JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

نقدم هنا بروتوكولا لتدريب سكان خلية استخدام المحفزات الكهربائية والميكانيكية محاكاة فسيولوجيا القلب. هذا التحفيز الكهروميكانيكية يعزز إمكانات كارديوميوجينيك الخلايا المعالجة وهو استراتيجية واعدة لزيادة العلاج بالخلايا، والنمذجة المرض، وفحص المخدرات.

Abstract

أمراض القلب والأوعية الدموية هي السبب الرئيسي للوفاة في البلدان المتقدمة النمو. ونتيجة لذلك، قد حفز الطلب على العلاجات الفعالة خلية القلب الباحثين في مجالات الهندسة الحيوية والخلايا الجذعية لتطوير في المختبر عالية الدقة البشري عضلة القلب لكل من البحوث الأساسية والتطبيقات السريرية. ومع ذلك، هو النمط الظاهري غير ناضجة من خلايا القلب قيداً على الحصول على الأنسجة التي تحاكي وظيفيا في عضلة القلب الكبار، الذي يتسم أساسا بالإشارات الميكانيكية والكهربائية. وهكذا، والغرض من هذا البروتوكول هو إعداد وتنضج السكان الخلية المستهدفة عن طريق تحفيز الكهروميكانيكية، تلخيصا المعلمات الفسيولوجية. هندسة الأنسجة القلبية وتتطور نحو المزيد من النهج البيولوجية، واستراتيجيات تستند إلى المنبهات الفيزيائية، ومن ثم، تكتسب زخما. الجهاز لهذا الغرض هي فريدة من نوعها ويسمح التحفيز الكهربائية والميكانيكية فردية أو متزامنة، تتميز بعناية والتحقق من صحتها. على الرغم من أن قد تم تحسين المنهجية لهذا مشجعا وعدد سكانها خلية معينة، بالإضافة إلى ذلك، يمكن بسهولة أن تتكيف خطوط الخلايا والأجهزة الأخرى. وتوفر النتائج هنا دليلاً على التزام القلب زيادة السكان خلية بعد التحفيز الكهروميكانيكية. إظهار الخلايا اليكتروميتشانيكالي حفز تعبير زيادة علامات القلب الرئيسية، بما في ذلك الجينات المبكرة والهيكلية، وتنظم الكالسيوم. ويمكن تكييف هذه الخلية مفيدة لمواصلة العلاج بالخلايا التجديدي، والنمذجة المرض، وفحص المخدرات الفائق.

Introduction

وتستند وظيفة القلب اقتران الإثارة الكهربائية والميكانيكية الانكماش. باختصار، تسمح الوصلات بين الخلايا كارديوميوسيتي نشر الإشارة الكهربائية لإنتاج تقلصات متزامنة تقريبا من القلب أن ضخ الدم النظامية، ومن خلال نظام الرئوية. وهكذا تخضع خلايا القلب، القوى الكهربائية والميكانيكية التي تنظم وظيفة الجينات الخلوية والتعبير. وبناء على ذلك، حاول العديد من المجموعات تطوير منصات الثقافة التي تحاكي البيئة الفيزيولوجية القلب لفهم دور التحفيز الميكانيكية والكهربائية في التنمية القلب والدالة، ونضج. في المختبر الكهربائية والميكانيكية التحفيز على حدة قد طبقت على نطاق واسع في هندسة الأنسجة القلبية لتعزيز الخصائص الفنية، وزيادة نضوج الخلية، أو تحسين اقتران خلية خلية والكالسيوم مناولة1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21-غير تكييف الكهروميكانيكية متزامن لا تزال غير مستغلة بسبب التحدي المتمثل في وضع مشجعا والبروتوكول، وبسبب التحسين الإلزامي22.

تناولت أعمال أولية التحفيز الكهروميكانيكية كمزيج من التحفيز الكهربائي ونضح وسائط الإعلام؛ ومع ذلك، لا تنطوي على التدفق تشوه على أساس السلالة النموذجية لملء البطين23،،من2425. في وقت لاحق، المزيد من النهج الفسيولوجية مجتمعة المحفزات الكهربائية مع التشوه البدني أو امتداد لتقليد isovolumetric انكماش26،27،،من2829،30 ،31. فينغ et al. ووصف المظاهرة الأولى من التحفيز للمقاولات في عام 2005، الإبلاغ عن تعزيز خصائص الحجم والهوس كارديوميوسيتي26. وانغ pretreated الخلايا الجذعية الوسيطة مع 5-أزاسيتيديني et al. وتطبق المتزامنة تكييف الكهربائية والميكانيكية، وتحسين ريسيلولاريزيشن وبقاء الخلية، وتمايز القلب والأنسجة إعادة عرض27. منذ تلك المنشورات، قد ذكرت في حفز الكهروميكانيكية مونولاييرس الخلية المزيد من المجموعات أو هندسة الأنسجة (مثل الأسود28نوفاكوفيتش فانيك29،31، ولدينا مجموعة30) مع اختبار الخلايا مكيفة أول المجراة في30. بإيجاز، اختبر مورغان والأسود العديد من تركيبات من المحفزات الكهربائية والميكانيكية، الإبلاغ عن أن التوقيت بين التحفيز أمر حاسم نظراً لتأخر التحفيز الكهروميكانيكية مجتمعة تسفر عن نتائج أفضل28. بعد ذلك، جودير-Furnémont والمتعاونين الأمثل بروتوكولا تحفيز الكهروميكانيكية لثوابت عضلة القلب هندسيا من خلايا القلب الفئران حديثي الولادة وتحقيقه، للمرة الأولى، علاقة إيجابية قوة تردد29. بعد ذلك، ذكرت مجموعتنا أن الخلايا اليكتروميتشانيكالي اشترطت زيادة التعبير عن علامات القلب الرئيسي في المختبر وقاعدة عريضة مفيدة تأثيرات المجراة في، مثل تحسين وظيفة القلب أو زيادة كثافة السفينة في احتشاء المنطقة الحدودية30. نشر مؤخرا أظهرت تعرض أنسجة القلب من كارديوميوسيتيس المستمدة من الخلايا الجذعية لتكييف الكهروميكانيكية الذي تم التوصل إليه نضج مستوى أقرب إلى البشرية الكبار القلب هيكل ووظيفة31. بالإضافة إلى ذلك، تشمل منصات بديلة التحفيز ثلاثي الأبعاد السقالات اليكترواكتيفي التي توفر الكهربائية والميكانيكية، والإشارات الطوبوغرافية للخلايا تعلق32. وعلاوة على ذلك، يمكن أيضا الناجم عن تشوه الميكانيكية (خلية أحادي الطبقة وضغط الشارع) مع أقطاب المط محاكاة الظروف الفسيولوجية العادية، فضلا عن الظروف القاسية33.

ولذلك، والأساس المنطقي أن المحفزات الكهروميكانيكية في المختبر على أساس الظروف الفسيولوجية يمكن أن تعزز إمكانات كارديوميوجينيك خلية. في الواقع، هذا التحفيز يمكن أن تستفيد كذلك التكاملات الخلايا العلاجية في عضلة القلب في سيناريو السريري أو زيادة نضوج الأنسجة للمخدرات-فحص الطلبات.

وبالإضافة إلى ذلك، نحن معزولة ويتسم أن خلايا البشرية السلف المستمدة من الأنسجة الدهنية للقلب المنشأ (أتدبكس القلب)34. وتقع هذه الخلايا في الدهون ابيكارديال. هذه الخلايا تعرض تأثيرات نسيجية ووظيفية مفيدة في علاج احتشاء عضلة القلب وأيضا الحفاظ على التمايز القلب وبطانية المحتملة. 30 , 35-افترضنا أن هذه الفوائد ستزيد بعد التحفيز الفيزيائية الأحيائية.

ونتيجة لذلك، علينا وضع جهاز ونظام تحفيز للسكان خلية من الاهتمام والتحقيق الآثار. هذا البروتوكول الكهروميكانيكية هو استراتيجية جديدة للحث على الخلية النشطة التي تمتد بطريقة عقيمة ونونينفاسيفيلي بالمقارنة مع السابق منشورات36، في تركيبة مع تنشيط الحقل الكهربائي. الأسلوب الذي ذكرته هنا يشرح بالتفصيل الجهاز والطريقة المستخدمة لتحفيز الخلايا الكهربائية والميكانيكية والكهروميكانيكية.

هذا الجهاز يمكن أن توفر التحفيز الكهربائية والميكانيكية على حد سواء، بشكل مستقل أو في نفس الوقت. يتم التنشيط مع نهج جديد موسع والعقيم الذي يتضمن دعم الخلية بريستيريليزيد، أقطاب توضع داخل لوحة ثقافة قياسية، والنظام الأساسي الذي يدفع القوات الميكانيكية والكهربائية (الشكل 1).

يمكن أن تعقد المنصة تصل إلى ثقافة ست لوحات ويتكون هيكل ساندويتش poly(methyl methacrylate) الليزر قطع وقطع الدوائر المطبوعة-المجلس. النموذج الأولى للنظام الأساسي يعتمد على مزيج من أحادية الطور للبرمجة الكمبيوتر التي تسيطر عليها الكهربائية مشجعا، لوحة دائرة مطبوعة لاتصال قوي كهربائي، وستة 10 مم × 10 مم × 5 مم مطلية ثابتة نيوديميوم مغناطيس توضع القرب من جانب واحد من ألواح الثقافة. وهناك أيضا قضيب من ألمنيوم مع المغناطيس دافعة ستة (النموذج نفسه) وضعت أمام الجانب الآخر من لوحات الثقافة وانتقلت مع سيرفوموتور خطية. المحرك مدفوعة من قبل وحدة تحكم محرك، تعمل من خلال منفذ RS 232 بالبرمجيات التجارية (انظر الجدول للمواد). من خلال واجهة المستخدم ومشجعا للبرمجة، فمن الممكن لبرنامج كثافة الكهربائية، مدة النبضة والتردد، وتواتر التحفيز الميكانيكي، دورة العمل، والعدد من البقول، مطال النبض (رحلة المغناطيس)، والمنحدر.

figure-introduction-6690
الشكل 1 : مشجعا الكهروميكانيكية. (أ) PDMS بناء المستخدمة لتكييف الخلية. (ب) الرسم بناء PDMS، بما في ذلك الأقطاب الكهربائية وقطع المغناطيس. (ج) تفصيل الدوائر المطبوعة المجلس (منصة) المستخدمة لأداء التكييف الكهروميكانيكية. وقد تم تعديل هذا الفريق من Llucià-فالديبيراس et al.30. (د) صورة لواجهة المستخدم ومنصة التحفيز الكهروميكانيكية (الكمبيوتر). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

ويرد وصف كامل مشجعا وطريقة لتكييف الكهروميكانيكية في براءات الاختراع الدولية اثنين و WO-2013185818-A137 و WO-2017125159-A138.

سيليكون متوافق حيويا وكانت مصممة لتوفير الدعم الهيكلي للخلايا واقطاب المغناطيس بنيات الموصوفة سابقا10،21. بإيجاز، وهي تتألف من بولي دايمثيل سيلوكسان (PDMS)، مصبوب وعلاجه في درجة حرارة الغرفة، مع معامل الشباب 1.3 الآلام والكروب الذهنية، قريبة من المستويات الفسيولوجية. يحتوي على بنية تجمع ثقافة خلية في منطقة مرنة (10 مم × 10 مم × 2 مم)، فتحتا عرضية الداخلية عقد أقطاب كهربائية، واثنين المضمنة 6 مم × 2 مم × 4 مم مطلية نيوديميوم المغناطيس. أقطاب كهربائية يتم بناؤها مع 0.2 مم البلاتين الأسلاك الملتوية حول 2 مم × 3 مم × 12 مم تترافلوروايثيلين (PTFE) الأساسية بار (21 سم كل قطب، يتحول نحو 23) وتوضع على طرفي نقيض من منطقة مرنة تهيئة مجال الكهربائي لحمل التحفيز الكهربائي. تمتد الميكانيكية يتحقق من خلال الجذب المغناطيسية بين المغناطيس جزءا لا يتجزأ من الدعم والمغناطيس الخارجي بجوار لوحة الثقافة وعلى الذراع الألومنيوم تتحرك. وبهذه الطريقة، يمكن تمديد دعم الخلية دون كسر الحاجز العقيمة. هذا النهج مناسب لأحادي الطبقة خلية لكن يمكن تكييفه لثوابت ثلاثي الأبعاد، كذلك.

وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تكون نمطاً منتظما مطبوع حيث يتم المصنف الخلايا، قضت حيود [غرتينغ] (1,250 الأخاديد في مم) باستخدام. التصور مباشرة من الخلايا المستزرعة في بناء PDMS تحت برايتفيلد ومجاهر الفلورسنت ممكن بسبب شفافيته وسمك 0.5 مم. في هذه الحالة، قد تجمع الثقافة PDMS نمط سطح رأسي، عمودي على القوة تمتد محاذاة الخلايا عمودياً إلى الحقل الكهربائي، مما يقلل من التدرج الحقل الكهربائي عبر الخلية.

ويبين الشكل 1 وصفاً مفصلاً لبناء والجهاز المستخدم للتنشيط. بناء PDMS والخصائص هي الأمثل للخلية تمتد (الشكل 1 أ، ب). مشجعا البلدان المتقدمة النمو والتحقق من صحتها للتطبيق الفعال لتحفيز الكهربائية والميكانيكية المطلوبة للخلايا المرتبطة ببناء PDMS. وتشمل هذه العملية ضمان قابلية التشغيل المستخدم واتصال جيدة من خلال واجهة البرنامج (الشكل 1، د).

يرد وصف للإجراءات لتحفيز الخلية باستخدام هذا الجهاز مصنوعة خصيصا في قسم البروتوكول.

Protocol

وتستخدم هذه الدراسة أتدبكس القلب البشري من عينات المرضى. استخدامها وافقت عليه لجنة الأخلاقيات المحلية، وأعطى جميع المرضى المستنيرة. بروتوكول الدراسة تتفق مع المبادئ الواردة في "إعلان هلسنكي".

1-الأعمال التحضيرية

  1. ملاقط اﻷوتوكﻻف اثنين، 12 PTFE البلاتين أقطاب التحفيز الكهربائي، وبعض المناشف الورقية، في 121 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
  2. تعقيم 12 PDMS بنيات مصنوعة خصيصا (الشكل 1أ).
    1. تغسل كل بناء مع 5 مل ماء المقطر العقيمة مع التحريض المغناطيسي في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
    2. أغسل x 1 مع 5 مل إيثانول 70% مع الإثارة المغناطيسية في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
    3. أغسل x 5 مع 5 مل ماء المقطر العقيمة مع التحريض المغناطيسي في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة للمياه والصرف الصحي، لإزالة المخلفات الكحولية.
    4. الجاف بنيات على مناشف ورقية معقمة داخل بين عشية وضحاها تدفق مجلس الوزراء.
    5. تخزينها في أنابيب الطرد المركزي العقيمة 50 مل حتى الاستخدام.

2-خلية البذر (اليوم-1)

  1. قبل الخلية البذر، نقل بنيات PDMS تنظيفها إلى لوحات العقيمة وتعرضها للأشعة فوق البنفسجية لمدة 5 دقائق لضمان التعقيم الكامل.
  2. نقل كل بناء إلى لوحة الثقافة خلية 35 مم، أو لوحة 6، حسنا، لبذر الخلية فورا.
  3. تريبسينيزي المتلاقية قارورة T75 من أتدبكس القلب.
    1. أغسل قارورة T75 مع 5 مل 1 × مخزنة الفوسفات المالحة (PBS).
    2. أضف 1 مل من 0.05% التربسين-يدتا واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق لفصل الخلايا.
    3. إضافة 5 مل متوسطة كاملة لإلغاء تنشيط التربسين-يدتا.
    4. جمع كافة الخلايا في أنبوب 15 مل والغسيل قارورة x 2 مع 5 مل من برنامج تلفزيوني لجمع أي الخلايا المتبقية.
    5. الطرد المركزي في 230 س ز لمدة 5 دقائق عند 22 درجة مئوية وإزالة المادة طافية ريسوسبيند الخلايا في 2 مل متوسطة كاملة لحسابها مع الدائرة هيموسيتوميتير.
  4. البذور 200 ميليلتر من القلب أتدبكس (2.5 × 105 خلايا/مل) في تجمع الخلية من بنيات PDMS 12 (الشكل 1أ، ب) أن يكون ~ 80% السطح بذر المشمولة بالخلايا بعد يوم، واحتضان في 37 درجة مئوية و 5% CO2.
    ملاحظة: بعد ح 2 – 4، ينبغي أن يرفق الخلايا. أعد العدوى الخلية وفقا لحجم الخلية والنمو. لخلايا أصغر، ينبغي زيادة كثافة البذر.
  5. إضافة 2 مل متوسطة كاملة بريوارميد (α-الفنزويلية وتستكمل مع 10% الجنيني البقري المصل، 1% ل الجلوتامين، و 1% البنسلين-ستربتوميسين) بلطف للوحة الواحدة.
  6. احتضان بنيات في ظروف الثقافة (عادة ما تكون 37 درجة مئوية و 5% CO2) بين عشية وضحاها.

3-الكهروميكانيكية التحفيز الإعداد (يوم 0)

  1. قبل البدء في هذا الإجراء، أخذ ستة بنيات لتحفيز الكهروميكانيكية وستة كعناصر تحكم نونستيمولاتيد. مع أقل من ستة لوحات للتحفيز، استخدام ثوابت فارغ مع نفس الحجم المتوسط لضمان تنشيط الحقل الكهربائي السليم.
  2. تنظيف وحدة التحفيز مع الإيثانول 70% ووضعه في التدفق مجلس الوزراء.
  3. جعل أقطاب العقيمة وملاقط داخل مجلس الوزراء التدفق.
  4. إزالة 90% من وسائل الإعلام من لوحة الثقافة بسهولة التلاعب بأقطاب وثوابت. أولاً، وضع بنيات PDMS في الموضع الصحيح لضمان جاذبية مغناطيسية (PDMS التشرد داخل لوحة الثقافة نحو المغناطيس) بين المغناطيس الثابتة والمتحركة على حد سواء. بعد ذلك، الاتصال سلك البلاتين الموصلات القطب والجزء PTFE في مساحة معينة في بناء PDMS.
  5. إضافة 2.5 مل متوسطة كاملة بريوارميد جديدة لكل بناء.
    ملاحظة: الحفاظ على العقم طوال فترة الإجراءات، وتعمل على بناء واحد في وقت واحد. الإبقاء على بقية من بنيات في الحضانة عند 37 درجة مئوية و 5% CO2 حتى الاستخدام.
  6. حالما يتم وضع كافة بنيات PDMS وكهربائيا متصلاً بمنهاج العمل، يعود النظام الأساسي إلى الحاضنة في 37 درجة مئوية و 5% CO2.
  7. قم بتوصيل مصدر الكهربائية والميكانيكية.
  8. قم بتكوين برنامج التحفيز. تحديد نظم التحفيز الكهربائية والميكانيكية من خلال واجهات المستخدم مشجعا الكهربائية والتطبيق، والذي يتحكم في تنشيط ميكانيكية. تعيين التزامن على النحو التالي.
    1. التبديل مشجعا الكهربائية. انتظر إلى أن تظهر في العرض القائمة الرئيسية.
      1. ثم، حدد الخيار 2: تحرير تسلسل + Enter.
      2. تحرير قائمة التسلسل كما يلي.
        1. استخدم علامة التبويب وضع لتحديد الجهد أو التيار. حدد الحالية عن طريق النقر فوق + ، ثم اضغط Enter.
        2. لعلامة التبويب السعة ، حدد 1 (mA) مع +/- واضغط Enter.
        3. ل الفترة (T)، حدد 1000 (مللي ثانية) مع +/- واضغط مفتاح الإدخال Enter.
        4. تعيين مدة النبضة (Tw) إلى 2 (مللي ثانية) مع +/-- ، واضغط على Enter.
        5. على علامة التبويب وضع المشغل ، حدد خارجي بالبرمجيات واضغط Enter.
        6. في القائمة الرئيسية، حدد الخيار 4: إنشاء تسلسل واضغط على Enter.
          ملاحظة: تقع مشجعا الكهربائية في الاستعداد حتى تتلقى أمر الزناد من تطبيق مشجعا الميكانيكية عن طريق المنفذ التسلسلي.
    2. نفذ الخطوات التالية في المقطع التحفيز الميكانيكي للوحة التحكم التطبيق (الشكل 2-ج).
      1. كتابة 1,000 (ms) في عنصر تحكم النص فترة النبض .
      2. كتابة 500 (مللي ثانية) في عنصر تحكم النص على الوقت (Tw) لتعيين مدة نبض الميكانيكية.
      3. الكتابة 2,000 (الاتحاد الأفريقي) في عنصر تحكم النص رحلة لتسليم استطالة بناء 10%. هذا هو عدد الخطوات في المحرك التحكم الخطية.
        ملاحظة: بروتوكول تنشيط تطبيق هنا يتكون من البقول موجه مربعة أحادية الطور الحالي بالتناوب 2 مللي ثانية أم 50/سم في 1 هرتز و 10% تمتد لمدة 7 أيام. يتم تعيين أوقات صعود وهبوط نبض الميكانيكية في 100 مللي ثانية، تقليد تقريبا على شكل نبض الضغط الموقد. أيضا، يتم تعيين الوضع التكرار المستمر وهناك عداد عرض عدد النبضات.
  9. تغيير الإعلام 2 س أسبوع (الاثنين والخميس بعد الظهر). أولاً، قم بإزالة الوسائط القديمة؛ بعد ذلك إضافة وسائط الإعلام الحارة على جانبي دعم PDMS، ابدأ مباشرة على تجمع الخلية.
    ملاحظة: إذا كانت الخلايا يكون معدل نمو المرتفع، ينبغي أن تكون وسائل الإعلام 3 المتغير x أسبوع (مثلاً الاثنين والأربعاء والجمعة). من الضروري أن قطع وإعادة توصيل كافة الكبلات، ولكن ليست هناك حاجة إزالة لوحات الثقافة واقطاب من مكانها.
  10. جمع العينات بعد إجراء التجربة.

4-نموذج جمع في نهاية التجربة (اليوم السابع)

  1. لإجراء تحاليل الحمض النووي الريبي
    1. تغسل بنية x 2 مع 3 مل من س 1 برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    2. أضف 3 مل من 0.05% التربسين-يدتا لكل لوحة (ما يكفي لتغطية بناء أسرة) وانتظر لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية.
    3. بعد أن يتم فصل الخلايا، إضافة 2 مل متوسطة كاملة لإلغاء تنشيط التربسين-يدتا.
    4. جمع كافة الخلايا في 15 مل أنبوب وتغسل بنية x 2 مع 3 مل من برنامج تلفزيوني لجمع أي الخلايا المتبقية.
    5. أجهزة الطرد المركزي في 230 س ز لمدة 5 دقائق عند 22 درجة مئوية.
    6. إزالة المادة طافية وريسوسبيند بيليه في 1 مل من برنامج تلفزيوني.
    7. نقل الحل خلية أنبوب 1.5 مل وأجهزة الطرد المركزي في 230 س ز لمدة 5 دقائق.
    8. إزالة المادة طافية وتخزين بيليه في-80 درجة مئوية في 700 ميليلتر من تحلل الكاشف للمزيد من الحمض النووي الريبي العزلة.
    9. عزل الحمض النووي الريبي باستخدام مجموعة أدوات تجارية، اتباع إرشادات الشركة المصنعة.
    10. عكس-نسخ الرنا المعزولة باستخدام مجموعة أدوات وعشوائي hexamers، وفقا للبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة.
    11. لتركيزات الحمض النووي الريبي الصغيرة، بريامبليفي، وتمييع 1:5 مع المياه خالية من رناسي ثم، قبل أن يتم تنفيذ النسخ العكسي في الوقت الحقيقي اللاحقة تفاعل البوليميراز المتسلسل (RT-PCR). تواصل مع بروتوكول قياسي ل RT-PCR الوقت الحقيقي والتحقق من علامات القلب الرئيسية.
      ملاحظة: علامات القلب نموذجية تشمل العلامات المبكرة والمتأخرة من فئات مختلفة، مثل عوامل النسخ القلب (2A عامل محسن ميوسيتي على حدة [MEF2A] بروتين ملزمة غاتا 4 [غاتا-4]) والهيكلية (تروبونين القلب أنا [كتني]، القلب تروبونين تي [كتنت], α-أكتينين) وتنظيم الكالسيوم (Connexin43 [Cx43]، شركة ساركو-/هيولى Ca2 +-ATPase [SERCA2])30. يمكن أيضا إجراء عزل البروتين إذا لزم الأمر. يمكن إجراء عزل البروتين والحمض النووي الريبي متزامنة مع نفس العينة، باستخدام الكواشف المتوفرة تجارياً ومجموعات (جدول المواد) إذا كانت كمية العينة أقل.
  2. إيمونوستينينجس
    ملاحظة: وهذا يتم مباشرة على الخلايا المرفقة إلى تجمع خلية بناء PDMS. ولذلك، نوصي بوضع، كل مرة 1 سم × 1 سم من البارافين الفيلم على رأس تجمع الخلية، وبصرف النظر عن اللوحة غطاء، لتقليل تبخر الحلول حضانة.
    1. تغسل بنية x 2 مع 3 مل من برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    2. إصلاح الخلايا المرفقة للبناء مع 2 مل فورمالين 10% لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    3. تغسل الخلايا 3 x مع 3 مل من برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. للتخزين على المدى الطويل، تترك العينات في برنامج تلفزيوني مع أزيد الصوديوم 0.1% في 4 درجات مئوية.
    4. بيرميبيليزي الخلايا مع 3 مل من برنامج تلفزيوني + المنظفات 0.5% (3 x، كل الوقت 5-10 دقيقة، في درجة حرارة الغرفة).
    5. احتضان الخلايا مع 100 ميليلتر من برنامج تلفزيوني + ألبومين المصل البقري 1% عند درجة حرارة الغرفة ح 1، 10% مصل الحصان + + المنظفات 0.2% كتلة جسم غير محدد ملزم.
    6. احتضان الخلايا مع 100 ميليلتر من برنامج تلفزيوني + المنظفات 0.2% + ألبومين المصل البقري 1% + 10% مصل الحصان جسم الأولية في درجة حرارة الغرفة ح 1. على سبيل المثال، الابتدائي أجسام مضادة ضد Cx43 (1: 100)، ساركوميريك α-أكتينين (1: 100)، 4-غاتا (01:50)، MEF2 (01:25)، و SERCA2 (01:50).
    7. أغسل x 3 مع 3 مل من برنامج تلفزيوني في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
    8. احتضان الخلايا مع 100 ميليلتر من برنامج تلفزيوني + جسم الثانوية في درجة حرارة الغرفة في الظلام ح 1.
      ملاحظة: الأجسام المضادة الثانوية مترافق مع فلوروفوريس مختلفة واستخدمت عامل كونتيرستينينج.
    9. أغسل لهم x 3 مع 3 مل من برنامج تلفزيوني في درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة 5 دقائق.
    10. احتضان الخلايا مع 100 ميليلتر النووية تلطيخ (0.1 ميكروغرام/مل) في برنامج تلفزيوني في درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة 15 دقيقة.
    11. أغسل لهم x 3 مع 3 مل من برنامج تلفزيوني في درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة 5 دقائق.
    12. تخزين العينات في 3 مل من برنامج تلفزيوني مع أزيد الصوديوم 0.1% في 4 درجات مئوية حتى اقتناء.
      ملاحظة: اقتناء مجهر الممكن على مجاهر الفلورسنت و [كنفوكل] المقلوب مع أهداف المسافة الطويلة في العمل لأن سمك بناء حوالي 0.5 ملم.

النتائج

الرقم 2 يمثل المخطط العام اتباعها لتنشيط الخلية. بإيجاز، خلايا المصنف في بناء PDMS وتعرضوا لتحفيز الكهروميكانيكية، مع تغيير وسائل الإعلام يؤديها مرتين في أسبوع. واستخدمت كعنصر تحكم الخلايا نونستيمولاتيد للتكييف الكهروميكانيكية. بالإضافة إلى ذلك، يمكننا ?...

Discussion

التحفيز للمقاولات، على ما يبدو، بديلاً أمنا لإعداد الخلايا لبيئة معادية القلب وتعزيز التزامهم بالقلب. هنا، ذكرت بروتوكول وصف خلايا القلب السلف زيادة التعبير عن علامات القلب الرئيسي وهو أن تكون مفيدة لما زرع القادم في عضلة القلب مورين إينفاركتيد30. بشكل عام، أتدبكس القلب اليك...

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة الكشف عنها، إلا أن جهاز التحفيز والبروتوكول كانت سابقا براءة اختراع (WO-2013185818-A1، WO-2017125159-A1).

Acknowledgements

الكتاب أريد أن أشكر أعضاء "برنامج البحوث إيكريك" (إيجتب، بادالونا) الإلكتروني ومجموعة الأجهزة الطبية الحيوية (اتحاد الوطنيين الكونغوليين، برشلونة)، خاصة الأستاذ J. روسيل فيرير. وبالإضافة إلى ذلك، تقر الكتاب مجلة "الطب متعدية" الخلايا الجذعية والصحافة الفاميد للسماح بتكييف الأرقام المنشورة سابقا (Llucià-فالديبيراس, et al. 30)-تطوير هذا النموذج وتصميم البروتوكول كانت تدعمها وزارة التعليم ص العلوم (القوات المسلحة السودانية 2008-05144)، وزارة الاقتصاد دي y كومبيتيتيفيداد (القوات المسلحة السودانية 2014-59892)، "المفوضية الأوروبية" (البرنامج الإطاري السابع ريكاتابي، NMP3-SL-2009-229239)، المؤسسات La Marató de TV3 (080330، 201516، 201502)، ومؤسسة الفقرة la Innovación y la بروسبيكتيفا en السعود في إسبانيا (فيبسي؛ 06-00001396-15).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Stimulator
nickel plated neodymium magnetsSupermagneteQ-10-10-05-N
nickel-plated neodymium magnetsSupermagneteQ-06-04-02-HN
polydimethylsiloxane (PDMS) SYLGAR 184 Silicone Elastomer KitDow Corning Corp184
ruled diffraction grating (1250 grooves/mm)Newport05RG150-1250-2
Motor controllerFaulhaberMCLM-3006-S
LabviewNational Instruments
Cell culture
phosphate-buffered saline (PBS)Gibco70013-065
0.05% trypsin-EDTAGibco25300-120
35 mm cell culture dishBD Falcon45353001
fetal bovine serum (FBS)Gibco10270-106
L-Glutamine 200 mM, 100xGibco25030-024
Penicilina/Streptomicine, 10.000 U/mLGibco15140-122
Minimum essential medium eagle (alfa-MEM)SigmaM4526-24x500ML
Protein & RNA analyses
protease inhibitor cocktailSigmaP8340
QIAzol Lysis ReagentQiagen79306
AllPrep RNA/Protein KitQiagen50980404
Rneasy mini kitQiagen74104
iTaq Universal Probes One-Step KitBio-Rad Laboratories172-5140
Random hexamersQiagen79236
TaqMan PreAmp MasterMix 2xApplied Biosystems4391128
TaqMan Universal PCR MasterMixApplied Biosystems4324018
Immunostaining
10% formalinSigmaHT-501128-4L
horse serumSigmaH1138
Triton X-100SigmaX100-500ML
Bovine Serum Albumina (BSA)SigmaA7906-100G
PARAFILMSigmaP6543
4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)SigmaD9542
Phalloidin Alexa 568InvitrogenA12380
sodium azideSigmaS8032-100g
Hoechst 33342Sigma14533
Connexin-43 rabbit primary antibodySigmaC6219 lot#061M4823
sarcomeric α-actinin mouse primary antibodySigmaA7811 lot#080M4864
GATA-4 goat primary antibodyR&DAF2606 VAZ0515101
MEF2 rabbit primary antibodySanta Cruzsc-313 lot#E0611
SERCA2 goat primary antibodySanta Cruzsc-8095 lot#D2709
Cy3 secondary antibodyJackson ImmunoResearch711-165-152
Cy3 secondary antibodyJackson ImmunoResearch715-165-151
Cy3 secondary antibodyJackson ImmunoResearch712-165-150
Cy2 secondary antibodyJackson ImmunoResearch715-225-150
Cy2 secondary antibodyJackson ImmunoResearch711-225-152
Cy2 secondary antibodyJackson ImmunoResearch705-225-147

References

  1. McDonough, P. M., Glembotski, C. C. Induction of atrial natriuretic factor and myosin light chain-2 gene expression in cultured ventricular myocytes by electrical stimulation of contraction. Journal of Biological Chemistry. 267, 11665-11668 (1992).
  2. Tandon, N., et al. Electrical stimulation systems for cardiac tissue engineering. Nature Protocols. 4, 155-173 (2009).
  3. Serena, E., et al. Electrical stimulation of human embryonic stem cells: cardiac differentiation and the generation of reactive oxygen species. Experimental Cell Research. 315, 3611-3619 (2009).
  4. Tandon, N., et al. Optimization of electrical stimulation parameters for cardiac tissue engineering. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 5, 115-125 (2011).
  5. Zhang, X., Wang, Q., Gablaski, B., Lucchesi, P., Zhao, Y. A microdevice for studying intercellular electromechanical transduction in adult cardiac myocytes. Lab on a Chip. 13, 3090-3097 (2013).
  6. Chan, Y. C., et al. Electrical stimulation promotes maturation of cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells. Journal of Cardiovascular Translational Research. 6, 989-999 (2013).
  7. Pietronave, S., et al. Monophasic and biphasic electrical stimulation induces a precardiac differentiation in progenitor cells isolated from human heart. Stem Cells and Development. 23, 888-898 (2014).
  8. Pavesi, A., et al. Electrical conditioning of adipose-derived stem cells in a multi-chamber culture platform. Biotechnology and Bioengineering. 111, 1452-1463 (2014).
  9. Baumgartner, S., et al. Electrophysiological and morphological maturation of murine fetal cardiomyocytes during electrical stimulation in vitro. Journal of Cardiovascular Pharmacology and Therapeutics. 20, 104-112 (2015).
  10. Llucià-Valldeperas, A., et al. Electrical stimulation of cardiac adipose tissue-derived progenitor cells modulates cell phenotype and genetic machinery. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 9 (11), 76-83 (2015).
  11. Llucià-Valldeperas, A., et al. Physiological conditioning by electric field stimulation promotes cardiomyogenic gene expression in human cardiomyocyte progenitor cells. Stem Cell Research and Therapy. 5, 93 (2014).
  12. Radisic, M., et al. Functional assembly of engineered myocardium by electrical stimulation of cardiac myocytes cultured on scaffolds. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (52), 18129-18134 (2004).
  13. Fink, C., et al. Chronic stretch of engineered heart tissue induces hypertrophy and functional improvement. FASEB Journal. 14, 669-679 (2000).
  14. Zimmermann, W. H., et al. Engineered heart tissue grafts improve systolic and diastolic function in infarcted rat hearts. Nature Medicine. 12 (4), 452-458 (2006).
  15. Birla, R. K., Huang, Y. C., Dennis, R. G. Development of a novel bioreactor for the mechanical loading of tissue-engineered heart muscle. Tissue Engineering. 13, 2239-2248 (2007).
  16. Salameh, A., et al. Cyclic mechanical stretch induces cardiomyocyte orientation and polarization of the gap junction protein connexin43. Circulation Research. 106, 1592-1602 (2010).
  17. Galie, P. A., Stegemann, J. P. Simultaneous application of interstitial flow and cyclic mechanical strain to a three-dimensional cell-seeded hydrogel. Tissue Engineering Part C: Methods. 17 (5), 527-536 (2011).
  18. Leychenko, A., Konorev, E., Jijiwa, M., Matter, M. L. Stretch-induced hypertrophy activates NFkB-mediated VEGF secretion in adult cardiomyocytes. PLoS One. 6, 29055 (2011).
  19. Tulloch, N. L., et al. Growth of engineered human myocardium with mechanical loading and vascular coculture. Circulation Research. 109, 47-59 (2011).
  20. Mihic, A., et al. The effect of cyclic stretch on maturation and 3D tissue formation of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. Biomaterials. 35, 2798-2808 (2014).
  21. Llucià-Valldeperas, A., et al. Unravelling the effects of mechanical physiological conditioning on cardiac adipose tissue-derived progenitor cells in vitro and in silico. Scientific Reports. 8, 499 (2018).
  22. Stoppel, W. L., Kaplan, D. L., Black, L. D. Electrical and mechanical stimulation of cardiac cells and tissue constructs. Advanced Drug Delivery Reviews. 96, 135-155 (2016).
  23. Nunes, S. S., et al. Biowire: a platform for maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Nature Methods. 10, 781-787 (2013).
  24. Barash, Y., et al. Electric field stimulation integrated into perfusion bioreactor for cardiac tissue engineering. Tissue Engineering Part C: Methods. 16, 1417-1426 (2010).
  25. Maidhof, R., et al. Biomimetic perfusion and electrical stimulation applied in concert improved the assembly of engineered cardiac tissue. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 6, 12-23 (2012).
  26. Feng, Z., et al. An electro-tensile bioreactor for 3-D culturing of cardiomyocytes. A bioreactor system that simulates the myocardium's electrical and mechanical response in vivo. IEEE Engineering in Medicine and Biology Magazine. 24 (4), 73-79 (2005).
  27. Wang, B., et al. Myocardial scaffold-based cardiac tissue engineering: application of coordinated mechanical and electrical stimulations. Langmuir. 29 (35), 11109-11117 (2013).
  28. Morgan, K. Y., Black, L. D. Mimicking isovolumic contraction with combined electromechanical stimulation improves the development of engineered cardiac constructs. Tissue Engineering Part A. 20 (11-12), 1654-1667 (2014).
  29. Godier-Furnémont, A. F., et al. Physiologic force-frequency response in engineered heart muscle by electromechanical stimulation. Biomaterials. 60, 82-91 (2015).
  30. Llucià-Valldeperas, A., et al. Electromechanical Conditioning of Adult Progenitor Cells Improves Recovery of Cardiac Function After Myocardial Infarction. Stem Cell Translational Medicine. 6 (3), 970-981 (2017).
  31. Ronaldson-Bouchard, K., et al. Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells. Nature. 556 (7700), 239-243 (2018).
  32. Gelmi, A., et al. Direct Mechanical Stimulation of Stem Cells: A Beating Electromechanically Active Scaffold for Cardiac Tissue Engineering. Advanced Healthcare Materials. 5 (12), 1471-1480 (2016).
  33. Poulin, A., et al. An ultra-fast mechanically active cell culture substrate. Scientific Reports. 8 (1), 9895 (2018).
  34. Bayes-Genis, A., et al. Human progenitor cells derived from cardiac adipose tissue ameliorate myocardial infarction in rodents. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 49 (5), 771-780 (2010).
  35. Bagó, J. R., et al. Bioluminescence imaging of cardiomyogenic and vascular differentiation of cardiac and subcutaneous adipose tissue-derived progenitor cells in fibrin patches in a myocardium infarct model. International Journal of Cardiology. 169, 288-295 (2013).
  36. Zimmermann, W. H., et al. Tissue engineering of a differentiated cardiac muscle construct. Circulation Research. 90 (2), 223-230 (2002).
  37. Rosell Ferrer, F. X., Sánchez Terrones, B., Bragós Bardia, R., Bayés Genís, A., Llucià Valldeperas, A. Methods and devices for mechanical and electrical stimulation of stem cell monolayer and 3d cultures for tissue engineering applications. Spanish patent. , (2013).
  38. Bayés Genís, A., Llucià Valldeperas, A., Soler Botija, C., Bragós Bardia, R., Rosell Ferrer, F. X. Method for Conditioning Stem Cells. Spanish patent. , (2017).
  39. Roura, S., Gálvez-Montón, C., Bayes-Genis, A. Myocardial healing using cardiac fat. Expert Review of Cardiovascular Therapy. 16 (4), 305-311 (2018).
  40. Zhang, Y. M., Hartzell, C., Narlow, M., Dudley, S. C. Stem cell-derived cardiomyocytes demonstrate arrhythmic potential. Circulation. 106 (10), 1294-1299 (2002).
  41. Liu, J., Fu, J. D., Siu, C. W., Li, R. A. Functional sarcoplasmic reticulum for calcium handling of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes: insights for driven maturation. Stem Cells. 25 (12), 3038-3044 (2007).
  42. Wipff, P. J., et al. The covalent attachment of adhesion molecules to silicone membranes for cell stretching applications. Biomaterials. 30 (9), 1781-1789 (2009).
  43. Kim, C. iPSC technology--Powerful hand for disease modeling and therapeutic screen. Biochemistry and Molecular Biology Reports. 48 (5), 256-265 (2015).
  44. Ronaldson-Bouchard, K., Vunjak-Novakovic, G. Organs-on-a-Chip: A Fast Track for Engineered Human Tissues in Drug Development. Cell Stem Cell. 22 (3), 310-324 (2018).
  45. Bruyneel, A. A., McKeithan, W. L., Feyen, D. A., Mercola, M. Will iPSC-cardiomyocytes revolutionize the discovery of drugs for heart disease. Current Opinion inPharmacology. 42, 55-61 (2018).
  46. Farley, A., Johnstone, C., Hendry, C., McLafferty, E. Nervous system: part 1. Nursing Standard. 28 (31), 46-51 (2014).
  47. Brotto, M., Bonewald, L. Bone and muscle: Interactions beyond mechanical. Bone. 80, 109-114 (2015).
  48. Park, S. J., et al. Neurogenesis Is Induced by Electrical Stimulation of Human Mesenchymal Stem Cells Co-Cultured With Mature Neuronal Cells. Macromolecular Bioscience. 15 (11), 1586-1594 (2015).
  49. Vianney, J. M., Miller, D. A., Spitsbergen, J. M. Effects of acetylcholine and electrical stimulation on glial cell line-derived neurotrophic factor production in skeletal muscle cells. Brain Research. 1588, 47-54 (2014).
  50. Shima, A., Morimoto, Y., Sweeney, H. L., Takeuchi, S. Three-dimensional contractile muscle tissue consisting of human skeletal myocyte cell line. Experimental Cell Research. 370 (1), 168-173 (2018).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

143

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved