Un nuevo portátil In Vitro exposición Cassette para el muestreo de aerosoles

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para realizar exposiciones de aerosol celular portable y medir la respuesta celular. El método utiliza las células, cultivadas en la interfase aire-líquido, imitando en vivo fisiología. Respuesta celular a aerosoles de nanopartículas de cobre se observó como el estrés oxidativo a través de la generación de especies reactivas de oxígeno y la citotoxicidad como liberación de lactato deshidrogenasa.

Resumen

Este Protocolo introduce un nuevo en vitro exposición sistema, capaz de ser usado, incluyendo su caracterización y funcionamiento. Sistemas de interfaz de aire líquido (ALI) en vitro exposición suelen ser grandes y voluminosos, dificultando el transporte al campo y la operación en la fuente de emisión o dentro de la zona de respiración. A través de la miniaturización de estos sistemas, el laboratorio puede ser traído al campo, acelerar el tiempo de procesamiento y proporciona un método de exposición más apropiado que no altere el aerosol antes de ponerse en contacto con las células. El Portable In vitro exposición Cassette (PIVEC) adapta un casete de filtro de 37 mm para permitir en vitro toxicidad pruebas fuera de un entorno de laboratorio tradicional. El PIVEC fue caracterizado mediante tres tamaños de nanopartículas de cobre para determinar eficacia de deposición basada en gravimétrico y análisis número de concentración de partículas. Se realizaron experimentos de citotoxicidad inicial con células pulmonares expuestas para determinar la capacidad del sistema para depositar las partículas mientras que mantiene la viabilidad celular. El PIVEC proporciona una eficiencia de deposición similar o mayor al comparar a los dispositivos de flujo perpendicular disponible en vitro exposición. A pesar de la baja demanda, el tamaño pequeño le da algunas ventajas a la actual en vitro ALI sistemas de exposición. Estos incluyen la capacidad de ser usado para control de personal, movilidad del laboratorio a la fuente de emisión y la opción de configuración múltiples sistemas de resolución espacial manteniendo un usuario más bajo costo. El PIVEC es un sistema capaz de recoger los aerosoles en el campo y dentro de la zona de respiración en una interfaz de aire, en vitro modelo.

Introducción

Muestreo personal de vitro técnicas podría proporcionar información completa sobre los efectos biológicos de los aerosoles en el lugar de trabajo. ¹ exposición a contaminantes en el aire incluye exposición a producto químico sí mismo, a las muestras de aire recogidas en condiciones sumergidas, donde el gas se introduce a la suspensión de células, exposición intermitente utilizando un dispositivo como un balancín, o en la exposiciones en la interfase aire-líquido (ALI). ² muchas de estas técnicas se realizan con células cultivadas en suspensión o en la recogida de muestras antes de la exposición, cada una de ellas puede afectar el estudio toxicológico debido a posibles cambios en el aerosol. ³ para evitar estos cambios, el laboratorio puede ser traído al campo, utilizando varios en vitro ALI exposición los sistemas de cultivo que se utilizan en la literatura,^{4,5,6,7, 8,9,10,11,12,13} sin embargo, pocos están comercialmente disponibles. ^{8 , 9 , 12} estos sistemas suelen ser voluminosos, especialmente cuando se incluye instrumentos para regular la temperatura y la humedad del ambiente celular y el flujo del aerosol de la muestra. Usando el PIVEC, exposiciones de aerosol pueden realizarse fuera de un entorno de laboratorio tradicional o dentro de la zona de respiración mientras que mímico las condiciones de la inhalación.

La determinación de la deposición de aerosoles en vitro es importante a la investigación de efectos sobre la salud debido a la inhalación. La zona de respiración, el área dentro de los 30 cm de la boca y la nariz,¹⁴ es crucial para la comprensión de la exposición a las nanopartículas y para vincular a los efectos biológicos en los pulmones. ² a menudo, la deposición en las células se define como una eficiencia de deposición, las partículas deposita en y tomado por las células que se dividen las partículas administrada al sistema^6,15 o en una base total de la misma cantidad. ^{4 , 16} los métodos actuales para la medición de aerosoles en la zona de respiración son filtro base, capturando las partículas durante un período de muestreo dado y con los filtros para llevar a cabo más pruebas. ¹⁷ monitoreo personal requiere un pequeño sistema que viene con el compromiso de pocas muestras.

Hay muchos métodos para determinar los efectos de la exposición a un aerosol. El modelo ALI permite el aerosol ser administrado directamente a las células a través del aire como en un escenario de exposición real, sin embargo, es más rentable y menos tiempo intensivo que en vivo los estudios mientras que mímico las barreras de aire líquido como los ojos, piel y pulmones. Las células del pulmón en el ALI tienen la capacidad para generar una capa de polarizado,^18,19 que produce características fisiológicas que se parecen al en vivo pulmón epitelio, incluyendo la producción de moco y surfactante en específico líneas de célula bronquial o alveolar, cilia bate,¹⁹ ensambladuras apretadas,^19,20 y cell polarización. ¹⁸ cambios como estos pueden afectar la respuesta celular en los estudios de toxicidad. ²¹ además, ALI en vitro modelo resultados son a menudo más sensibles que las células expuestas mediante suspensión modelos²² y capaz modelo aguda en vivo inhalación Toxicidad. ^{23 , 24} por tanto, un sistema de exposición de ALI que es capaz de realizar mediciones dentro de la zona de respiración es un siguiente paso natural.

Al exponer las células a aerosol directamente a la fuente de emisión, se produce la investigación de los efectos de todos los gases, compuestos semi volátiles y partículas en la mezcla. Cuando la mezcla se recoge en un filtro, no se capturan los gases y compuestos volátiles y la mezcla entera no puede ser investigada. Además, la reconstitución de partículas en un polvo o una suspensión líquida puede conducir a la agregación o interacciones partícula-líquido, como la disolución, en suspensión líquida. ^{25 , 26} cuando se agregan partículas de aerosol al líquido, hay un mayor potencial para la formación de^{27 25,}de corona de proteína,²⁸ o interacción con los compuestos en el líquido, que puede afectar a la deposición, aglomeración y influir en la respuesta biológica. ^{29 , 30}

Exposición en la ALI se basa en tres perfiles principales aerosol nube dirimentes, paralelo de flujo y flujo perpendicular. Nube de adaptación, utilizado por el aire líquido interfaz celular exposición (ALICE),⁴ es un sistema por lotes donde depositan las partículas gravitacionales y difusionales colocar como el aerosol es tratado como una unidad. Flujo paralelo, utilizado por el Aerosol electrostático en vitro exposición sistema (aleros)⁵ y Multicultura exposición cámara (MEC) II,⁶ permite la deposición mediante la adición de movimiento browniano a través del perfil de flujo. Flujo perpendicular, usado por un microsprayer,⁷ Nano cámara de Aerosol para la toxicidad In Vitro (NACIVT),¹¹ y comercial ALI sistemas^8,9,10,12, añade la impactación de partículas dentro de la región de deposición. Muchos de estos sistemas de exposición son grandes y voluminosos, que requieren sistemas de exceso para aerosol previamente acondicionado, bombas de flujo, o incluso la calefacción cámaras de incubación de las células. Este gran tamaño disminuye la portabilidad del sistema. En lugar de muestreo directamente a la fuente de emisión, estos sistemas tienen a menudo las muestras que el laboratorio o modelo aerosoles generados para el análisis. La complejidad de los aerosoles emitidos se puede perder en la traducción del campo al laboratorio. El PIVEC es más pequeño que los sistemas actuales, con una superficie externa de aproximadamente 460 cm² y pesa sólo 60 gramos, con control de humedad y térmico incorporado en el sistema que permite a un dispositivo portátil. La disminución del tamaño y peso permiten que el sistema de ser usado o tomado a la fuente de exposición, permitiendo el muestreo directo.

El gran tamaño de los actuales sistemas de exposición también disminuye la capacidad para realizar el muestreo para investigar gradientes espaciales en las concentraciones. Esta resolución es clave para determinar los efectos toxicológicos de potencial ambiental y riesgos laborales como escape vehicular partículas materia o lugar de trabajo actividades donde se produce la aerosolización. Inmediatamente la emisión, allí se convierte en una variación espacial en la concentración de partículas. Esto crece con el tiempo las partículas se dispersan en la atmósfera y estos efectos pueden cambiar en base a las condiciones ambientales, como temperatura, presión, viento y sol. Las partículas pueden comenzar a la edad, así como una vez emitidos^31,32 se oxida y las tasas de dispersión están afectadas por la topografía; concentraciones más altas se encuentran en cañones y túneles, donde efectos de dispersión se ralentizó, y concentraciones más bajas pueden encontrarse donde hay una gran área de dispersión. ³³ estos cambios en las tasas de dispersión pueden tener efectos significativos sobre la salud humana y pueden verse al comparar el número de adultos asmáticos viven en urbanos y en entornos rurales. ³⁴ mientras que los sistemas de exposición muchos proporcionan múltiples muestras a la vez, múltiples sistemas son necesarios con una abundancia de grandes equipos para realizar la resolución espacial.

Al llevar el laboratorio al campo, el momento del análisis puede reducirse mediante el uso de la célula entera como un sensor. Siguiendo criterios de valoración y los mecanismos biológicos conocidos puede ayudar en la determinación de la composición del aerosol y el tamaño. Debido a los métodos de remoción lenta, incluyendo depuración mucociliar, fagocitosis y desplazamiento, estas partículas son a menudo interactuando con las células para unos días a la semanas³ generadoras de estrés oxidativo, inflamación y hasta la muerte celular. Estos criterios de valoración biológicos pueden ser los puntos de partida para rutas de resultados adversos para la enfermedad cardiovascular o enfermedad pulmonar obstructiva crónica. Además, Wiemenn et al realizó una serie de ensayos en vitro para comparar con los valores de la literatura para a corto plazo en vivo inhalación Toxicidad. ³⁵ Respuesta in vivo fue predicho con dos de los cuatro resultados positivos de ensayos de citotoxicidad por liberación de lactato deshidrogenasa, el estrés oxidativo de glutatión reducción y peróxido de hidrógeno formación y liberación y potencial de la inflamación el gene alfa del factor de necrosis tumoral. De combinar diez óxidos metálicos probados, seis prueban como activo (óxido de titanio, óxido de zinc y óxido de cerio diferentes cuatro) mediante exposiciones in vitro con confirmación en vivo. 

Para estudiar los efectos de los aerosoles en un ámbito laboral, nuestro laboratorio desarrollado PIVEC para exposiciones en el campo. Además, el PIVEC puede usarse para que muestreo personal para vigilar e investigar la exposición por inhalación como el filtro de 37 mm cassette³⁶ o sistemas múltiples pueden utilizarse para lograr la resolución espacial dentro de un área determinada. En este protocolo, se discute la caracterización y el uso de la PIVEC. Después de la exposición, los efectos biológicos se observan a través de ensayos de citotoxicidad.

Protocolo

Los operadores deben usar equipo de protección personal (bata, guantes, gafas) cuando realice los pasos 1, 2, 3, 5 y 6.

1. preparación de materiales

1. Preparar materiales para sistema de montaje y exposición para asegurar repetibilidad.
   1. Asegúrese de que uso nuevo o etanol al 70% limpia ¼" diámetro interno conductora tubería y ¼" diámetro exterior conectores para el conjunto del sistema.
   2. Almacén materiales de prueba incluyendo filtros, componentes PIVEC, pinzas y polvos de partículas en un entorno bien controlado, con respecto a la temperatura y la humedad, durante al menos 24 h antes del experimento.
      Nota: La temperatura debe estar cerca de temperatura ambiente, aproximadamente 20 ° C, con humedad relativa inferior al 35%. Esto es muy importante para lograr la repetibilidad entre experimentos.
   3. Preparar contadores de partículas usando isopropanol para limpiar las piezas y permite el calentamiento del sistema según las recomendaciones del fabricante, incluyendo el medidor de partículas de exploración movilidad (SMPS) y sizer de partículas óptico (OPS) para la medición.

2. generación de Aerosol seco

Nota: Los operadores deben realizar generación de aerosol en una campana de humos.

1. Montar un sistema para generar aerosoles secos
   Nota: La suspensión de partículas en el gas o líquido debe ser apropiada para la cultura de célula y aplicación modelada. El siguiente método se puede realizar utilizando un aerosol de base líquida. El diseño del sistema de aerosol seco es de Tiwari et al. ³⁷ un esquema del sistema de dispersión seca se muestra en la figura 1.
   1. Conectar la válvula de bola en cada extremo de la tubería de 4" 1/8 de tamaño de rosca, esto servirá como la tolva de la partícula. Conecte 2" 1/8 tamaño de tubería a una válvula.
   2. Pesar de nanopartículas de cobre, en este estudio la concentración en masa para cada tamaño de partícula se mantuvo constante al determinar la eficiencia de deposición. Utilice aproximadamente 7,5 mg de 40 nm cobre nanopartículas, 7 mg de 100 nm cobre nanopartículas y 13 mg de nanopartículas de cobre nm 800 por exposición. Colocar nanopartículas de cobre en la tolva de la partícula a través del extremo abierto.
      Nota: La cantidad de nanopartículas de cobre pesadas será la masa base concentración administrada.
   3. Coloque 3" ½" tubo de diámetro exterior (OD) alrededor de la tubería de 2" y el lugar un HEPA Filtro interior de este tubo corto que la dirección del flujo es a través de la válvula de bola.
   4. Conecte el generador de vacío a otra válvula de bola con rosca. Conecte el generador de vacío al tanque de aire colocando un tubo 5/16" OD en la conexión de la cerradura del empuje. Use ¼" OD de tubería para conectar la salida del generador de vacío para el montaje experimental mediante la colocación de la tubería sobre la salida del generador de vacío.
2. Uso del sistema de aerosol seco para generar aerosol seco
   1. Abrir el tanque de aire girando la válvula principal y permitir el flujo de aire al sistema. Abra la válvula en el regulador de flujo en el tanque de aire y establecer de forma que el flujo a través del sistema es equivalente a la configuración deseada de la bomba de vacío.
   2. La válvula de bola más cercana al filtro HEPA y abra la válvula de bola más cercana al generador de vacío. Mantener estas abierto para aproximadamente 3 s para permitir que las partículas se tiró en la corriente de aire.
   3. Cierre la válvula de bola más cercana para generador de vacío y luego cierre la válvula de bola más cercana al filtro HEPA. Permitir que el aire desde el tanque de flujo para la duración del experimento según sea necesario.
   4. Cerrar las válvulas principal y regulador en el tanque de aire para detener el flujo. Limpia las válvulas de bola y generador de vacío con etanol al 70%. Tubos de metal de autoclave para la esterilización.

3. deposición eficiencia medición PIVEC

Nota: Los operadores deben realizar exposiciones de aerosol en una campana de humos.

1. Medir la deposición por recoger los aerosoles de nanopartículas de cobre generado en el paso 2.2 de un filtro previamente tarado. Utilizar la dosis depositada, con la masa recogida en el filtro y la dosis administrada, con la cantidad de partículas de cobre pesadas, para determinar la eficiencia de deposición.
   1. Mantener filtros fibra vidrio 1,00 μm de poro bajo condiciones de baja humedad, descritos en 1.1.2, durante al menos 24 h antes de las medidas pre-exposición. Pesar un filtro sin usar tres veces y registrar los pesos de los filtros. Introduzca el lugar del filtro sin usar en un cultivo celular.
   2. Elegir el celular adecuado cultura insertar adaptador (bueno 6 o bien 24) para PIVEC apoyar la inserción de la cultura de célula con el filtro. Lugar cultivo celular Inserte adaptador en la parte superior de la base de PIVEC, puesta en lugar tal que la base de la pieza de adaptador es más ancha que la parte superior.
   3. Pinzas de uso para cultivo celular de filtro cargado Inserte dentro de pieza del adaptador. Coloque la pieza superior sobre la pieza de adaptador, colocar en su lugar que la base de la pieza superior es más ancha que la parte superior. Envuelva PIVEC con una sola capa de cinta adhesiva.
   4. Conectar piezas de cassette de 37 mm en la parte superior e inferior de PIVEC empujándolo a su lugar. Coloque un ¼" púas adaptadores de salida y entrada de cassette.
   5. Envuelva el calentador resistivo alrededor PIVEC tal que los cables están en la base. Cinta para asegurar.
   6. Envuelva PIVEC con 8 rondas de papel de aluminio para aislamiento. Asegure con cinta.
   7. Conectar 2" pedazo largo de 1/2" diámetro exterior tubería flexible para el adaptador en la parte superior PIVEC. Quite la tubería porosa del lugar dentro de la tubería en la parte superior PIVEC y agua estéril.
   8. PIVEC de lugar dentro de la abrazadera en el soporte de anillo y seguro. Montaje completo con bomba de vacío, contadores de partículas y configuración de aerosol.
      Nota: Se puede determinar la dosis depositada basados en número sólo si los contadores de partículas se colocan antes el PIVEC y después PIVEC en carreras separadas.
   9. Exponer los filtros usando paso 2.2 del protocolo y deseado de las tasas de flujo y tiempo de exposición, en este estudio que se utilizó un tiempo de exposición de 10 min a 0,5 LPM. Quitar PIVEC de la instalación. Saque el inserto de la cultura de célula y el filtro expuesto en soporte del filtro en condiciones de baja humedad durante al menos 24 h antes de las mediciones.
   10. PIVEC limpia con etanol al 70%. Esterilización con luz ultravioleta por lo menos 30 minutos antes del siguiente experimento.
   11. Pesar el filtro expuesto tres veces y registrar los pesos de los filtros. Coloque el filtro expuesto en un portafiltros etiquetados para el almacenamiento.

4. cálculo de la dosis depositada y la eficiencia de deposición

Nota: El conocimiento de la deposición es importante para administración de aerosol y la interpretación de la respuesta celular.

1. Calcular la deposición de medidas basadas en la masa
   1. Calcule la masa depositada en los filtros como la diferencia entre el peso promedio antes de la exposición y el peso promedio posterior a la exposición. Este valor es la dosis depositada en base masa para el experimento.
   2. Uso administrado masa, m_admin, y masas depositaron dosis determinada en 4.1.1, m_dep, para calcular la eficiencia de deposición basado en la masa, η_m, para el experimento.
      
   3. Valores promedio del 4.1.1 y 4.1.2 para por lo menos 3 experimentos determinar la deposición y la eficiencia de deposición para PIVEC de tamaño de partícula.
2. Calcular la deposición de medidas basadas en el número
   1. Asegurar que se han realizado mediciones con contadores de partículas con contadores después la PIVEC y para determinar la concentración de partículas antes de la PIVEC. Integrar la concentración de partículas en el tiempo para el contador de la partícula entonces integrar sobre el diámetro de la partícula para determinar el total de partículas medidas.
   2. Calcular el número de la partícula depositada como la diferencia entre las partículas administradas y el post-PIVEC de partículas medidas. Este valor es la dosis depositada número-basado para el experimento.
   3. Uso administrado las partículas, n_admin, basado en el número depositadas dosis, n_dep, flujo volumétrico, V y el tiempo, t, para calcular la eficacia de deposición basada en número, η_n, para el experimento.
      
   4. Valores promedio de 4.2.2 y 4.2.3 para por lo menos 3 experimentos determinar la deposición y la eficiencia de deposición para PIVEC de tamaño de partícula.

5. aerosol exposición de las células

Nota: Para la célula cultura en la interfase aire-líquido al lector se denomina blanco et al. ³⁸ los operadores deben realizar inserción de cultura celular carga (medidas 5.1.2-5.1.4) dentro de un gabinete de bioseguridad. Los operadores deben realizar exposiciones de aerosol en una campana de humos.

1. Células en cultivo en la interfase aire-líquido
   1. Levantar las células A549 frasco de cultivo mediante la adición de tripsina-EDTA 3 mL para un frasco de T75 o 1 mL para un frasco de T25 e incubar 5 min a 37 ° C. Agregar 7 mL de medio completo para un matraz T75 o 4 mL de medio completo para que un T25 frasco a frasco y enjuague frasco pared con suspensión maximizar el número de células recuperadas. Transferir la suspensión de células a un tubo cónico de 15 mL estéril y centrifugar las células a 800 x g durante 3 minutos.
   2. Retire el sobrenadante que contiene tripsina-EDTA y resuspender el precipitado de células en 10 mL de medio completo. Extraiga 10 μl de suspensión celular y añadir al hemocitómetro. Contar las células utilizando un hemocitómetro para determinar la concentración y el número total de células.
   3. Colocar 0,5 mL de medio completo para cada bien dentro de una placa bien 24. Lugar sin usar de la célula cultura insertos en los pozos. Cultivo de células de la semilla se inserta en el lado apical en una densidad de célula cerca de 1 x 10⁵ células/cm² para los tipos de células que crecen a un ritmo cerca de duplicar por día. A semilla A549 células dentro de 24 bien insertar, insertar células de semilla con una densidad de 1 x 10⁵ células/cm² agregando 35.000 células al cultivo celular.
      Nota: Las células con una tasa de crecimiento más lenta pueden ser sembradas a una densidad creciente de la célula.
   4. Añadir media completa en el lado apical de la célula cultura inserto para alcanzar el volumen final (para 24 volumen final del pozo de la placa es 0.25 mL).
   5. Cultura para 7 días en condiciones sumergidas, reemplazando a los medios de comunicación cada 1-2 días. Después de 7 días, retire la media apical y la cultura para al menos 1 día en condiciones de ALI, reemplazar sólo los medios de comunicación basolateral.
2. Montar PIVEC
   1. Permitir que las células alcancen la interfaz aire-líquido durante al menos 24 h antes de la exposición.
   2. Elegir celda apropiada cultura Inserte adaptador para PIVEC apoyar la inserción de la cultura de célula con el filtro. Cultivo de células de lugar Inserte adaptador encima PIVEC base, puesta en lugar tal que la base de la pieza de adaptador es más ancha que la parte superior. Añadir 4 mL de medio de cultivo celular para el bien de la base de la PIVEC.
   3. Pinzas de uso para el cultivo celular insertar dentro pieza adaptador colocado en el paso 5.2.3. Coloque la pieza superior sobre la pieza de adaptador, colocar en su lugar que la base de la pieza superior es más ancha que la parte superior. Cuidadosamente Envuelva PIVEC con una sola capa de cinta adhesiva.
   4. Conectar piezas de cassette de 37 mm en la parte superior e inferior de PIVEC, empujándolo a su lugar. Coloque un ¼" púas adaptadores de salida y entrada de cassette.
   5. Envuelva el calentador resistivo alrededor PIVEC tal que los cables están en la base. Cinta para asegurar.
   6. Envuelva PIVEC con 8 rondas de papel de aluminio para aislamiento. Asegure con cinta.
   7. Conectarse el adaptador en la parte superior PIVEC a pedazo corto de tubería flexible de 1/2" de diámetro exterior. Quite la tubería porosa del lugar dentro de la tubería en la parte superior PIVEC y agua estéril.
   8. PIVEC de lugar dentro de la abrazadera en el soporte de anillo y seguro. Completar la instalación con la bomba de vacío y el ajuste de aerosol.
3. Exponer las células a ALI con el PIVEC
   1. Eficiencia de deposición determinada en el paso 2 del uso para calcular la masa de las partículas a ser aerosolized. Pesar la masa adecuada y añadir al sistema de aerosol siguiente paso 2 dentro de la campana.
   2. Exponer las células siguiendo el paso 2.2, en este estudio de criterios de valoración biológicos las células fueron expuestas a aproximadamente 3,5 mg de nanopartículas de cobre con un caudal de 0,5 LPM y una duración de exposición de 10 minutos estudios de Control realizados utiliza aire humidificado para determinar la influencia del aire solamente. Quitar PIVEC de la instalación. Saque el inserto de la cultura de célula, colocar en la placa de la pozo estéril y vuelva a la incubadora de CO₂ (37 ° C, 5% CO₂, 90% HR).
   3. Medios de comunicación de PIVEC de aspirar. Si realizar experimentos adicionales, Fondo de enjuague de PIVEC con fosfato tamponada con solución a continuación, repita el paso 5.1 y 5.2.
   4. PIVEC limpia con etanol al 70% cuando haya terminado. Esterilización con luz ultravioleta por lo menos 30 minutos antes del siguiente experimento.
4. Procedimientos de ensayo biológico
   Nota: Ensayos realizados en este estudio fueron la generación de estrés oxidativo mediante el ensayo de DCFH-DA y la citotoxicidad a través de la liberación de lactato deshidrogenasa (LDH).
   1. Disolver 24,4 mg de DCFH-DA en 50 mL de metanol a 1 mM DCFH-DA solución. Esta solución puede conservarse a-20 ° C hasta 4 meses. Diluir 1 mM solución DCFH-DA mediante la mezcla de 0,1 mL de 1 mM DCFH-DA solución con 9,9 mL HBSS para realizar 10 mL de 10 μm DCFH-DA.
   2. Quite la célula medios de cultivo y lavado celular cultura inserto con aproximadamente 1 mL de PBS. Añadir 0,5 mL de 10 μm DCFH-DA solución a cada pocillo, sustitución de insertos cuando haya terminado. Cubra la placa con papel de aluminio para evitar la fotoactivación de colorante y volver a incubadora de 37° C durante 1 hora.
   3. Eliminar las células de la incubadora y aspirar la solución de trabajo DCFH-DA de los pozos. Añadir 0.5 mL HBSS a pozos y reemplazar la célula cultura insertos.
   4. La placa de la pozo de carga en placa lector y medida basal de la fluorescencia usando longitudes de onda de excitación/emisión de 485/530 nm. Retire la placa placa lector y carga insertar en PIVEC para exposición.
   5. Exponer a las células para la duración de la exposición deseada. Quitar relleno del PIVEC y regresar a la placa de la pozo. Quitar 50 μl del líquido basolateral del placa de la pozo y en la placa bien blanco 96. Medir la fluorescencia de DCF usando longitudes de onda de excitación/emisión de 485/530 nm cada 30 min posterior a la exposición durante 2 h.
   6. Que basolateral líquido alcancen la temperatura ambiente durante 20-30 minutos añadir 50 μl de solución de ensayo LDH mezcla siguiente protocolo del fabricante, a basolateral el fluido de la placa de la pozo y dejar reaccionar durante 10 minutos añadir 25 μl de solución de parada a. Leer la fluorescencia de resorufin producto, utilizando longitudes de onda de excitación/emisión de 560/590 nm.
   7. Extraer el líquido adicional basolateral y repita paso 5.4.6 en 4 h y 24 h post-exposición.

6 métodos estadísticos

1. Análisis de los datos de ensayo biológico
   1. Informe producción de ROS como el aumento de la intensidad de fluorescencia de células tratadas con respecto a las mediciones de línea base. Informe de actividad LDH como el aumento de la intensidad de fluorescencia de células tratadas con respecto a las células no tratadas.
   2. Realizar solo factor ANOVA para determinar diferencias estadísticas entre los conjuntos de datos. En su caso, realizar estudiante t-pruebas en un valor de significación de 0.05. Informe datos como la media ± desviación estándar de al menos tres mediciones de la exposición.

Resultados

Toxicología ocupacional en vitro implica mantener la viabilidad celular mientras realiza la exposición de aerosoles. El sistema PIVEC se muestra en la figura 2, incluyendo la temperatura y control de humedad y la PIVEC desgastada. La temperatura se mantuvo utilizando un calentador resistivo pilas y aerosol humidificado con mayor humectación natural a través de un tubo poroso, húmedo. En un aerosol controlado ajuste dentro de un laboratorio, el P...

Discusión

Cartuchos del filtro proporcionan un método simple y económico de la recogida de aerosoles en la zona de respiración; sin embargo, muestras de aerosol extraídas de los filtros representan la entera del aerosol (es decir, gases volátiles y partículas) y por lo tanto limitar la evaluación de efectos biológicos relacionados. Utilizando el diseño inicial del cartucho de filtro de 37 mm, el PIVEC está diseñado para mantener la portabilidad y mímico en vivo la deposición de partículas de la inhalación. ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Scanning mobility particle sizer (SMPS)	TSI, Inc.	3910	NanoSMPS
Optical particle sizer (OPS)	TSI, Inc.	3330
Stainless Steel Pipe, 4" Long	McMaster-Carr	4830K116	Standard-Wall 304/304L, Threaded on Both Ends, 1/8 Pipe Size
Brass Ball Valve with Lever Handle	McMaster-Carr	4112T12	Compact High-Pressure Rating, 1/8 NPT Female
Steel Pipe, 2" Long	McMaster-Carr	7753K121	Standard Wall, Threaded on One End, 1/8 Pipe Size
HEPA filter	GE Healthcare	09-744-12	HEPA-Cap Disposable Air Filtration Capsule
Vacuum Generator	PISCO USA	VCH10-018C
PIVEC	VCU		For design please contact authors
Resistive heater
1/4" barbed connectors	Zefon International, Inc.	459743
Porous tubing	Scientific Commodities, Inc.	BB2062-1814A	Hydrophilic 10 um pores
Battery power bank
Cell culture insert	Fisherbrand	353095	24 well plate insert
Filter Forceps	Fisherbrand	09-753-50
Transfer Pipette	ThermoScientific	13-711-27
Glass Fiber Filters	SKC	225-7	Binder-Free Type AE Filter 37 MM 1.00 um pore
Ultra Micro Balance	A&D	BM-22	Housed in environmental chamber
37 mm filter cassette	SKC	225-3250	Filter Cassette Blank, 37 mm, Clear Styrene
Variable flow vacuum pump	SKC	220-5000TC	AirChek TOUCH, 5 to 5000 mL/min
Copper Particles	U.S. Research Materials, Inc.	US1090	40 nm
Copper Particles	U.S. Research Materials, Inc.	US1088	100 nm
Copper Particles	U.S. Research Materials, Inc.	US1117M	800 nm