Connecter le générateur de vide à réservoir d’air en plaçant un tube de 5/16" OD dans la connexion de la pousser à bloquer. Utilisez ¼" OD tuyauterie pour raccorder la sortie du générateur de vide pour le montage de l’expérience en plaçant le tuyau sur la sortie du générateur de vide.
  2. Utilisation du système sec aérosol pour générer des aérosols secs
    1. Ouvrir le réservoir d’air en tournant la soupape principale et permettre la circulation d’air dans le système. Ouvrez la valve sur le régulateur de débit sur le réservoir d’air et définissez tels que le débit à travers le système équivaut aux réglages désirés sur la pompe à vide.
    2. Ouvrez le robinet le plus proche de filtre HEPA, puis ouvrez le robinet le plus proche de générateur de vide. Gardez ces ouvert pour environ 3 s pour laisser les particules soit introduit dans le flux d’air.
    3. Fermer le robinet le plus proche de générateur de vide, puis fermez le robinet le plus proche de filtre HEPA. Permettre à l’air du réservoir s’écouler pendant la durée de l’expérience comme nécessaire.
    4. Fermer les vannes principales et régulateur de réservoir d’air pour arrêter l’écoulement. Robinets à tournant sphérique propres et générateur de vide à l’aide d’éthanol à 70 %. Tuyaux en métal autoclave pour la stérilisation.

3. dépôts efficacité mesure utilisant HONZÁK

Remarque : Les opérateurs doivent exécuter expositions aérosol sous une hotte.

  1. Mesurer la déposition en recueillant l’aérosol de nanoparticules de cuivre généré à l’étape 2.2 sur un filtre préalablement pesé. Utiliser la dose déposée, mesurée à l’aide de la masse recueillie sur le filtre et la dose administrée, mesurée à l’aide de la quantité de particules de cuivre pesés, pour déterminer l’efficacité du dépôt.
    1. Garder à 1,00 µm pore filtres verre fibre dans des conditions de faible humidité, décrites au paragraphe 1.1.2, pendant au moins 24 h avant les mesures avant l’exposition. Peser un filtre non utilisé trois fois et noter les poids du filtre. Place le filtre non utilisé dans une culture cellulaire insérer.
    2. Choisissez cellule appropriée la culture insert adaptateur (puits 6 ou 24 puits) pour HONZÁK soutenir l’insert de culture cellulaire avec le filtre. Place de la culture de cellules insérez-y adaptateur sur le dessus de la base de HONZÁK, mise en place, tels que la base de la pièce de l’adaptateur est plus large que haut.
    3. Utilisation pince à épiler pour placer la culture de cellules de filtre chargé insérer dans l’adaptateur. Placez le dessus du pied au sommet de la pièce de l’adaptateur, s’installer en place tel que la base de la pièce supérieure est plus large que haut. Envelopper HONZÁK avec une seule couche de ruban adhésif.
    4. Brancher pièces cassette 37 mm en haut et en bas de HONZÁK en poussant en place. Placer ¼" barbée adaptateurs en sortie et d’entrée cassette.
    5. Envelopper le chauffage résistif autour HONZÁK tels que les fils sont à la base. Ruban pour garantir.
    6. Envelopper HONZÁK avec ~ 8 tours de papier d’aluminium pour l’isolation. Fixez avec du ruban adhésif.
    7. Connect 2" long morceau de 1/2" diamètre extérieur des tuyaux flexibles à l’adaptateur sur le dessus de HONZÁK. Enlevez le tube poreux de l’eau stérile et le déposer dans le tube sur le dessus de HONZÁK.
    8. HONZÁK place au sein de la pince sur le stand de l’anneau et sûr. Set-up complet avec la pompe à vide, compteurs de particules et montage de l’aérosol.
      Remarque : La dose déposée reposant sur le numéro peut être déterminée que si les compteurs de particules sont placés avant le HONZÁK et après le HONZÁK sur des pistes séparées.
    9. Exposer des filtres à l’aide étape 2.2 du protocole et taux de temps et débit exposition souhaitée, dans la présente étude qu'a été utilisé un temps de pose de 10 min à 0,5 l/min. Retirez HONZÁK de la mise en place. Retirez l’insert de culture cellulaire et placer le filtre exposé dans le porte-filtre dans des conditions de faible humidité pendant au moins 24 h avant les mesures.
    10. HONZÁK propre avec l’éthanol à 70 %. Stérilisation à la lumière ultraviolette pendant au moins 30 min avant l’expérience suivante.
    11. Peser le filtre exposé trois fois et noter les poids du filtre. Placer le filtre exposé dans un porte-filtre marqué pour le stockage.

4. calcul de la Dose déposée et l’efficacité de dépôts

NOTE : La connaissance des dépôts est importante pour l’administration d’aérosols et l’interprétation de la réponse cellulaire.

  1. Calculer les dépôts de mesures basées sur la masse
    1. Calculer la masse déposée sur les filtres comme la différence entre le poids moyen de pré-exposition et poids moyen après l’exposition. Cette valeur est la dose déposée basée sur la masse pour l’expérience.
    2. Utilisation administré masse, madmin, et basée sur la masse déposée dose déterminée en 4.1.1, mdep, pour calculer l’efficacité basée sur la masse des dépôts, ηm, pour l’expérience.
      figure-protocol-8294
    3. Valeurs moyennes de 4.1.1 et 4.1.2 au moins 3 expériences pour déterminer le dépôt et l’efficacité de la déposition pour HONZÁK pour la taille des particules.
  2. Calculer les dépôts de mesures basées sur le nombre
    1. S’assurer que les mesures avec des compteurs de particules ont été effectuées avec compteurs après la HONZÁK et pour déterminer la concentration de particules avant le HONZÁK. Intégrer la concentration de particules dans le temps pour le compteur de particules puis intégrer sur le diamètre des particules pour déterminer le total des particules mesurées.
    2. Calculer le nombre de particules déposées comme la différence entre les particules administrés et le post-HONZÁK particules mesurées. Cette valeur est la dose déposée reposant sur le numéro pour l’expérience.
    3. Utilisation administrée particules, nadmin, reposant sur le numéro déposés dose, ndep, débit volumétrique, V et temps, t, pour calculer l’efficacité reposant sur le numéro de dépôt, ηn, pour l’expérience.
      figure-protocol-9460
    4. Valeurs moyennes de 4.2.2 et 4.2.3 au moins 3 expériences pour déterminer le dépôt et l’efficacité de la déposition pour HONZÁK pour la taille des particules.

5. aérosols exposition des cellules

Remarque : Pour la cellule culture à l’interface air-liquide le lecteur est appelée vide et al. 38 les opérateurs doivent exécuter insert de culture cellulaire chargement (mesures 5.1.2-5.1.4) au sein d’une cabinet de biosécurité. Les opérateurs devraient effectuent expositions aérosol sous une hotte.

  1. Cellules de culture à l’Interface Air-liquide
    1. Soulever des cellules A549 du flacon de culture en ajoutant la trypsine-EDTA, 3 mL pour une fiole T75 ou 1 mL pour une fiole T25 et incuber pendant 5 min à 37 ° C. Ajouter 7 mL de médias complet pour une fiole T75 ou 4 mL de support complet pour un T25 fiole de fiole et le mur de fiole de rinçage avec suspension cellulaire afin de maximiser le nombre d’éléments récupérés. Transférer la suspension de cellules dans un tube conique stérile de 15 mL puis centrifuger les cellules à 800 x g pendant 3 min.
    2. Retirez le surnageant contenant la trypsine-EDTA et resuspendre le culot dans 10 mL de médias complet. Retirer 10 µL de suspension cellulaire et ajouter à l’hémocytomètre. Compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre pour déterminer la concentration et le nombre total de cellules.
    3. Verser 0,5 mL de médias complet dans chaque puits dans une plaque 24 puits. Placer les inserts de culture cellulaire non utilisés dans les puits. Culture de cellules de semences insère du côté apical à une densité cellulaire près de 1 x 105 cellules/cm2 pour les types de cellules qui se développent à un taux près de doublement par jour. Aux semences A549 cellules dans un 24 bien insérer, insérer à une densité de 1 x 105 cellules/cm2 en ajoutant 35 000 cellules dans la culture de cellules, les cellules de semences.
      Remarque : Les cellules avec un taux de croissance plus lent peuvent être semés à une densité accrue des cellules.
    4. Ajouter des éléments multimédias complètes du côté apical de l’insert de culture cellulaire pour atteindre le volume final (pour 24 volume final plaque puits est 0,25 mL).
    5. Culture pendant 7 jours dans des conditions submergées, remplaçant les médias tous les jours 1-2. Après 7 jours, retirez les médias apicale et la culture pendant au moins 1 jour dans des conditions de ALI, remplacer uniquement les médias basolatérale.
  2. Assembler HONZÁK
    1. Permettre aux cellules de s’équilibrer à l’interface air-liquide pendant au moins 24 h avant l’exposition.
    2. Choisissez cellule appropriée la culture insert adaptateur pour HONZÁK soutenir l’insert de culture cellulaire avec le filtre. Culture de cellules de lieu insérez-y adaptateur sur le dessus de HONZÁK base, mise en place, tels que la base de la pièce de l’adaptateur est plus large que haut. Ajouter 4 mL de milieux de culture cellulaire dans le puits de la base de la HONZÁK.
    3. Utilisation pince à épiler pour placer la culture de cellule insérer dans l’adaptateur pièce placée à l’étape 5.2.3. Placez le dessus du pied au sommet de la pièce de l’adaptateur, s’installer en place tel que la base de la pièce supérieure est plus large que haut. Enveloppez soigneusement, HONZÁK avec une seule couche de ruban adhésif.
    4. Brancher pièces cassette 37 mm en haut et en bas de HONZÁK, en poussant en place. Placer ¼" barbée adaptateurs en sortie et d’entrée cassette.
    5. Envelopper le chauffage résistif autour HONZÁK tels que les fils sont à la base. Ruban pour garantir.
    6. Envelopper HONZÁK avec ~ 8 tours de papier d’aluminium pour l’isolation. Fixez avec du ruban adhésif.
    7. Se connecter à petit morceau de tuyau flexible 1/2" diamètre extérieur à la carte sur le dessus de HONZÁK. Enlevez le tube poreux de l’eau stérile et le déposer dans le tube sur le dessus de HONZÁK.
    8. HONZÁK place au sein de la pince sur le stand de l’anneau et sûr. Compléter l’installation avec la pompe à vide et la configuration d’aérosol.
  3. Exposer les cellules à ALI, à l’aide de la HONZÁK
    1. Efficacité de dépôt déterminée à l’étape 2 permet de calculer la masse des particules pour être en aérosol. Peser la masse approprié et ajouter au système aérosol mis en place après l’étape 2 dans la hotte.
    2. Exposer les cellules en suivant l’étape 2.2, dans cette étude des paramètres biologiques les cellules sont exposées à environ 3,5 mg de nanoparticules de cuivre avec un débit de 0,5 l/min et une durée d’exposition de 10 min. des études de contrôle effectuées l’air humidifié pour déterminer l’influence de l’air seul. Retirez HONZÁK de la mise en place. Retirez l’insert de culture cellulaire, placer la plaque bien stérile et revenir à l’incubateur à CO2 (37 ° C, 5 % CO2, 90 % HR).
    3. Aspirer les médias de HONZÁK. Si vous effectuez d’autres expériences, bas de rinçage de HONZÁK avec phosphate buffered solution puis répétez l’étape 5.1 et 5.2.
    4. HONZÁK propre avec de l’éthanol 70 % lorsque vous avez terminé. Stérilisation à la lumière ultraviolette pendant au moins 30 min avant l’expérience suivante.
  4. Procédures de dosage biologique
    NOTE : Analyses exécutées dans cette étude étaient de cytotoxicité par libération de lactate déshydrogénase (LDH) et génération de stress oxydatif grâce à l’analyse de DHFC-DA.
    1. Dissoudre 24,4 mg de DHFC-DA dans 50 mL de méthanol pour rendre la solution 1 mM DHFC-DA. Cette solution peut être conservée à-20 ° C pendant 4 mois. Diluer 1 mM DHFC-DA solution en mélangeant 0,1 mL de 1 mM DHFC-DA solution avec 9,9 mL HBSS faire 10 mL de 10 µM DHFC-DA.
    2. Supprimer de lavage et milieux de culture cellulaire insert de culture cellulaire avec environ 1 mL de PBS. Ajouter 0,5 mL de solution de DHFC-DA 10 µM dans chaque puits, remplacement des plaquettes lorsque vous avez terminé. Plaque avec du papier d’aluminium pour empêcher photoactivation du colorant et retour à l’incubateur de 37° C pendant 1 h.
    3. Éliminer les cellules de l’incubateur et aspirer la solution de travail DHFC-DA des puits. Ajouter 0,5 mL HBSS aux puits et remplacer les inserts de culture cellulaire.
    4. Charger la plaque bien en fluorescence de base lecteur et mesure de plaque à l’aide de longueurs d’onde d’excitation/émission de 485/530 nm. Enlever plaque à plaque lecteur et charge insert dans HONZÁK pour l’exposition.
    5. Exposer les cellules pour la durée de l’exposition souhaitée. Enlevez l’insert de HONZÁK et revenir à plaque bien. 50 µL de fluide basolatérale retirez de la plaque bien et placer dans une plaque bien blanc 96. Mesurer la fluorescence des DCF en utilisant les longueurs d’onde d’excitation/émission de 485/530 nm toutes les 30 minutes après exposition pendant 2 h.
    6. Laissez basolatérale liquide est proportionnelle à la température ambiante pendant 20 à 30 min. ajouter 50 µL de solution de dosage LDH, protocole mixte de fabricant suivant, basolatérale fluide de plaque puits et laisser réagir pendant 10 min. ajouter 25 µL de solution d’arrêt bien. Lire la fluorescence du produit résorufine en utilisant les longueurs d’onde d’excitation/émission de 560/590 nm.
    7. Éliminer le liquide supplémentaire basolatérale et répétez l’étape 5.4.6 à 4 h et 24h après de l’exposition.

6 méthodes statistiques

  1. Analyse des données du test biologique
    1. Production de ROS de rapport que l’augmentation d’intensité de fluorescence des cellules traitées par rapport à des mesures de base. Rapport d’activité LDH comme l’augmentation d’intensité de fluorescence des cellules traitées par rapport aux cellules non traitées.
    2. Effectuer seul facteur ANOVA pour déterminer des différences statistiques entre les ensembles de données. Le cas échéant, effectuer les tests t étudiant à une valeur de signification de 0,05. Rapport de données comme la moyenne ± écart-type d’au moins trois mesures de l’exposition.

Résultats

Professionnelle in vitro de toxicologie comprend le maintien de la viabilité cellulaire tout en effectuant l’exposition aérosol. Le système HONZÁK est montré dans la Figure 2, y compris la température et contrôle de l’humidité et la HONZÁK usé. La température a été maintenue à l’aide d’un appareil de chauffage résistif alimenté par batterie et l’aérosol humidifié à l’aide d’augmenté humidification naturelle à traver...

Discussion

Cassettes de filtre fournissent une méthode simple et peu coûteuse de recueillir des aérosols dans la zone de respiration ; Cependant, extraits des filtres des échantillons d’aérosols ne pas représenter l’aérosol entier (gaz, les substances volatiles et particules) et par conséquent limiter l’évaluation des effets biologiques associés. À l’aide de la conception initiale de la cassette de filtre 37 mm, le HONZÁK est conçu pour maintenir la portabilité et imiter la déposition en vivo de par...

Déclarations de divulgation

L’affiliation des auteurs est comme indiqué sur la page couverture. Les auteurs sont financés par la Virginia Commonwealth University, où les travaux étaient achevés à Richmond, en Virginie. Les auteurs ont seul responsable de la rédaction et le contenu du présent document. Les auteurs déclarent qu’il n’y a aucun intérêts opposés.

Remerciements

Les auteurs aimeraient remercier Boris Solomonov et l’atelier d’usinage Virginia Commonwealth Innovation pour aider avec le prototypage rapide de l’appareil. Les auteurs aimeraient également remercier Cristian Romero-Fuentes du groupe Lewinski, Dr Vitaliy Avrutin, Dr. Dmitry Pestov et la Virginia Commonwealth nanomatériaux Core caractérisation Facility pour leur aide avec la caractérisation des particules. Ce travail a été soutenu par des fonds de démarrage fournis au Dr. Lewinski par la faculté d’ingénierie à la Virginia Commonwealth University.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
Scanning mobility particle sizer (SMPS)TSI, Inc.3910NanoSMPS
Optical particle sizer (OPS)TSI, Inc.3330
Stainless Steel Pipe, 4" LongMcMaster-Carr4830K116Standard-Wall 304/304L, Threaded on Both Ends, 1/8 Pipe Size
Brass Ball Valve with Lever HandleMcMaster-Carr4112T12Compact High-Pressure Rating, 1/8 NPT Female
Steel Pipe, 2" LongMcMaster-Carr7753K121Standard Wall, Threaded on One End, 1/8 Pipe Size
HEPA filterGE Healthcare09-744-12HEPA-Cap Disposable Air Filtration Capsule
Vacuum GeneratorPISCO USAVCH10-018C
PIVECVCUFor design please contact authors
Resistive heater
1/4" barbed connectorsZefon International, Inc.459743
Porous tubingScientific Commodities, Inc.BB2062-1814AHydrophilic 10 um pores
Battery power bank
Cell culture insertFisherbrand35309524 well plate insert
Filter ForcepsFisherbrand09-753-50
Transfer PipetteThermoScientific13-711-27
Glass Fiber FiltersSKC225-7Binder-Free Type AE Filter 37 MM 1.00 um pore
Ultra Micro BalanceA&DBM-22Housed in environmental chamber
37 mm filter cassetteSKC225-3250Filter Cassette Blank, 37 mm, Clear Styrene
Variable flow vacuum pumpSKC220-5000TCAirChek TOUCH, 5 to 5000 mL/min
Copper ParticlesU.S. Research Materials, Inc.US109040 nm
Copper ParticlesU.S. Research Materials, Inc.US1088100 nm
Copper ParticlesU.S. Research Materials, Inc.US1117M800 nm

Références

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