一种用于气溶胶取样的新型便携式体外曝光盒

摘要

在这里, 我们提出了一个协议, 以执行便携式细胞气溶胶暴露和测量细胞反应。该方法使用细胞, 生长在空气液体界面,模仿体内生理。通过活性氧的产生和乳酸脱氢酶释放的细胞毒性, 观察到细胞对铜纳米颗粒气溶胶的反应为氧化应激。

摘要

该协议引入了一种新的体外暴露系统, 能够磨损, 包括其特性和性能。体外接触系统中的空气-液体界面 (ali) 通常是大的和笨重的, 使在排放源或呼吸区内的场和操作运输变得困难。通过这些系统的小型化, 实验室可以被带到现场, 加快处理时间, 并提供更合适的曝光方法, 在接触细胞之前不改变气溶胶。便携式体外曝光盒 (pivec) 采用37毫米滤镜盒, 允许在传统实验室环境之外进行体外毒性测试。利用三种尺寸的铜纳米粒子对 pivec 进行了表征, 在重量和颗粒数量浓度分析的基础上确定了沉积效率。对暴露的肺细胞进行了初步的细胞毒性实验, 以确定该系统在保持细胞活力的同时沉积颗粒的能力。与体外接触设备中可用的垂直流动相比, pivec 提供了类似或更高的沉积效率。尽管样品吞吐量较低, 但小尺寸为目前的体外 ali暴露系统提供了一些优势。其中包括个人监测所需佩戴的能力、从实验室到排放源的流动性, 以及在保持较低用户成本的同时设置多个空间分辨率系统的选项。pivec 是一个系统, 能够收集气溶胶在现场和呼吸区到一个空气接口,体外模型。

引言

使用体外技术进行个人取样可以提供有关气溶胶在工作场所的生物效应的全面信息。¹接触空气中的污染物包括在将气体引入电池悬浮液的淹没条件下接触到化学品本身、接触采集到的空气样本、使用摇杆等装置进行间歇性接触或直接接触在空气-液体界面 (ali) 处曝光。²其中许多技术是在悬浮液中生长的细胞或在接触前收集样品的情况下进行的, 由于气溶胶的潜在变化, 每一种技术都会影响毒理学研究。³为避免这些变化, 可以使用文献中使用的几个体外ali 培养暴露系统将实验室带到现场, 这些系统在^{文献中使用, 4,5},^{6, 7,然而,8、9、10、11、12、13很少有}商业产品可供选择。^8,9,12这些系统通常体积庞大, 特别是在包括调节细胞环境的温度和湿度以及样品气溶胶流量的仪器时。通过使用 pivec, 气溶胶暴露可以在传统实验室环境之外进行, 也可以在呼吸区内进行, 同时模拟吸入条件。

体外气溶胶沉积的测定对研究吸入对健康的影响具有重要意义。呼吸区, 距离口腔和鼻子不到 3 0 厘米的区域,^{1 4}对于了解纳米颗粒的暴露程度和与肺部的生物效应联系起来至关重要。²通常, 细胞上的沉积被定义为沉积效率, 即沉积在细胞上并由被给系统^{的粒子 6、15 或}在相同数量的质量基础上吸收的颗粒。^{4 个,16}目前测量呼吸区气溶胶的方法是以过滤器为基础的, 在给定的采样期间捕获粒子, 并使用过滤器进行进一步的测试。¹⁷个人监控需要一个小系统, 附带较少样本的权衡。

有许多方法可以确定暴露于气溶胶对健康的影响。ali 模型允许气雾剂通过空气直接给细胞, 就像在实际暴露情况下一样, 但它比体内研究更具成本效益, 时间密集程度更低, 同时模仿空气液体屏障, 如眼睛,皮肤和肺。在 ali 生长的肺细胞具有产生偏振屏障层的能力, 18-19,^产生类似于体内肺上皮的生理特征, 包括特定的粘液和表面活性剂的产生支气管或肺泡细胞系, 纤毛跳动,^19个紧密连接,^19个,^20个和细胞极化。¹⁸这样的变化会影响毒性研究中测量的细胞反应。²¹此外, ali体外模型结果往往比通过悬浮液模型²²暴露的细胞更敏感, 能够在体内模拟急性吸入毒性。^23,24因此, 能够在呼吸区内进行测量的 ali 暴露系统是自然的下一步。

通过将细胞直接暴露在排放源处的气溶胶中, 就会对混合物中的所有气体、半挥发性化合物和颗粒的影响进行调查。当混合物收集在过滤器上时, 气体和挥发性化合物不会被捕获, 也无法对整个混合物进行调查。此外, 将颗粒重组为粉末或液体悬浮液会导致液体悬浮液中的聚集或颗粒-流体相互作用, 如溶解。^25,26当气溶胶颗粒被添加到液体中时, 聚集的可能性较高,^25, 27 形成蛋白质电晕, 28 或与液体中的化合物相互作用,^这可能会影响沉积和影响生物反应。^29,30

ali 的暴露是基于三个主要的气溶胶剖面, 云沉降, 平行流动, 和垂直流动。云沉降, 空气-液界面细胞暴露 (alice) 使用,⁴是一个批处理系统, 其中粒子沉积通过重力和扩散沉降作为气溶胶作为一个单位处理。平行流动, 由静电气溶胶体外暴露系统 (eaves)⁵和多文化曝光室 (mec) ii, 6 允许沉积通过增加布朗运动通过流动剖面。垂直流量, 由一个微喷雾器,⁷纳米气溶胶室用于体外毒性 (nacivt),¹¹和商业 ali 系统^8,9,^{10, 12},^增加了冲击沉积区域内的颗粒。其中许多暴露系统体积大、体积大, 需要过多的气雾剂预处理系统、流量泵, 甚至是细胞孵化加热室。这种较大的尺寸降低了系统的可移植性。而不是直接在排放源取样, 这些系统往往有样品带到实验室或模型气溶胶产生进行分析。从现场到实验室的转换可能会降低发射气溶胶的复杂性。pivec 比当前系统更小, 外部表面积约为460厘米² , 重量仅为60克, 并在系统中集成了热和湿度控制, 可实现高度便携的设备。尺寸和重量的减少使系统能够磨损或带到接触源, 从而允许直接取样。

目前暴露系统的巨大规模也降低了进行取样以调查浓度空间梯度的能力。在确定许多潜在环境和职业危害的毒理影响时, 该决议是关键, 例如发生雾化的车辆排气颗粒物或工作场所活动。发射后, 粒子浓度立即出现空间方差。这随着粒子在整个大气中的扩散而随时间增长, 这些影响可能会根据温度、压力、风和太阳等环境条件而改变。颗粒一旦发出^31、32,就会开始老化和氧化, 扩散率也会受到地形的影响;在峡谷和隧道中会发现浓度较高, 那里的分散效应会变慢, 在分散面积较大的地方可以发现浓度较低。³³ . 分散率的这些变化可对人类健康产生重大影响, 在比较生活在城市和农村的哮喘成年人人数时可以看到这些变化。³⁴ . 虽然许多曝光系统同时提供多个样本, 但需要多个系统, 并配备大量大型设备来执行空间分辨率。

通过将实验室带到现场, 可以通过使用整个细胞作为传感器来减少分析时间。遵循已知的生物机制和终点可以帮助确定气溶胶的组成和大小。由于缓慢的清除方法, 包括黏膜清除, 吞噬, 和移位, 这些粒子往往与细胞相互作用约几天到^第3周产生氧化应激, 炎症, 甚至细胞死亡。这些生物终点可能是心血管疾病或慢性阻塞性肺病不良结局途径的起点。此外, wiemenn等人还进行了一系列体外检测, 以便与短期体内吸入毒性的文献值进行比较。³⁵通过乳酸脱氢酶释放、谷胱甘肽还原和过氧化氢的形成和释放以及炎症潜能检测细胞毒性的四个阳性结果中的两个预测了体内反应。肿瘤坏死因子α基因。在10种纳米金属氧化物测试中, 6 种使用体外暴露进行活性测试 (氧化钛、氧化锌和4种不同的氧化锆),并在体内确认。 

为了研究气溶胶在职业环境中的影响, 我们的实验室开发了用于现场曝光的 pivec。此外, 可以佩戴 pivec 进行个人取样, 以监测和调查吸入暴露情况, 如37毫米滤芯盒³⁶或多个系统可用于在给定区域内实现空间分辨率。在该协议中, 讨论了 pisec 的特性和使用。接触后, 通过细胞毒性检测观察生物效应。

研究方案

操作人员在执行步骤1、2、3、5和6时必须佩戴个人防护设备 (如实验室涂层、手套、护目镜)。

1. 材料的制备

1. 准备系统装配和曝光材料, 以确保可重复性。
   1. 确保在系统装配中使用新的或70% 的乙醇清洗的 "内径导电管和外径连接器。
   2. 在实验前, 将包括过滤器、pivec 组件、推子和颗粒粉末在内的测试材料存储在控制良好的环境中, 在温度和湿度方面至少24小时。
      注: 温度应接近室温, 约 20°c, 相对湿度低于35%。这对于实现实验之间的可重复性非常重要。
   3. 准备使用异丙醇清洁部件的粒子计数器, 并根据制造商的建议进行系统预热, 包括用于测量的扫描移动性颗粒片 (smps) 和光学颗粒片 (ops)。

2. 干式气溶胶的产生

注: 操作人员应在烟罩中进行气溶胶生成。

1. 组装一个系统以产生干燥的气溶胶
   注: 气体或液体中颗粒的悬浮液应适用于模拟应用和细胞培养。以下方法可以使用基于液体的气溶胶来执行。干式气雾剂系统的设计来自 tiwari等人。³⁷干分散系统的示意图如图 1所示。
   1. 将球阀连接到 4 "1.5 大小的螺纹管的每一端, 这将作为粒子料斗。将 2 "1.5 大小的管道连接到一个阀门。
   2. 在确定沉积效率的同时, 对不同粒径的质量浓度保持恒定。近似使用7.5 毫克的40纳米铜纳米颗粒, 7 毫克的100纳米铜纳米颗粒, 和13毫克800纳米铜纳米粒子每次接触。通过开口端将铜纳米颗粒放入粒子料斗中。
      注: 称量的铜纳米颗粒的用量将作为质量为基础的管理浓度。
   3. 将 3 "片半" 管在 2 "管周围放置, 并在这个短管内放置一个 hepa 过滤器, 使流动方向通过球阀。
   4. 使用螺纹将真空发生器连接到其他球阀。将真空发生器连接到空气罐, 将一个/1 6 英寸的 od 管放入推送锁定连接中。使用-"od 管将真空发生器的出口放置在真空发生器的出口上, 将其连接到实验装置。
2. 使用干式气溶胶系统生成干气溶胶
   1. 通过转动主阀打开气罐, 并允许气流进入系统。打开空气罐上流量调节器上的阀门, 并设置为通过系统的流量相当于真空泵上所需的设置。
   2. 打开离 hepa 滤清器最近的球阀, 然后打开离真空发生器最近的球阀。保持这些开放约 3秒, 以允许粒子被拉到气流中。
   3. 关闭最接近真空发生器的球阀, 然后关闭最接近 hepa 过滤器的球阀。必要时, 允许油箱中的空气在实验期间流动。
   4. 关闭空气罐上的主阀门和调节器阀门, 以阻止流动。使用70% 乙醇清洁球阀和真空发生器。用于灭菌的高压灭菌金属管。

3. 使用 pivec 测量沉积效率

注: 操作人员应在烟罩中进行气溶胶暴露。

1. 通过在预称滤波器上收集步骤2.2 中产生的铜纳米颗粒气溶胶来测量沉积。使用沉积剂量, 使用过滤器上收集的质量进行测量, 并使用称重铜颗粒量测量的给值剂量, 以确定沉积效率。
   1. 在低湿度条件下保持1.00 微米的孔隙玻璃纤维过滤器 (1.1.2 所述), 在曝光前测量前至少24小时。对未使用的滤清器称重三次, 并记录滤清器的重量。将未使用的筛选器放在单元培养插入中。
   2. 为 pivec 选择合适的细胞培养插入适配器 (6 孔或24孔), 以支持与过滤器一起插入细胞培养。将细胞培养件插入适配器件放在 pivec 基座的顶部, 设置到位, 使适配器件的基座比顶部宽。
   3. 使用推子将过滤加载的细胞培养插入物放置在适配器件中。将顶部件放在适配器件的顶部, 沉降到位, 使顶部的底部比顶部宽。用一层管道胶带包裹 pivec。
   4. 通过推入到位, 连接 piveec 顶部和底部的37毫米盒式磁带件。将带刺的适配器放入盒式进气道和出气口。
   5. 将 pivec 周围的电阻加热器包裹起来, 使电线位于底座上。要保护的磁带。
   6. 用 ~ 8 轮铝箔包裹 pivec 进行绝缘。用磁带固定。
   7. 将 2个 "长的半" 外径软管连接到 piveec 顶部的适配器。从无菌水中取出多孔管, 并将其放置在 pivec 顶部的管材内。
   8. 将 pivec 放置在环支架上的夹具内并保持安全。通过真空泵、粒子计数器和气雾剂设置完成设置。
      注: 基于数字的沉积剂量只能在粒子计数器放置在 pivec 之前和 pivec 之后单独运行的情况下才能确定。
   9. 使用协议的步骤2.2 和所需的曝光时间和流量公开过滤器, 本研究使用了 0.5 lpm 时10分钟的曝光时间。从设置中删除 pivec。取出细胞培养物插入并将暴露的过滤器放置在低湿度条件下的过滤器支架中, 在测量前至少24小时。
   10. 用70% 乙醇清洁 pivec。在下一次实验之前, 用紫外线消毒至少30分钟。
   11. 对暴露的滤清器称重三次, 并记录滤清器的重量。将暴露的过滤器放在带标签的过滤器支架中进行存储。

4. 沉积剂量和沉积效率的计算

注: 对沉积的了解对于气溶胶的管理和细胞反应的解释很重要。

1. 根据质量测量计算沉积
   1. 计算过滤器上的沉积质量作为曝光前平均重量和曝光后平均重量之间的差异。这个值是实验的基于质量的沉积剂量。
   2. 在4.1.1 中确定的给量质量、m_管理和基于质量的沉积剂量, 计算了基于质量的沉积效率, 为实验计算了 m。
      
   3. 4.1.1 的平均值和4.1.2 至少3个实验, 以确定 pivec 的沉积和沉积效率的粒径。
2. 根据数字测量计算沉积
   1. 确保在 pivec 之后使用计数器进行了粒子计数器测量, 并在 pivec 之前确定粒子浓度。随着时间的推移, 将粒子浓度与粒子计数器集成, 然后在颗粒直径上进行整合, 以确定测量的总颗粒。
   2. 计算沉积粒子数作为被施用的粒子和在 pivec 后测量的粒子之间的差异。此值是实验的基于数字的沉积剂量。
   3. 采用给药剂颗粒、n_管理、数字沉积剂量、n_dep、体积流量、v、时间等方法, 计算出基于数字的沉积效率, 为实验进行计算.
      
   4. 4.2.2 的平均值和4.2.3 至少3个实验, 以确定 pivec 的沉积和沉积效率的粒径。

5. 细胞的气溶胶暴露

注: 为细胞培养在空气液体接口读者提到空白等人。³⁸操作人员应在生物安全柜内进行细胞培养插入加载 (步骤 5.1.2-5.1.4)。操作人员应在烟罩中进行气溶胶暴露。

1. 空气-液体界面中的培养细胞
   1. 通过添加胰蛋白酶 edta、t75 烧瓶3毫升或 t25 烧瓶3毫升, 在37°c 下孵育 5分钟, 从培养瓶中提取 a549 细胞。添加7毫升的完整介质为 t75 烧瓶或4毫升的完整介质的 t25 烧瓶烧瓶和冲洗烧瓶壁与细胞悬浮液, 以最大限度地恢复细胞数量。将细胞悬浮液转移到无菌的15毫升锥形管, 然后以 800 x g离心细胞3分钟。
   2. 取出含有胰蛋白酶 edta 的上清液, 并在10毫升的培养基中重新悬浮细胞颗粒。去除10μl 细胞悬浮液, 加入血细胞计。用血细胞仪计数细胞, 以确定细胞的浓度和总数。
   3. 将 0.5 ml 的完整介质放置在24井板内的每个井。将未使用的细胞培养插入物放入井中。种子细胞培养在顶端的一侧插入, 细胞密度接近 1 x^{10 5}细胞/厘米² , 用于以每天近一倍的速度生长的细胞类型。为了在24井插入中播种 a549 细胞, 种子细胞的密度为 1x10 5细胞 2, 在细胞培养中加入 35, 000个细胞插入。
      注: 生长速度较慢的细胞可以在细胞密度增加的情况下播种。
   4. 添加完整的培养基到细胞培养插入的顶端一侧, 达到最终体积 (24 孔板最终体积为0.25 毫升)。
   5. 在水下条件下培养 7天, 每1-2天更换一次介质。7天后, 在 ali 条件下, 取出顶端培养基和培养物至少 1天, 只替换基外侧培养基。
2. 组装 pibec
   1. 在暴露前, 允许细胞平衡到空气-液体界面至少24小时。
   2. 为 pivec 选择适当的细胞培养插入适配器, 以支持与过滤器一起插入细胞培养。将细胞培养插入适配器件放在 pivec 基座的顶部, 设置到位, 使适配器件的基座比顶部宽。在 pivec 基部的井中加入4毫升的细胞培养基。
   3. 使用推子将细胞培养插入物放置在放置在步骤5.2.3 中的适配器件内。将顶部件放在适配器件的顶部, 沉降到位, 使顶部件的底部比顶部宽。小心地用一层管道胶带包裹 pivec。
   4. 通过推入到位, 连接 piveec 顶部和底部的37毫米盒式磁带件。将带刺的适配器放入盒式进气道和出气口。
   5. 在 pivec 周围包裹电阻加热器, 使电线在基座上。要保护的磁带。
   6. 用 ~ 8 轮铝箔包裹 pivec 进行绝缘。用磁带固定。
   7. 将半直径软管的短片连接到 piveec 顶部的适配器上。从无菌水中取出多孔管, 并将其放置在 pivec 顶部的管材内。
   8. 将 pivec 放置在环支架上的夹具内并保持安全。通过真空泵和气雾剂设置完成设置。
3. 使用 pisec 在 ali 处释放细胞
   1. 使用步骤2中确定的沉积效率来计算要雾化的颗粒质量。称量适当的质量, 并添加到气雾剂系统设置以下步骤2内的烟罩。
   2. 按照步骤2.2 释放细胞, 在这项生物终点的研究中, 细胞接触到大约3.5 毫克的铜纳米颗粒, 流速为 0.5 lpm, 接触时间为10分钟。空气的影响单独。从设置中删除 pivec。取出细胞培养物插入, 放置在无菌井板中, 然后返回到 co₂孵化器 (37°C, 5% co 2,90% rh)。
   3. 从 pivec 吸收媒体。如果进行额外的实验, 用磷酸盐缓冲溶液冲洗 pivec 底部, 然后重复步骤5.1 和5.2。
   4. 用70% 乙醇清洁 pivec。在下一次实验之前, 用紫外线消毒至少30分钟。
4. 生物检测程序
   注: 本研究中进行的检测是通过 dcfh-da 分析产生氧化应激, 以及通过乳酸脱氢酶 (ldh) 释放产生细胞毒性。
   1. 在50毫升甲醇中溶解24.4 毫克 dcfh-da, 制成 1 mL dcfh-da 溶液。此解决方案可在20°C 存储长达4个月。将 1 mm dcfh-da 溶液与 9.9 ml hbss 混合, 将 1 mm dcfh-da 溶液混合 0.1 ml, 制成 10μm dcfh-da 的10ml。
   2. 去除细胞培养培养基, 用大约1毫升的 pbs 洗细胞培养。在每口井上加入0.5 毫升 10μm dcfh-da 解决方案, 完成后更换刀片。盖板与铝箔, 以防止染料的光活化, 并返回37°C 孵化器1小时。
   3. 从孵化器中取出细胞, 并从井中吸气 dcfh-da 工作溶液。在油井中加入 0.5 ml hbss, 并更换细胞培养插入物。
   4. 将井板加载到读卡器中, 并使用 485530 nm 的发射波长测量基线荧光。从读卡器中取出板, 并将插入 pivec 进行曝光。
   5. 将细胞暴露在所需的曝光时间内。从 pivec 中取出刀片, 返回到良好的板材。从井板上取出50μl 的基底外侧流体, 放在白色96井板中。使用485530纳米的发射波长测量 dcf 的荧光, 曝光后每 30分钟2小时一次。
   6. 让基外侧流体平衡到室温 20-30. 加入50μl 的 ldh 检测溶液, 按照制造商协议混合, 到井板的基外侧流体, 并作出反应 10分钟, 加入25μl 的停止溶液。使用 560/590 纳米的发射波长读取间素产品的荧光。
   7. 在接触后4小时和24小时内取出额外的基底外侧液体, 并重复步骤5.4.6。

6统计方法

1. 生物检测数据分析
   1. 报告 ros 的生产, 因为相对于基线测量, 处理过的细胞的荧光强度增加。报告 ldh 活性, 因为相对于未经处理的细胞, 经处理的细胞的荧光强度增加。
   2. 执行单因素方差分析以确定数据集之间的统计差异。在适当的情况下, 以0.05 的重要值进行学生 t 考试。报告数据作为至少三次曝光测量的均值±标准偏差。

结果

职业体外毒理学包括在接触气溶胶时维持细胞活力。pivec 系统如图 2所示, 包括温度和湿度控制以及磨损的 pivec。温度使用电池供电的电阻加热器和气雾剂通过多孔湿管使用增加的自然加湿进行加湿。在实验室内的受控气溶胶设置中, 可以设置 pivec 进行曝光, 如图 1所示。通过对该系统进行表征, 可以确定细胞上的沉积剂量...

讨论

滤芯提供了一种简单、廉价的方法来收集呼吸区的气溶胶;然而, 从过滤器中提取的气溶胶样本并不代表整个气溶胶 (即气体、挥发物和微粒), 因此限制了对相关生物效应的评估。pivec 采用37毫米滤芯盒的初步设计, 旨在保持可移植性, 并模拟吸入颗粒的体内沉积。pivec 明显小于当前的 ali 曝光系统, 大约与包含温度和湿度控制的纸巾盒的大小相当。大小类似于个人级联撞击器, 同时提供有关细?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Scanning mobility particle sizer (SMPS)	TSI, Inc.	3910	NanoSMPS
Optical particle sizer (OPS)	TSI, Inc.	3330
Stainless Steel Pipe, 4" Long	McMaster-Carr	4830K116	Standard-Wall 304/304L, Threaded on Both Ends, 1/8 Pipe Size
Brass Ball Valve with Lever Handle	McMaster-Carr	4112T12	Compact High-Pressure Rating, 1/8 NPT Female
Steel Pipe, 2" Long	McMaster-Carr	7753K121	Standard Wall, Threaded on One End, 1/8 Pipe Size
HEPA filter	GE Healthcare	09-744-12	HEPA-Cap Disposable Air Filtration Capsule
Vacuum Generator	PISCO USA	VCH10-018C
PIVEC	VCU		For design please contact authors
Resistive heater
1/4" barbed connectors	Zefon International, Inc.	459743
Porous tubing	Scientific Commodities, Inc.	BB2062-1814A	Hydrophilic 10 um pores
Battery power bank
Cell culture insert	Fisherbrand	353095	24 well plate insert
Filter Forceps	Fisherbrand	09-753-50
Transfer Pipette	ThermoScientific	13-711-27
Glass Fiber Filters	SKC	225-7	Binder-Free Type AE Filter 37 MM 1.00 um pore
Ultra Micro Balance	A&D	BM-22	Housed in environmental chamber
37 mm filter cassette	SKC	225-3250	Filter Cassette Blank, 37 mm, Clear Styrene
Variable flow vacuum pump	SKC	220-5000TC	AirChek TOUCH, 5 to 5000 mL/min
Copper Particles	U.S. Research Materials, Inc.	US1090	40 nm
Copper Particles	U.S. Research Materials, Inc.	US1088	100 nm
Copper Particles	U.S. Research Materials, Inc.	US1117M	800 nm