JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Burada, taşınabilir hücresel aerosol Etkilenmeler gerçekleştirmek ve hücre tepkisini ölçmek için bir iletişim kuralı mevcut. Hücreleri, hava-sıvı arayüzü içinde vivo Fizyoloji taklit eden, yetiştirilen yöntemini kullanır. Bakır nanopartikül aerosoller için hücresel yanıt Reaktif oksijen türleri üretimi ve sitotoksisite laktat dehidrogenaz yayın olarak oksidatif stres olarak gözlendi.

Özet

Bu iletişim kuralı, onun karakterizasyonu ve performans dahil olmak üzere yıpranmış olan yetenekli bir yeni vitro pozlama sistemi, tanıttı. Hava-sıvı arayüzey (ALI) vitro pozlama sistemleri çoğu kez büyük ve hantal, alan ve işlem kaynak emisyon veya nefes bölgedeki ulaşım zorlaştırır. Bu sistemler minyatür laboratuarda işlem zamanı hızlandırdığını ve hücreleri başvurmadan önce aerosol değiştirmez daha uygun bir pozlama yöntemi sağlayan alanına getirilebilir. Belgili tanımlık taşınabilir vitro pozlama kaset (PIVEC) geleneksel laboratuvar ayarı dışında test vitro toksisite için izin vermek için 37 mm filtre kaset uyum sağlar. PIVEC gravimetrik üzerinde dayalı ifade verimliliği belirlemek için bakır nano tanecikleri üç boyutu kullanarak karakterize edildi ve parçacık numara konsantrasyon analizi. İlk sitotoksisite deneyler hücre canlılığı koruyarak parçacıklar yatırmak için sistem yeteneklerini belirlemek için Açık akciğer hücreleri ile gerçekleştirilmiştir. PIVEC ne zaman kullanılabilir dikey akışı vitro pozlama cihazlar için karşılaştırma ifade benzer veya artan verimlilik sağlar. Alt örnek çıktı rağmen küçük boyutlu pozlama sistemleri geçerli vitro için ALI bazı avantajlar sağlamaktadır. Bunlar kişisel izlemek için giyilmelidir içerir, emisyon kaynağı ve kurulum seçeneğine laboratuvarından hareketlilik daha düşük bir kullanıcı korurken Uzaysal çözünürlük için birden fazla sistemi maliyet. PIVEC aerosoller alanında ve bir hava-sızdı, vitro modeli üzerine nefes bölgedeki toplama yeteneğine sahip bir sistemdir.

Giriş

Vitro teknikleri kullanarak kişisel örnekleme aerosoller işyerinde biyolojik etkileri ile ilgili kapsamlı bilgi sağlayabilir. 1 Etkilenmeler havadaki kirleticiler için Etkilenmeler kimyasal kendisi, gaz aralıklı Etkilenmeler bir aygıtı gibi bir rock'çı, veya doğrudan kullanarak hücre süspansiyon için nerede tanıttı batık koşullar altında toplanan hava örnekleri için içerir. Etkilenmeler vasıl hava-sıvı arayüzey (ALI). 2 bu tekniklerin çoğu askıya alınması veya örnekleri her biri toksikolojik çalışma aerosol potansiyel değişiklikleri nedeniyle etkileyebilir maruz kalma önce topluluğu yetiştirilen hücreleri ile gerçekleştirilir. 3 bu değişiklikleri önlemek için laboratuvar birkaç vitro kullanarak alana literatürde,4,5,6,7kullanılan ALI kültür pozlama sistemleri getirilebilir, 8,9,10,11,12,13 ancak birkaç ticari olarak kullanılabilir. 8 , 9 , 12 bu sistemleri özellikle sıcaklık ve nem hücresel ortamı ve örnek aerosol debisi düzenleyen aletleri dahil olmak üzere hantal, çoğu kez. PIVEC kullanarak, aerosol Etkilenmeler dışında bir geleneksel laboratuvar ayarı veya nefes bölgedeki inhalasyon koşulları taklit ederken gerçekleştirilebilir.

Aerosol ifade vitro belirlenmesi sağlık etkileri nedeniyle inhalasyon incelenmesi için önemlidir. Nefes Bölge alanı içinde ağız ve burun,14 30 cm nano tanecikleri maruz anlamak için ve akciğerlerde biyolojik etkileri bağlantı için çok önemlidir. 2 kez, üzerine yatırılır ve sistem6,15 ' e veya aynı miktarda toplu olarak yönetilen parçacıklar bölünen hücreleri tarafından alınan parçacıklar bir ifade verimliliği ifade hücreleri üzerinde tanımlanır. 4 , 16 aerosoller nefes bölgedeki ölçmek için geçerli temel parçacıkların bir verilen örnekleme süre içinde yakalama ve daha fazla test yapmak için filtreleri kullanarak filtre yöntemlerdir. 17 kişisel gözlem daha az örnekleri bedeli ile gelir küçük bir sistem gerektirir.

Sağlık etkileri maruz kalmaya karşı bir aerosol belirlemek için pek çok yaklaşım vardır. ALI modeli olduğu gibi bir gerçek pozlama senaryo havada hücrelere doğrudan yönetilecek aerosol olanak sağlar ancak daha düşük maliyetli ve hava-sıvı engelleri gözleri gibi taklit ederken vivo içinde daha az zaman yoğun çalışmalar, deri ve akciğer. Akciğer hücreleri ALI yetiştirilen bir polarize bariyer tabaka, belirgin bir mukus ve yüzey aktif üretim dahil içinde vivo akciğer epitel benzer fiziksel özellikler üreten18,19 oluşturma yeteneği var bronş veya alveolar hücre hatları, dayak,19 sıkı kavşaklar,19,20 ve hücre polarizasyon kirpikler. 18 bunlar toksisite araştırmaları ölçülen hücresel yanıt etkileyebilir gibi değiştirir. 21 Ayrıca, ALI vitro modeli via süspansiyon modelleri22 kez daha fazla duyarlı hücreler daha maruz vardır ve mümkün olan modeli akut vivo içinde Soluma Toksisitesi için sonuçlar. 23 , 24 bu nedenle, doğal bir sonraki adım ise nefes bölgedeki ölçülerini gerçekleştirebilir bir ALI pozlama sistemi var.

Aerosol emisyon kaynağında doğrudan hücrelere teşhir ederek soruşturma tüm gazlar, yarı uçucu bileşikler ve parçacıklar karışımı dahil etkileri ortaya çıkar. Karışımı bir filtre üzerinde toplanır, gazlar ve uçucu bileşikler değil yakalanır ve tüm karışımı araştırıldı. Buna ek olarak, bir toz veya sıvı süspansiyon parçacıkların sulandırma toplama veya sıvı süspansiyon dağılması gibi parçacık-sıvı etkileşimleri yol açabilir. 25 , 26 aerosol parçacıkları sıvıya eklendiğinde orada olur Aglomerasyon,25,27 oluşumu bir protein corona,28 veya ifade etkileyebilir sıvı bileşikler ile etkileşim için daha yüksek bir potansiyeli ve biyolojik yanıt etkisi. 29 , 30

Pozlama, ALI üç ana aerosol profilleri, bulut halledilmesi, paralel akış ve dikey akışı dayanmaktadır. Yerleşme, hava-sıvı arayüzey hücre pozlama (ALICE) tarafından kullanılan bulut,4 toplu sistem nerede çekim ve diffusional aerosol tek bir birim olarak kabul edilir gibi yerleşme parçacıklar mevduat. Paralel akış, elektrostatik sprey vitro pozlama sistemi (SAÇAK)5 ve Multiculture maruz kalma Odası (MEC) II, tarafından kullanılan6 , Albert hareket akışı profilinden aracılığıyla ifade sağlar. Bir microsprayer,7 Nano Aerosol odası In-Vitro toksisite (NACIVT),11 ve ticari ALI sistemleri8,9,10,12, tarafından kullanılan dikey akışı sıkışması, ekler parçacıklar ifade bölgesi içinde. Bu pozlama sistemleri büyük ve hantal, aşırı sistemleri, Merkezi Klima pompalar akışının, önceden veya bile salonları kuluçka hücre için Isıtma aerosol için gerektiren çoğu. Bu büyük boy sistem taşınabilirliği azalır. Emisyon kaynağında doğrudan örnekleme yerine bu sistemler genellikle çözümleme için oluşturulan laboratuvar veya modeli aerosoller getirdi örnekleri var. Verilmiş aerosol karmaşıklığı laboratuvar alanından çeviri kayıp. PIVEC mevcut sistemleri, bir dış yüzey alanı yaklaşık 460 cm2 ile daha küçük ve sadece 60 gram, ısı ve nem kontrolü ile sistemine son derece taşınabilir aygıt için izin dahil. Düşük boyut ve ağırlık sistemin yıpranmış ya da doğrudan örnekleme izin maruz kalma, kaynak için alınan izin verin.

Geçerli pozlama sistemleri büyük boyutunu da yetenek konsantrasyonlarda kayma degradeler araştırmak için örnekleme yapmak azaltır. Bu çözünürlük birçok potansiyel çevresel ve mesleki tehlikeler araç egzoz partikül madde veya işyeri faaliyetleri gibi toksikolojik etkileri belirlerken Kloroformu oluştuğu anahtarıdır. Hemen sonrası emisyon, parçacık konsantrasyonu kayma bir sapma olur. Bu zamanla parçacıklar boyunca atmosfer dağıtmak ve bu etkilerin değiştirebilirsiniz sürece sıcaklık, basınç, Rüzgar ve güneş gibi ortam koşullarına göre büyür. Parçacıklar yaş ve de bir kez verilmiş31,32 okside başlayabilirsiniz ve dağılım oranları ve topografya tarafından etkilenir; kanyonlar ve nerede dağılım etkileri yavaşladı ve düşük konsantrasyonlarda bulunur tünelleri, daha yüksek konsantrasyonlarda bulundu olduğu yerde dağılım için büyük bir alan. 33 bu değişiklikler dağılım oranlarında insan sağlığı üzerinde önemli etkileri olabilir ve astımlı yetişkin kentsel kırsal ayarlarında karşı yaşayan sayısı karşılaştırırken görülebilir. 34 birçok pozlama sistemi aynı anda birden fazla örnekleri sağlarken, birden fazla sistemi Uzaysal çözünürlük gerçekleştirmek için büyük ekipman bir bolluk ile gerek yoktur.

Laboratuar için alanının getirerek, analiz zaman bir sensör tüm cep telefonu kullanarak Azaltılabilecek. Bilinen biyolojik mekanizmaları ve bitiş noktaları aşağıdaki aerosol kompozisyon ve boyut olarak belirlenmesi yardımcı olabilir. Mucociliary gümrükleme, fagositoz ve translocation, gibi yavaş Temizleme yöntemleri nedeniyle bu parçacıklar kez hücrelerle yaklaşık üreten oksidatif stres, inflamasyon ve hatta hücre ölümü hafta3 gün boyunca etkileşim vardır. Biyolojik bu bitiş noktası için olumsuz sonuç yolları kardiyovasküler hastalık veya kronik obstrüktif akciğer hastalığı için başlangıç noktaları olabilir. Ayrıca, Wiemenn ve ark. vitro deneyleri için kısa vadeli vivo içinde Soluma Toksisitesi edebiyat değerlerle karşılaştırmak için bir dizi sergiledi. 35 Vivo yanıt iki sitotoksisite laktat dehidrogenaz yayın, oksidatif stres glutatyon azaltma ve hidrojen peroksit oluşumu ve yayın ve enflamasyon üzerinden potansiyel üzerinden test dört olumlu sonuçlar ile tahmin edilmiştir tümör nekroz faktör Alfa gen. Test on mikro metal oksitleri dışında altı olarak test etkin (titanyum oksit, çinko oksit ve dört farklı Seryum oksit) Etkilenmeler içinde vitro onay vivo içindeile kullanma. 

İş ortamında aerosoller etkilerini incelemek amacıyla, PIVEC alanındaki pozlama için laboratuarımızın geliştirdi. Ayrıca, PIVEC izlemek ve 37 mm filtre kaset36 gibi inhalasyon pozlama araştırmak kişisel örnekleme için takılabilir veya birden çok sistemi belirli bir alanı içinde Uzaysal çözünürlük elde etmek için kullanılabilir. Bu protokol için karakterizasyonu ve PIVEC kullanımı ele alınmıştır. Maruz kaldıktan sonra sitotoksisite deneyleri biyolojik etkileri gözlenmektedir.

Protokol

Operatörleri kişisel koruyucu ekipman (önlük, eldiven, gözlük) giymek gerekir ne zaman 1, 2, 3, 5 ve 6 numaralı adımları gerçekleştirme.

1. malzeme hazırlanması

  1. Sistem birleştirme ve pozlama tekrarlanabilirlik sağlamak malzemeleri hazırlayın.
    1. Kullanım yeni veya % 70 etanol temizlenmiş ¼" iç çap iletken borular ve ¼" dış çap bağlayıcıların sistem birleştirme için emin olun.
    2. Mağaza test materyalleri iyi denetimli bir ortamda, sıcaklık ve nem oranı, en az 24 saat önce deneme için filtreler, PIVEC bileşenleri, cımbız ve parçacık tozlar gibi.
      Not: Sıcaklığı oda sıcaklığına, yaklaşık 20 ° C arasında bağıl nem % 35 daha az ile yakın olmalıdır. Bu deneyler arasında tekrarlanabilirlik ulaşmak çok önemlidir.
    3. Parçacık sayaçları parçaları temizlemek ve tarama hareketlilik parçacık sizer (SMPS) ve optik parçacık sizer (OPS) ölçüm için de dahil olmak üzere üretici öneriler göre sistem ısınma için izin vermek için isopropanol kullanarak hazırlayın.

2. nesil kuru Aerosol

Not: Operatörleri duman mahallede aerosol üretimi yapmak gerekir.

  1. Kuru aerosoller üretmek için bir sistem montajı
    Not: Gaz veya sıvı parçacıkların süspansiyon için model uygulama ve hücre kültürü uygun olmalıdır. Aşağıdaki yöntemi bir sıvı tabanlı aerosol kullanılarak gerçekleştirilebilir. Kuru sprey sistemi Tiwari ve arktasarımıdır. 37 kuru dağıtım sisteminin bir şematik Resim 1' de gösterilen.
    1. Küresel Vana 4" 1/8 boyut dişli boru her ucunu takın, bu parçacık hazne görev yapacak. 2" 1/8 boyut kanal bir kapak için bağlanmak.
    2. Bu çalışmada her parçacık boyutu için kitle konsantrasyon ifade verimliliği belirlenirken sabit tutuldu, bakır nano tanecikleri tartın. Yaklaşık 40 nm bakır nano tanecikleri 7.5 mg, 7 mg 100 nm bakır nano tanecikleri ve pozlama başına 800 nm bakır nano tanecikleri 13 mg kullanın. Bakır nano tanecikleri parçacık hopper açık sonuna yerleştirin.
      Not: bakır nano tanecikleri tartılır miktarı kitle yönetilen konsantrasyon dayalı olarak görev yapacak.
    3. 3" yer ½" etrafında bir HEPA filtre içinde bu kısa boru akış yönü ile küresel vana öyle ki yeri ve 2" Boru dış çapı (OD) boru parçası.
    4. Vakum jeneratörü diğer küresel vana iş parçacığı kullanarak bağlayın. Vakum jeneratörü bir 5/16" OD boru itme kilit bağlantı içine yerleştirerek Hava tankı için bağlayın. ¼" OD boru boru vakum jeneratörü çıkış yerleştirerek deneysel set-up vakum jeneratörü çıkış bağlanmak için kullanın.
  2. Kuru sprey üretmek için Kuru aerosol sistem kullanımı
    1. Ana Vana çevirerek Hava tankı açın ve sisteme hava akışını sağlar. Hava tankı üzerinde akış regülatör üzerinde Vana açın ve sistem aracılığıyla akış vakum pompası üzerinde istenen ayarları eşdeğerdir ayarlayın.
    2. Küresel Vana HEPA filtre için en yakın açık o zaman Küresel Vana için vakum jeneratörü yakın açın. Bunlar yaklaşık 3 açık tutmak s hava akımına çekilecek parçacıkları izin vermek için.
    3. Küresel Vana en yakın jeneratör vakum sonra Küresel Vana HEPA filtre için en yakın kapatın kapatın. Hava tankı gerektiği gibi deneme süresi için akışı sağlar.
    4. Hava tankı akışını durdurmak için ana ve regülatör vanaları kapatın. Temiz küresel vanalar ve vakum jeneratörü % 70 etanol kullanarak. Otoklav sterilizasyon için metal borular.

3. ifade verimlilik ölçüm PIVEC kullanarak

Not: Operatörler bir duman mahallede aerosol Etkilenmeler gerçekleştirmeniz gerekir.

  1. Yeminli ifade adım 2.2 önceden ağırlığını filtresinde generated bakır nanopartikül aerosol toplayarak ölçmek. Toplanan kitle filtreyi kullanarak ölçülen yatırılan doz ve ifade etkinliğini belirlemek için ağırlığını bakır parçacıkları, miktarda kullanarak ölçülen yönetilen doz kullanın.
    1. 1.00 µm gözenek cam elyaf filtreler 1.1.2, en az 24 saat önce öncesi poz ölçümleri için açıklanan düşük nem koşullarında tutun. Kullanılmayan bir filtre üç kez tartmak ve filtre ağırlıkları kaydedin. Yer bir hücre kültüründe kullanılmayan filtre ekleyin.
    2. Uygun hücre kültür Ekle bağdaştırıcısı (6 şey ya da 24 iyi) için hücre kültür Ekle filtresi ile desteklemek PIVEC seçin. Yer hücre kültürü Bankası üst bağdaştırıcı parçası PIVEC, öyle ki adaptör parça Bankası üst genişse yerine ayarlama ekleyin.
    3. Yüklenen filtre hücre kültürü yerleştirmek için kullanım cımbız adaptör parça içinde yerleştirin. Üst parça adaptör parça, öyle ki en iyi parça Bankası üst geniş yer yerleşme üzerine yerleştirin. PIVEC koli bandı tek bir katman ile sarın.
    4. 37 mm kaset parçaları üst ve altındaki PIVEC yerine iterek bağlayın. ¼" dikenli bağdaştırıcıları kaset giriş ve çıkış yerleştirin.
    5. Vasıl belgili tanımlık temel teller vardır öyle ki direnç ısıtıcı PIVEC etrafında sarın. Teyp güvenliğini sağlamak için.
    6. PIVEC ~ 8 mermi yalıtımı için alüminyum folyo ile sarın. Bant ile güvenli.
    7. 2" bağlamak uzun parça 1/2" dış çap esnek boru adaptörüne PIVEC üstüne. Steril su ve boru PIVEC üstüne içinde yer gözenekli boru kaldırın.
    8. Kelepçe yüzük stand ve güvenli içinde yer PIVEC. Vakum pompası, parçacık Banko ve aerosol kurulum ile tam set-up.
      Not: yalnızca parçacık sayaçları PIVEC önce ve PIVEC ayrı çalışır sonra eklenir eğer sayı tabanlı yatırılan doz belirlenebilir.
    9. Adım 2.2 Protokolü ve istenen pozlama zaman ve akış oranları, bir çekim hızı 0.5 LPM, 10 dk kullanılan bu çalışmada kullanarak filtreleri kullanır. PIVEC kurulum kaldırın. Hücre kültür Ekle alıp maruz kalan filtre filtre tutucu en az 24 saat önce ölçümleri için düşük nem koşullarında yerleştirin.
    10. PIVEC % 70 etanol ile temizleyin. En az 30 dk önce sonraki deneme için ultraviyole ışık ile sterilize.
    11. Üç kez maruz kalan filtre tartmak ve filtre ağırlıkları kaydedin. Depolama için bir etiketli filtre tutucu filtre maruz kalan bir yer.

4. yatırılan doz ve ifade verimlilik hesaplanması

Not: Bilgi yükünün aerosol yönetim ve hücresel yanıt yorumlanması için önemlidir.

  1. Biriktirme gelen kitle tabanlı ölçümleri hesaplamak
    1. Öncesi pozlama ortalama ağırlığı ve sonrası pozlama ortalama ağırlığı arasındaki fark olarak filtreler yatırılan kitle hesaplamak. Bu deney için yığın tabanlı yatırılan doz değerdir.
    2. Kullanım kitle, madmin, idare ve kitle tabanlı 4.1.1, mdep, kitle tabanlı ifade verimlilik, ηm, deney için hesaplamak için belirlenen doz yatırılır.
      figure-protocol-6853
    3. 4.1.1 ve 4.1.2 ifade belirlemek en az 3 deneyler için ve PIVEC için ifade verimlilik partikül büyüklüğü için ortalama değerleri.
  2. İfade üzerinden sayı tabanlı ölçümleri hesaplamak
    1. Ölçümleri parçacık sayaçları ile PIVEC sonra ve PIVEC önce parçacık konsantrasyonu belirlemek için sayaçları ile gerçekleştirilmiş emin olun. Parçacık konsantrasyonu zamanla parçacık sayaç için entegre daha sonra toplam belirlemek için parçacık çapı üzerinde entegre ölçülen parçacıklar.
    2. Yatırılan parçacık sayısı yönetilen parçacıklar ve ölçülen parçacıklar post-PIVEC arasındaki fark olarak hesaplar. Bu deney için sayı tabanlı yatırılan doz değerdir.
    3. Yönetilen kullanım parçacıklar, nadmin, sayı tabanlı sayı tabanlı ifade verimlilik, ηn, deney için hesaplamak için doz, ndep, hacimsel Debi, V ve zamanı, t, yatırılır.
      figure-protocol-7839
    4. 4.2.2 ve 4.2.3 ifade belirlemek en az 3 deneyler için ve PIVEC için ifade verimlilik partikül büyüklüğü için ortalama değerleri.

5. aerosol pozlama hücre

Not: hücre için boş ve arkkültür vasıl hava-sıvı arayüzey okuyucu denir. 38 operatörleri hücre kültür Ekle (adımları 5.1.2-5.1.4) bir biyogüvenlik kabini içinde yükleme gerçekleştirmeniz gerekir. İşleçler aerosol Etkilenmeler duman mahallede gerçekleştirmeniz gerekir.

  1. Kültür hücreleri vasıl hava-sıvı arayüzey
    1. A549 hücreler kültür şişesi tripsin-EDTA, 3 mL T75 şişesi için veya bir T25 şişesi için 1 mL ekleyerek Asansör ve 37 ° C'de 5 min için kuluçkaya Tam medya için bir T75 şişesi veya komple bir medya 4 mL 7 mL bir T25 şişesi şişesi ve durulama şişesi duvar hücre süspansiyon ile kurtarılan cep numarası en üst düzeye çıkarmak ekleyin. Steril 15 mL konik tüp sonra 800 x g 3 dk santrifüj hücreleri hücre süspansiyon aktarın.
    2. Süpernatant içeren tripsin-EDTA kaldırmak ve hücre Pelet komple medya 10 mL resuspend. Hücre süspansiyon 10 µL kaldırın ve hemasitometre için ekleyin. Konsantrasyonu ve hücreler toplam sayısını belirlemek için bir hemasitometre kullanarak hücreleri saymak.
    3. Her şey bir 24 iyi tabak içinde için 0.5 mL tam medya yerleştirin. Kullanılmayan hücre kültür ekler wells yerleştirin. 1 x 105 hücreleri/cm2 günlük iki katına yakın bir hızda büyümek hücre tipleri için yakındaki bir hücre yoğunluğu apikal tarafında tohum hücre kültürü ekler. Tohum A549 de bir 24 içinde hücre eklemek için bir yoğunluk 35.000 hücreleri hücre kültürü ekleyerek 1 x 105 hücreleri/cm2 tohum hücreleri ekleyin.
      Not: Hücreleri daha yavaş bir büyüme oranı ile bir artan hücre yoğunluğuna numaralı seribaşı.
    4. Tam ortam (için 24 iyi plaka son hacim 0.25 mL) son hacim ulaşmak için hücre kültür Ekle apikal tarafına ekleyin.
    5. Kültür medya her 1-2 gün yerine batık koşullarında 7 gün için. 7 gün sonra en az 1 günde sadece demiri medya yerine ALI koşullarında apikal medya ve kültür kaldırın.
  2. PIVEC bir araya
    1. Hücreleri en az 24 saat önce pozlama için belgili tanımlık hava-sıvı arayüzey için equilibrate izin verir.
    2. Hücre kültür Ekle filtresi ile desteklemek PIVEC için uygun hücre kültür Ekle bağdaştırıcısı seçin. Yer hücre kültürü adaptör parça PIVEC temel, öyle ki adaptör parça Bankası üst genişse yerine ayarlama üstüne yerleştirin. Hücre kültür ortamının 4 mL PIVEC temeli de ekleyin.
    3. 5.2.3. adımda yerleştirilen adaptör parça içinde hücre kültürü yerleştirmek için kullanım cımbız yerleştirin. Üst parça adaptör parça, öyle ki en iyi parça Bankası üst geniş yer yerleşme üzerine yerleştirin. Dikkatli, PIVEC koli bandı tek bir katman ile sarın.
    4. 37 mm kaset parçaları üst ve altındaki PIVEC, yerine iterek bağlayın. ¼" dikenli bağdaştırıcıları kaset giriş ve çıkış yerleştirin.
    5. Vasıl belgili tanımlık temel teller vardır öyle ki direnç ısıtıcı PIVEC etrafında sarın. Teyp güvenliğini sağlamak için.
    6. PIVEC ~ 8 mermi yalıtımı için alüminyum folyo ile sarın. Bant ile güvenli.
    7. 1/2" dış çap esnek boru kısa bir parçası üst PIVEC adaptör takın. Steril su ve boru PIVEC üstüne içinde yer gözenekli boru kaldırın.
    8. Kelepçe yüzük stand ve güvenli içinde yer PIVEC. Vakum pompası ve aerosol kurulum kurulumu tamamlayın.
  3. ALI PIVEC kullanarak, hücreleri göstermek
    1. 2. adımda belirlenen ifade verimliliği aerosolize için parçacıkların kütle hesaplamak için kullanın. Uygun kitle tartmak ve adım 2 duman başlık içinde takip ayarla aerosol sistemine ekleyin.
    2. Adım 2.2 takip ederek açığa hücreleri, bu çalışmada biyolojik bitiş noktaları, hücreleri yaklaşık 3.5 mg bakır nano tanecikleri 0.5 LPM bir Debi ile sinin ve 10 dk. denetim çalışmaları gerçekleştirilen bir pozlama süresi oksijen hava belirlemek için kullanılan Yalnız hava etkisi. PIVEC kurulum kaldırın. Hücre kültür Ekle almak, steril iyi tabağına yerleştirin ve CO2 kuluçka (37 ° C, % 5 CO2, %90 RH) döndürür.
    3. PIVEC medyadan Aspire edin. Ek deneyler yapmak, durulama alt PIVEC fosfat ile çözüm sonra adımı yineleyin 5.1 ve 5.2 arabelleğe alınmış.
    4. Ne zaman tamamlanmak % 70 etanol ile temiz PIVEC. En az 30 dk önce sonraki deneme için ultraviyole ışık ile sterilize.
  4. Biyolojik tahlil yordamları
    Not: Bu çalışmada gerçekleştirilen deneyleri oksidatif stres üretimi ile DCFH-DA tahlil ve sitotoksisite laktat dehidrogenaz (karaciğer) yayın aracılığıyla...
    1. DCFH-DA 24.4 mg 50 mL metanol 1 mM DCFH-DA çözüm yapmak içinde çözülür. Bu çözüm-20 ° C'de 4 aya kadar saklanabilir. 1 mM DCFH-DA çözüm 1 mM DCFH-DA çözüm 0.1 mL 9.9 mL 10 mL 10 µM yapmak HBSS ile karıştırılarak seyreltik DCFH-da
    2. Hücre kültür medya yıkama hücre kültür yerleştirin ve yaklaşık 1 mL PBS ile kaldırın. Ne zaman tamamlanmak ekler yerine her şey için 0.5 mL 10 µM DCFH-DA çözeltisi ekleyin. Plaka boya photoactivation önlemek ve 37 ° C kuluçka 1 h için dönmek için alüminyum folyo ile kapak.
    3. Kuluçka makinesi hücre kaldırma ve DCFH-DA çalışma çözüm kuyulardan Aspire edin. 0.5 mL HBSS wells için ekleyin ve hücre kültür ekler değiştirin.
    4. İyi plaka uyarma/emisyon dalga boylarında 485/530 kullanarak plaka okuyucu ve ölçü temel Floresans yük nm. Plaka gelen plaka okuyucu ve yük Ekle PIVEC pozlama için kaldırın.
    5. Hücreleri istediğiniz pozlama süresi için göstermek. Ekle PIVEC kaldır ve iyi plakasına dönün. Demiri sıvı 50 µL iyi plaka ve beyaz 96 iyi plaka yerde kaldırın. Uyarma/emisyon dalga boylarında 485/530 kullanarak DCF Floresans ölçmek nm her 30 dk sonrası maruz kalanlar için 2 h.
    6. Oda sıcaklığı 20-30 dk. ekle 50 µL karaciğer tahlil çözüm, karışık aşağıdaki üreticisi protokolü için equilibrate, demiri sıvı iyi plaka ve izin için 10 dk. 25 eklemek µL iyi için durmak eriyik, tepki demiri sıvı ver. Floresan resorufin ürünün uyarma/emisyon dalga boylarında, 560/590 kullanarak okuma nm.
    7. Ek demiri sıvı kaldırmak ve 5.4.6 4 h ve 24 h sonrası pozlama adımları yineleyin.

6 istatistiksel yöntemler

  1. Biyolojik tahlil veri analizi
    1. Rapor ROS floresan yoğunluğu artış olarak tedavi hücrelerinin üretimini temel ölçü birimlerinin göreli. Tedavi edilmemiş hücreleri göre işlem görmüş hücreleri floresan yoğunluğu artış olarak karaciğer faaliyet raporu.
    2. Tek Etmenli ANOVA istatistiksel veri kümeleri arasındaki farkları belirlemek için gerçekleştirin. Uygun olduğunda, Öğrenci t-testleri 0,05 önem bir değerde gerçekleştirin. Ortalama ± standart sapma en az üç pozlama ölçüm verilerini raporlar.

Sonuçlar

Mesleki vitro toksikoloji aerosol çekim yaparken hücresel canlılığı bakımı içerir. PIVEC sistem sıcaklık ve nem kontrolü ve yıpranmış PIVEC de dahil olmak üzere Şekil 2' de gösterilmiştir. Sıcaklık pilli direnç ısıtıcı kullanarak devam edildi ve gözenekli, ıslak tüpünden doğal nemlendirme kullanarak nemlendirilmelidir aerosol arttı. Bir laboratuvar içinde ayarlama bir kontrollü aerosol şekil 1

Tartışmalar

Filtre kaset aerosoller nefes bölgedeki toplama, basit, ucuz bir yöntem sağlar; Ancak, aerosol örnekleri filtrelerinden çıkarılan tüm aerosol (yani gazlar, tenler ve parçacıklar) temsil yapmak ve sonuç olarak ilgili biyolojik etkileri değerlendirilmesi sınırlamak. 37 mm filtre kaset ilk tasarım kullanarak, PIVEC taşınabilirliği korumak ve inhalasyon parçacıkları in vivo birikimi taklit etmek için tasarlanmıştır. PIVEC mevcut ALI pozlama sistemleri, yaklaşık olarak bir doku kutusu dahil...

Açıklamalar

Yazarlar eğilimleri kapak sayfasında gösterildiği gibidir. Yazarlar mali Virginia Commonwealth Üniversitesi, nerede çalışma Richmond, VA tamamlandı tarafından desteklenen Yazarlar bu kağıt içeriğini ve yazma için tek sorumluluğu vardır. Yazarlar hiçbir rakip çıkarları vardır bildirin.

Teşekkürler

Yazarlar Boris Solomonov ve Virginia Commonwealth yenilik makinenin olduğu dükkanın hızlı prototipleme cihazı ile yardım için teşekkür etmek istiyorum. Yazarlar ayrıca Cristian Romero-Fuentes Lewinski grubunun, Dr Vitaliy Avrutin, Dr. Dmitry Pestov ve Virginia Commonwealth Nanomalzemeler çekirdek karakterizasyonu tesis onların yardım için parçacık karakterizasyonu teşekkür etmek istiyorum. Bu eser Dr Lewinski Virginia Commonwealth Üniversitesi'nde Mühendislik Fakültesi tarafından sağlanan başlangıç fonlar tarafından desteklenmiştir.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Scanning mobility particle sizer (SMPS)TSI, Inc.3910NanoSMPS
Optical particle sizer (OPS)TSI, Inc.3330
Stainless Steel Pipe, 4" LongMcMaster-Carr4830K116Standard-Wall 304/304L, Threaded on Both Ends, 1/8 Pipe Size
Brass Ball Valve with Lever HandleMcMaster-Carr4112T12Compact High-Pressure Rating, 1/8 NPT Female
Steel Pipe, 2" LongMcMaster-Carr7753K121Standard Wall, Threaded on One End, 1/8 Pipe Size
HEPA filterGE Healthcare09-744-12HEPA-Cap Disposable Air Filtration Capsule
Vacuum GeneratorPISCO USAVCH10-018C
PIVECVCUFor design please contact authors
Resistive heater
1/4" barbed connectorsZefon International, Inc.459743
Porous tubingScientific Commodities, Inc.BB2062-1814AHydrophilic 10 um pores
Battery power bank
Cell culture insertFisherbrand35309524 well plate insert
Filter ForcepsFisherbrand09-753-50
Transfer PipetteThermoScientific13-711-27
Glass Fiber FiltersSKC225-7Binder-Free Type AE Filter 37 MM 1.00 um pore
Ultra Micro BalanceA&DBM-22Housed in environmental chamber
37 mm filter cassetteSKC225-3250Filter Cassette Blank, 37 mm, Clear Styrene
Variable flow vacuum pumpSKC220-5000TCAirChek TOUCH, 5 to 5000 mL/min
Copper ParticlesU.S. Research Materials, Inc.US109040 nm
Copper ParticlesU.S. Research Materials, Inc.US1088100 nm
Copper ParticlesU.S. Research Materials, Inc.US1117M800 nm

Referanslar

  1. Lewinski, N. A., Secondo, L. E., Ferri, J. K. Enabling Real-Time Hazard Assessment at the Workplace Enabling Real-Time Hazard Assessment at the Workplace. 14th Global Congress on Process Safety. , 1-9 (2018).
  2. Bakand, S., Winder, C., Khalil, C., Hayes, A. Toxicity assessment of industrial chemicals and airborne contaminants: transition from in vivo to in vitro test methods: a review. Inhalation Toxicology. 17, 775-787 (2005).
  3. Bakand, S., Hayes, A. Troubleshooting methods for toxicity testing of airborne chemicals in vitro. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 61 (2), 76-85 (2010).
  4. Lenz, A. G., et al. A dose-controlled system for air-liquid interface cell exposure and application to zinc oxide nanoparticles. Particle and Fibre Toxicology. 6, 32 (2009).
  5. de Bruijne, K., et al. Design and testing of Electrostatic Aerosol in Vitro Exposure System (EAVES): an alternative exposure system for particles. Inhalation Toxicology. 21, 91-101 (2009).
  6. Asimakopoulou, A., Daskalos, E., Lewinski, N., Riediker, M., Papaioannou, E., Konstandopoulos, A. G. Development of a dose-controlled multiculture cell exposure chamber for efficient delivery of airborne and engineered nanoparticles. Journal of Physics: Conference. 429, 1-10 (2013).
  7. Grigg, J., et al. DNA damage of macrophages at an air-tissue interface induced by metal nanoparticles Macrophage. Nanotoxicology. 3 (4), 348-354 (2009).
  8. Aufderheide, M., Knebel, J. W., Ritter, D. An improved in vitro model for testing the pulmonary toxicity of complex mixtures such as cigarette smoke. Experimental and Toxicologic Pathology. 55, 51-57 (2003).
  9. Aufderheide, M., Halter, B., Möhle, N., Hochrainer, D. The CULTEX RFS: A comprehensive technical approach for the in vitro exposure of airway epithelial cells to the particulate matter at the air-liquid interface. BioMed Research International. 2013 (1), 1-15 (2013).
  10. Tippe, A., Heinzmann, U., Roth, C. Deposition of fine and ultrafine aerosol particles during exposure at the air/cell interface. Journal of Aerosol Science. 33, 207-218 (2002).
  11. Savi, M., et al. A novel exposure system for the efficient and controlled deposition of aerosol particles onto cell cultures. Environmental Science and Technology. 42, 5667-5674 (2008).
  12. Fröhlich, E., et al. Comparison of two in vitro systems to assess cellular effects of nanoparticles-containing aerosols. Toxicology in Vitro. 27, 409-417 (2013).
  13. Frijns, E., et al. A Novel Exposure System Termed NAVETTA for in Vitro Laminar Flow Electrodeposition of Nanoaerosol and Evaluation of Immune Effects in Human Lung Reporter Cells. Environmental Science and Technology. 51 (9), 5259-5269 (2017).
  14. Vincent, J. H. . Aerosol Science for Industrial Hygienists. , (1995).
  15. Fujitani, Y., Sugaya, Y., Hashiguchi, M., Furuyama, A., Hirano, S., Takami, A. Particle deposition efficiency at air-liquid interface of a cell exposure chamber. Journal of Aerosol Science. 81, 90-99 (2015).
  16. Elihn, K., Cronholm, P., Karlsson, H. L., Midander, K., Odnevall Wallinder, I., Möller, L. Cellular Dose of Partly Soluble Cu Particle Aerosols at the Air-Liquid Interface Using an. In Vitro Lung Cell Exposure System. Journal of Aerosol Medicine and Pulmonary Drug Delivery. 26 (2), 84-93 (2013).
  17. . . Aerosols Handbook Measurement, Dosimetry, and Health Effects. , (2005).
  18. de Souza Carvalho, C., Daum, N., Lehr, C. M. Carrier interactions with the biological barriers of the lung: Advanced in vitro models and challenges for pulmonary drug delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 75, 129-140 (2014).
  19. Fattal, E., Grabowski, N., Mura, S., Vergnaud, J., Tsapis, N., Hillaireau, H. Lung Toxicity of Biodegradable Nanoparticles. Journal of Biomedical Nanotechnology. 10 (10), 2852-2864 (2014).
  20. Klein, S. G., Serchi, T., Hoffmann, L., Blömeke, B., Gutleb, A. C. An improved 3D tetraculture system mimicking the cellular organisation at the alveolar barrier to study the potential toxic effects of particles on the lung. Particle and Fibre Toxicology. 10, 31 (2013).
  21. Oberdörster, G., et al. Principles for characterizing the potential human health effects from exposure to nanomaterials: elements of a screening strategy. Particle and Fibre Toxicology. 2, 8 (2005).
  22. Secondo, L. E., Liu, N. J., Lewinski, N. A. Methodological considerations when conducting in vitro, air-liquid interface exposures to engineered nanoparticle aerosols. Critical Reviews in Toxicology. , 1-32 (2016).
  23. Sayes, C. M., Reed, K. L., Warheit, D. B. Assessing toxicology of fine and nanoparticles: Comparing in vitro measurements to in vivo pulmonary toxicity profiles. Toxicological Sciences. 97 (1), 163-180 (2007).
  24. Maier, K. L., et al. Health effects of ambient particulate matter--biological mechanisms and inflammatory responses to in vitro and in vivo particle exposures. Inhalation Toxicology. 20 (May 2007), 319-337 (2008).
  25. Cohen, J. M., Teeguarden, J. G., Demokritou, P. An integrated approach for the in vitro dosimetry of engineered nanomaterials. Particle and Fibre Toxicology. 11 (1), 20 (2014).
  26. Deloid, G., et al. Estimating the effective density of engineered nanomaterials for in vitro dosimetry. Nature Communications. 5, 3514 (2014).
  27. Pal, A. K., Bello, D., Cohen, J., Demokritou, P. Implications of in vitro dosimetry on toxicological ranking of low aspect ratio engineered nanomaterials. Nanotoxicology. , 1-15 (2015).
  28. Walkey, C., et al. Protein corona fingerprinting predicts the cellular interaction of gold and silver nanoparticles. ACS Nano. 8 (3), 2439-2455 (2014).
  29. Raemy, D. O., et al. Effects of flame made zinc oxide particles in human lung cells - a comparison of aerosol and suspension exposures. Particle and Fibre Toxicology. 9 (1), 33 (2012).
  30. Holder, A. L., Lucas, D., Goth-goldstein, R., Koshland, C. P. Cellular response to diesel exhaust particles strongly depends on the exposure method. Toxicological Sciences. 103 (1), 108-115 (2008).
  31. Sanderson, P., et al. Characterisation of iron-rich atmospheric submicrometre particles in the roadside environment. Atmospheric Environment. 140. , 167-175 (2016).
  32. Burtscher, H. Physical characterization of particulate emissions from diesel engines: A review. Journal of Aerosol Science. 36 (7), 896-932 (2005).
  33. Ris, C. U.S. EPA health assessment for diesel engine exhaust: a review. Inhalation Toxicology. 19 (Suppl. 1), 229-239 (2007).
  34. Jie, Y., Isa, Z. M., Jie, X., Ju, Z. L., Ismail, N. H. Urban vs. Rural Factors That Affect Adult Asthma. Reviews of Environmental Contamination and Toxicology. 226, (2013).
  35. Wiemann, M., Vennemann, A., Sauer, U. G., Wiench, K., Ma-Hock, L., Landsiedel, R. An in vitro alveolar macrophage assay for predicting the short-term inhalation toxicity of nanomaterials. Journal of Nanobiotechnology. 14 (1), 16 (2016).
  36. Kenny, L. C., et al. A collaborative european study of personal inhalable aerosol sampler performance. Annals of Occupational Hygiene. 41 (2), 135-153 (1997).
  37. Tiwari, A. J., Fields, C. G., Marr, L. C. A Cost-Effective Method of Aerosolizing Dry Powdered Nanoparticles. Aerosol Science and Technology. 47 (11), 1267-1275 (2013).
  38. Blank, F., Rothen-Rutishauser, B. M., Schurch, S., Gehr, P. An Optimized In Vitro Model of the Respiratory Tract Wall to Study Particle Cell Interactions. Journal of Aerosol Medicine. 19 (3), 392-405 (2006).
  39. Laboratory, N. C. . NCL Method GTA-2 HEP G2 Hepatocarcinoma Cytotoxicity Assay. (November), 1-9 (2015).
  40. Kim, J. S., Peters, T. M., O'Shaughnessy, P. T., Adamcakova-Dodd, A., Thorne, P. S. Validation of an in vitro exposure system for toxicity assessment of air-delivered nanomaterials. Toxicology in Vitro. 27 (1), 164-173 (2013).
  41. Mertes, P., et al. A compact and portable deposition chamber to study nanoparticles in air-exposed tissue. Journal of aerosol medicine and pulmonary drug delivery. 26, 228-235 (2013).
  42. Panas, A., et al. Silica nanoparticles are less toxic to human lung cells when deposited at the air-liquid interface compared to conventional submerged exposure. Beilstein Journal of Nanotechnology. 5, 1590-1602 (2014).
  43. Zavala, J., et al. Regulating temperature and relative humidity in air-liquid interface in vitro systems eliminates cytotoxicity resulting from control air exposures. Toxicology Research. 6, 448-459 (2017).
  44. Jing, X., Park, J. H., Peters, T. M., Thorne, P. S. Toxicity of copper oxide nanoparticles in lung epithelial cells exposed at the air - liquid interface compared with in vivo assessment. TOXICOLOGY IN VITRO. 29 (3), 502-511 (2015).
  45. Bitterle, E., et al. Dose-controlled exposure of A549 epithelial cells at the air-liquid interface to airborne ultrafine carbonaceous particles. Chemosphere. 65, 1784-1790 (2006).
  46. Steinritz, D., et al. Use of the Cultex Radial Flow System as an in vitro exposure method to assess acute pulmonary toxicity of fine dusts and nanoparticles with special focus on the intra- and inter-laboratory reproducibility. Chemico-Biological Interactions. 206 (3), 479-490 (2013).
  47. Cronholm, P., et al. Intracellular uptake and toxicity of Ag and CuO nanoparticles: A comparison between nanoparticles and their corresponding metal ions. Small. 9 (7), 970-982 (2013).
  48. Cronholm, P., Midander, K., Karlsson, H. L., Elihn, K., Wallinder, I. O., Möller, L. Effect of sonication and serum proteins on copper release from copper nanoparticles and the toxicity towards lung epithelial cells. Nanotoxicology. 5 (2), 269-281 (2011).
  49. Midander, K., et al. Surface characteristics, copper release, and toxicity of nano- and micrometer-sized copper and copper(ll) oxide particles: A cross-disciplinary study. Small. 5 (3), 389-399 (2009).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

evre Bilimlerisay 144pozlama sistemiinhalasyonnanopartik ltoksikolojiifade verimlilikki isel g zlem

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır