تحليل لطي البروتين، والنقل، وتدهور في الخلايا الحية بمطاردة نبض المشعة

Summary

هنا يمكننا وصف بروتوكول لأسلوب مطاردة نبض عامة يسمح تحليل الحركية قابلة للطي والنقل، وتدهور البروتينات الواجب اتباعها في الخلايا الحية.

Abstract

وصف تشيس نبض المشعة أداة قوية لدراسة نضوج كونفورماشونال، والنقل إلى مواقعها الخلوية الوظيفية، وتدهور البروتينات المستهدفة في الخلايا الحية. باستخدام أوقات قصيرة (نبض) راديولابيلينج (< 30 دقيقة) ورقابة مشددة من تشيس مرات، من الممكن تسمية سوى جزء صغير من تجمع مجموع البروتين واتبع الطي به. عندما جنبا إلى جنب مع نونريدوسينج/خفض مخزونات النشر الاستراتيجي-polyacrylamide هلام التفريد (الحزب الديمقراطي الصربي صفحة) وإيمونوبريسيبيتيشن مع الأجسام المضادة (تكيف محددة)، يمكن دراسة الطي العمليات بقدر كبير من التفصيل. وقد استخدم هذا النظام لتحليل قابلة للطي للبروتينات مع تباين كبير في خصائص مثل البروتينات القابلة للذوبان، البروتينات وحيدة ومتعددة تمرير transmembrane، N و O الغليكوزيلاتي البروتينات بشدة، والبروتينات مع أو بدون ثنائي كبريتيد واسعة النطاق الربط. أساليب مطاردة نبض هي أساس الدراسات الحركية إلى مجموعة من الميزات الإضافية، بما في ذلك شركة-والتعديلات بوستترانسلاشونال، أوليجوميريزيشن، والبلمره، أساسا يسمح تحليل البروتين من الولادة حتى الموت. دراسات نبض--تشيس في طي البروتين متكاملان مع أساليب أخرى البيوكيميائية والفيزيائية لدراسة البروتينات في المختبر بتقديم معلومات الفسيولوجية وزيادة الأزمنة. هي تكييف الأساليب كما هو موضح في هذه الورقة بسهولة لدراسة الطي تقريبا أي البروتين التي يمكن التعبير عنها في نظم الثدييات أو خلايا الحشرات.

Introduction

طي البروتينات البسيطة نسبيا حتى ينطوي على العديد من الإنزيمات المختلفة قابلة للطي ومرافقين الجزيئية، والتعديلات التساهمية¹. إعادة تشكيل كاملة لهذه العمليات في المختبر مستحيل عمليا، نظراً للعدد الهائل من المكونات المختلفة المعنية. ولذلك مرغوب فيه للغاية، دراسة البروتين قابلة للطي في فيفو، في الخلايا الحية. تقنيات تشيس نبض المشعة إثبات أداة قوية لدراسة التوليف، قابلة للطي، والنقل، وتحلل البروتينات في بيئتهم الطبيعية.

التمثيل الغذائي وسم البروتينات خلال نبضة قصيرة مع ³⁵S المسمى الميثيونين/سيستين، متبوعاً بعملية مطاردة في غياب تسمية المشعة، يتيح تتبع محددة من سكان بروتينات المركبة حديثا في أوسع الوسط الخلوية. ثم البروتينات المستهدفة يمكن أن تكون معزولة عن طريق إيمونوبريسيبيتيشن وتحليلها عن طريق الحزب الديمقراطي الصربي صفحة أو تقنيات أخرى. للعديد من البروتينات، ورحلتهم عبر الخلية تتميز بتعديلات مرئية في جل الحزب الديمقراطي الصربي صفحة. على سبيل المثال، غالباً ما يترافق نقل البروتينات الغليكوزيلاتي من هيولى (ER) إلى مجمع غولجي بإدخال تعديلات على جليكانس ن مرتبطة أو إضافة ربط س جليكانس^2،3. هذه التعديلات يؤدي إلى زيادات كبيرة في الكتلة الجزيئية الواضحة، التي يمكن رؤية التغييرات التنقل في صفحة الحزب الديمقراطي الصربي. يمكن أيضا علامة النضج بالانقسامات proteolytic، مثل الانقسام وإشارة-الببتيد أو إزالة برو-الببتيدات، أسفر عن تغييرات في الكتلة الجزيئية الواضحة التي يمكن اتباعها بسهولة على جل الحزب الديمقراطي الصربي-الصفحة⁴. النشاط الإشعاعي بمزايا كبيرة على تقنيات قابلة للمقارنة مثل مطاردات سيكلوهيكسيميدي، حيث تمنع تخليق البروتين الرواية، كما العلاجات أطول سامة للخلايا، ولا تستبعد غالبية البروتينات كبار السن، الحالة المستقرة من التحليل، وبعض البروتينات بإنصاف أيام. مقارنة البروتينات تحت كل نونريدوسينج والحد من الظروف يسمح تحليل ثنائي كبريتيد تشكيل السندات، خطوة هامة في طي العديد من البروتينات الافرازية^4،،من^{56، 7}.

هنا يصف لنا طريقة عامة لتحليل طي البروتين والنقل في خلايا سليمة، باستخدام نهج مطاردة نبض مشعة. بينما نحن وتهدف إلى توفير الأسلوب مفصلة قدر الإمكان، البروتوكول تتمتع بإمكانيات لا حدود لها تقريبا للقدرة على التكيف وسوف تسمح الأمثل لدراسة البروتينات المحددة كل قارئ.

البروتوكولين تشيس نبض البديلة، تقدم للخلايا ملتصقة (الخطوة 1، 1 من البروتوكول المعروضة هنا) وآخر لتعليق الخلايا (الخطوة 1، 2 من البروتوكول المعروضة هنا). الشروط المقدمة هنا تكفي لتصور بروتين أعربت مع المستويات المتوسطة إلى العليا التعبير. إذا كان القارئ يعمل مع البروتينات أعرب سيئة أو مختلف الظروف بوستريتمينت، مثل إيمونوبريسيبيتيشنز متعددة، من الضروري زيادة حجم صحن أو الخلية عدد مناسب.

لوقف نبض تشيس، مطاردة العينات المأخوذة في كل مرة نقطة الجميع مأخوذة من أنبوب واحد من الخلايا. خطوات الغسيل بعد أن يتم حذف النبض؛ بدلاً من ذلك، كذلك إدماج ³⁵S هو منع إضعاف مع فائض عالية من الميثيونين غير مسمى وسيستين.

استخدام البروتوكولات المقدمة المشعة ³⁵S المسمى سيستين والميثيونين لمتابعة عمليات طي البروتين الخلوي. ينبغي إجراء جميع العمليات مع الكواشف الإشعاعية باستخدام تدابير الحماية المناسبة للتقليل إلى أدنى حد من أي تعرض للمشغل والبيئة للإشعاع المشعة وأداؤها في أحد مختبرات معينة. كالنبض-المطاردة وسم تقنية غير فعالة نسبيا في الأوقات نبض قصيرة (< 15 دقيقة)، وأقل من 1% مبلغ بداية النشاط الإشعاعي الذي أدرج في البروتينات المركبة حديثا. بعد إثراء البروتين المستهدفة عن طريق إيمونوبريسيبيتيشن، العينة للحزب الديمقراطي الصربي صفحة تحتوي على أقل من 0.05 في المائة مبلغ بداية النشاط الإشعاعي.

على الرغم من أن استقرت الميثيونين ³⁵S وسيستين وسم ميكس، سوف يحدث بعض التحلل، مما أسفر عن المركبات المشعة المتطايرة،. حماية الباحث والجهاز، ينبغي اتخاذ بعض الاحتياطات. الباحث دائماً أن تمتثل لقواعد السلامة الإشعاعية المحلية وقد ارتداء فحم التمريض القناع، إلى جانب معطف مختبر وقفازات (مزدوجة). يجب فتح قنينة الأسهم مع ³⁵S الميثيونين وسيستين دائماً في غطاء دخان، أو تحت نقطة تطلعات محلية. بقع التلوث المختبرات المعروفة بأجهزة الطرد المركزي والماصات وأحواض المياه، وحاضنات والهزازات. يتم تقليل التلوث من هذه المناطق باستخدام ماصة نصائح مع عامل تصفية فحم، أنابيب ميكروسينتريفوجي ختم إيجابية (انظر الجدول للمواد)، وحوض الفحم الاسفنجيات في المياه والحمامات، الفحم تصفية ورقات ملتصقاً بأطباق نبض--تشيس، الفحم من الحرس في نظام الشفط، وإخضاع الأطباق التي تحتوي على الحبوب الفحم في الحاضنات وحاويات التخزين.

Protocol

كانت تعالج جميع الكواشف الإشعاعية والإجراءات وفقا لجامعة أوترخت المحلية الإشعاع القواعد والأنظمة.

1-نبض تشيس

1. نبض تشيس للخلايا ملتصقة
   ملاحظة: وحدات التخزين نظراً لهنا تستند إلى 60 مم خلية ثقافة الأطباق. 35 ملم أو أطباق 100 مم، ضرب وحدات التخزين قبل 1/2 أو 2، على التوالي. هذا البروتوكول يستخدم وقت نبض مرات 10 دقيقة ومطاردة من 0, 15 و 30، 60، 120 و 240 دقيقة. وهذه يمكن أن تختلف تبعاً للبروتينات المحددة قيد الدراسة (مناقشته أدناه).
   1. بذور الخلايا ملتصقة (مثلاً، شو HEK 293، هيلا،) في خلية 60 ملم الست ثقافة الأطباق حيث أن تكون سوبكونفلوينت (80%-90%) في اليوم لمطاردة النبض. استخدام صحن واحد على الأقل كل نقطة الوقت و/أو شرط.
   2. إذا لزم الأمر، ترانسفيكت الخلايا مع الكواشف المتوفرة تجارياً تعداء وفقا لإرشادات الشركة المصنعة؛ أو فيروسي ترانسدوسي⁸ الخلايا يوم 1 قبل النبض-المطاردة التجربة مع بنية مناسبة للتعبير.
   3. غسل الأطباق مع 2 مل من المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي (هانك لموازنة الحل الملح [حبس])، وإضافة 2 مل من المجاعة المتوسطة (العادي الثقافة المتوسطة تفتقر إلى الميثيونين وسيستين ومصل الدم البقري الجنين [FBS]، مثل الحد الأدنى المتوسطة الأساسية [MEM] دون الميثيونين وسيستين ولكن مع 10 ملم حبيس، درجة الحموضة 7.4)، ووضع الأطباق في حاضنة هوميديفيد مع 5% CO₂ 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
   4. نقل الأطباق على الرفوف في حمام مائي بريوارميد 37 درجة مئوية حيث أن أنهم على اتصال مع المياه ولكن لا تطفو. بدء تشغيل جهاز ضبط وقت.
   5. في 40 ق، نضح المتوسطة التجويع، بوضع 600 ميليلتر الحل النبض (وسائط المجاعة + صحن µCi/35 ملم 55 التسمية، راجع الملاحظة السابقة خطوة 1.1.1) إلى الماصة، وإضافته بلطف إلى مركز الطبق في الضبط 1 دقيقة تكرار هذه الخطوة في فواصل زمنية 1 دقيقة ل t أنه الأطباق المتبقية. بدء تشغيل مع العينة تشيس أطول لتوفير الوقت من خلال التجربة.
      ملاحظة: عند التعامل مع المواد المشعة، من الضروري اتباع الاحتياطات المناسبة والقواعد المحلية لمنع التعرض العرضي و/أو التلوث.
   6. في 11 دقيقة بالضبط وجميع الأطباق التالية، باستثناء العينة تشيس 0 دقيقة، إضافة 2 مل من تشيس المتوسطة مباشرة إلى الطبق ونضح أنه ومرة أخرى، أضف 2 مل من تشيس المتوسطة. كرر هذه الخطوة عند فواصل زمنية 1 دقيقة للاطباق المتبقية. نقل جميع الأطباق إلى حاضنة 37 درجة مئوية.
   7. في 16 دقيقة بالضبط، إضافة 2 مل من تشيس المتوسطة (العادي الثقافة المتوسطة + 10 مم حبيس [الأس الهيدروجيني 7.4]، سيستين 5 مم، والميثيونين 5 مم) مباشرة إلى الطبق عينة 0 دقيقة فوق المتوسط النبض إلى التوقف عن وضع العلامات؛ ثم نضح فورا ونقل الطبق إلى صفيحة ألومنيوم المبردة، وإضافة 2 مل من المخزن المؤقت إيقاف المثلج (حبس + 20 مم ن-اثيلماليميدي [NEM]).
      ملاحظة: هذا هو عينة تشيس 0 دقيقة. لهذه العينة، المضي قدما إلى الخطوة 1.1.9 مباشرة.
   8. نقل كل طبق مطاردة مرة أخرى إلى حوض ماء 2 دقيقة قبل كل مرة تشيس (مثلاً، 24 دقيقة لمطاردة 15 دقيقة)، وفي الوقت الدقيق تشيس (مثلاً، 26 دقيقة لمطاردة 15 دقيقة)، نضح مطاردة وسائل الإعلام (أو تحويلها إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي إذا أثر العلاقات العامة إفراز أوتين) ونقل الطبق إلى صفيحة ألومنيوم المبردة. إضافة 2 مل من المخزن المؤقت إيقاف المثلج.
   9. احتضان كل الأطباق على الجليد في المخزن المؤقت للتوقف لمدة دقيقة إيه فايف؛ ثم نضح الحل وقف وغسله مع 2 مل من محلول إيقاف المثلج. نضح الغسيل والاطباق مع 600 ميليلتر من تحلل المخزن المؤقت (الفوسفات مخزنة المالحة [برنامج تلفزيوني] + المنظفات نونديناتورينج [انظر الجدول للمواد] مثبطات البروتياز + + 20 مم NEM). استخدام مكشطة خلية لضمان أن يتم تفكيك الأطباق كمياً.
   10. نقل إلى 1.5 مل ميكروسينتريفوجي الأنبوبة والطرد المركزي ل 10 دقيقة في 15,000-20,000 x ز و 4 درجة مئوية بيليه الأنوية.
2. نبض تشيس لتعليق الخلايا
   ملاحظة: لضمان كفاءة وسم، ينبغي نابض الخلايا بتركيز 3 × 10⁶ إلى 5 × 10⁶ خلايا/مل، وينبغي أن تكون وحدات التخزين تشيس 4 × حجم النبض. في المثال التالي، نحن نابض 5 × 10⁶ خلايا في حجم 1 مل لمدة 10 دقائق، وأن تسفر عن خمسة مطاردة الوقت نقطة (0، 15، 30 و 60 و 120 دقيقة) 1 مل، الذي يحتوي على 1 × 10⁶ خلايا كل الوقت نقطة. جميع الحلول هي نفسها كما هو الحال في الفرع 1-1.
   1. ثقافة الخلايا تعليق (مثلاً، 3T3، جوركات) وفقا لبروتوكول منشورة سابقا⁹ حيث لا يوجد عدد كاف من الخلايا في وقت التجربة، على الأقل 1 × 10⁶ خلايا كل مرة نقطة و/أو شرط.
   2. إذا لزم الأمر، ترانسفيكت الخلايا مع الكواشف المتوفرة تجارياً تعداء وفقا لإرشادات الشركة المصنعة، أو فيروسي ترانسدوسي⁸ الخلايا يوم 1 قبل النبض-المطاردة التجربة مع بنية مناسبة للتعبير.
   3. بيليه 5 × 10⁶ خلايا كل شرط في أنبوب 50 مل لمدة 5 دقائق في 250 x g في درجة حرارة الغرفة، وغسلها x 1 مع 5 مل من وسائط الإعلام، والتجويع بيليه لهم مرة أخرى، وريسوسبيند لهم في 1 مل من المجاعة وسائط الإعلام.
   4. نقل الخلايا إلى حمام مائي 37 درجة مئوية، واحتضان هذه النسبة 10-25 دقيقة تحرض الأنابيب كل 10-15 دقيقة لمنع الخلايا من تسوية في الجزء السفلي.
   5. بدء تشغيل جهاز ضبط الوقت. 1 دقيقة بالضبط، إضافة µCi 275 (55 µCi/1 × 10⁶ خلايا) من تسمية غير مخفف مباشرة إلى الأنبوب الذي يحتوي على خلايا ودوامه لمزيج.
      ملاحظة: عند التعامل مع المواد المشعة، من الضروري اتباع الاحتياطات المناسبة والقواعد المحلية لمنع التعرض العرضي و/أو التلوث.
   6. في 11 دقيقة بالضبط، وقف وسم بإضافة 4 مل من مطاردة وسائل الإعلام. خلط العينة ونقل فورا 1 مل إلى أنبوب 15 مل على الجليد، والتي تحتوي على 9 مل من محلول إيقاف المثلج.
      ملاحظة: هذا هو عينة تشيس 0 دقيقة.
   7. كرر هذه الخطوات لكل نقطة الزمنية المتعاقبة. حالما يتم جمع جميع النقاط الزمنية، بيليه الخلايا لمدة 5 دقائق في 250 x ز في 4 درجات مئوية. نضح المتوسطة (أو تحويلها إلى أنبوب 15 مل جديدة إذا بعد إفراز البروتين). تغسل الخلايا مع 5 مل من محلول الإيقاف وبيليه الخلايا لمدة 5 دقائق في 250 x ز في 4 درجات مئوية.
   8. نضح الحل وقف وتماماً الخلايا مع 300 ميليلتر من المخزن المؤقت لتحلل المثلج واحتضانها لهم لمدة 20 دقيقة على الجليد لضمان تحلل كامل. نقل إلى 1.5 مل ميكروسينتريفوجي أنبوب وجهاز الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 15,000-20,000 x ز عند 4 درجة مئوية بيليه الأنوية.

2-إيمونوبريسيبيتيشن

1. الجمع بين الأضداد (انظر المناقشة) و 50 ميليلتر من حبات إيمونوبريسيبيتيشن (مثل البروتين A-سيفاروسي) (تعليق 10% [ت/ت] في المخزن المؤقت لتحلل + 0.25% ألبومين المصل البقري [جيش صرب البوسنة]) في ميكروسينتريفوجي أنبوب واحتضانها لهم عند 4 درجة مئوية ل ~ 30 دقيقة في شاكر.
2. بيليه الخرز لمدة 1 دقيقة في س 12,000 ز في درجة حرارة الغرفة ونضح المادة طافية. إضافة 200 ميليلتر من ليستي إلى الخليط حبة جسم واحتضان في 4 درجات مئوية في شاكر ح 1 أو رئيس-عبر رئيس إذا كان يتطلب إيمونوبريسيبيتيشن > ح 1.
3. بيليه الخرز لمدة 1 دقيقة في س 12,000 ز في درجة حرارة الغرفة. نضح المادة طافية وإضافة 1 مل من المخزن المؤقت للغسيل إيمونوبريسيبيتيشن. ضع العينة في شاكر في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
4. بيليه الخرز كما هو موضح في الخطوة 2، 3 وتكرار الغسيل 1 x. ثم نضح المادة طافية وريسوسبيند الخرز في 20 ميليلتر من المخزن المؤقت للشركة المصرية للاتصالات، الأس الهيدروجيني 6.8 (10 ملم تريس-HCl، يدتا 1 مم). الدوامة العينة.
5. إضافة 20 ميليلتر من 2 × العازلة عينة دون الفلزي، الدوامة، الحرارة لمدة 5 دقائق في 95 درجة مئوية، ودوامه مرة أخرى.
   ملاحظة: إلا إذا كان إعداد عينات الحد، 2 ميليلتر من 500 مم DTT يضاف في هذه المرحلة. وبعد ذلك، انتقل إلى الخطوة 2.7.
6. بيليه الخرز كما هو موضح في الخطوة 2، 3. نقل ميليلتر 19 من المادة طافية نونريدوسيد إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي طازجة التي تحتوي على 1 ميليلتر من 500 مم DTT، الطرد المركزي بعينه، ودوامه من قبل أنها تدفئة لمدة 5 دقائق عند 95 درجة مئوية مرة أخرى.
7. تدور أسفل العينة لمدة 1 دقيقة في س 12,000 ز؛ وهذا هو عينة مخفضة. بارد عليه وصولاً إلى درجة حرارة الغرفة وإضافة ميليلتر 1.1 م 1 NEM إلى انخفاض والعينة نونريدوسيد. دوامة وتدور أسفل العينات.

3-الحزب الديمقراطي الصربي صفحة

1. أولاً، تحديد المناسبة الحزب الديمقراطي الصربي صفحة حل جل النسبة المئوية للبروتين للفائدة. على سبيل المثال، فيروس نقص المناعة البشرية-1 gp120، عندما يعمل في كاتشين ~ 60 ديجليكوسيلاتيد، ويتم تحليلها في جل 7.5 في المائة.
2. إعداد الخليط جل حل دون تيميد وفقا لإرشادات الشركة المصنعة (x % الاكريلاميد، 375 مم تريس-HCl [الأس الهيدروجيني 8.8،] [w/v]، الحزب الديمقراطي الصربي 0.1% و 0.05% فوق كبريتات الأمونيوم [الجزائرية] [w/v]) وديغا تحت الفراغ > 15 دقيقة. بينما هو جليحه الخليط هلام، دقة تنظيف ألواح الزجاج هلام مع الإيثانول 70% وأنسجة خالية من الوبر ووضعها في جهاز صب.
3. إضافة تيميد إلى خليط جل حل (في تركيز نهائي من 0.005 في المائة [v/v]) ومزيج دقيق "الماصة؛" بين ألواح الزجاج، تاركاً مساحة سم ~1.5 لجل التراص. عناية تراكب الهلام مع منزوع ح₂س أو الأيسوبروبانول وترك الأمر بلمرة.
4. مرة واحدة قد بلمرة هلام حل، إعداد خليط جل التراص (الاكريلاميد 4%، 125 ملم تريس-HCl [الأس الهيدروجيني 6.8]، [w/v]، الحزب الديمقراطي الصربي 0.1% و 0.025% APS [w/v]).
5. مسح الجزء العلوي من جل حل مع منزوع ح₂س، وبعد ذلك، إزالة جميع المياه.
   ملاحظة: استخدام ورق الترشيح لإزالة قطرات الماضي.
6. إضافة تيميد إلى خليط جل التراص (0.005 في المائة [v/v])، ومزيج دقيق، وتراكب هلام حل مع التراص هلام وإدراج مشط 15-جيدا. مرة واحدة وقد بلمرة هلام التراص، أنه نقل إلى دائرة تشغيل وملء الدوائر العليا والسفلي مع تشغيل المخزن المؤقت (25 مم تريس-HCl و 192 مم جليكاين [الأس الهيدروجيني 8.3] 0.1% الحزب الديمقراطي الصربي [w/v]).
7. تحميل 10 ميكروليتر من عينة كل حارة في مينيجيل 15-لين. تجنب تحميل العينات في المرحلة الأولى ولين الأخير على الجل وتحميل المخزن المؤقت الذي عينة نونريدوسينج في جميع الممرات الفارغة لمنع يبتسم العصابات. تشغيل المواد الهلامية في ثابت mA 25/هلام حتى الصبغ والجبهة في الجزء السفلي من الجل.
8. إزالة المواد الهلامية من ألواح الزجاج، وصمة عار الهلام مع الحل تلطيخ البروتين (10% حمض الاستيك والميثانول 30% في ح₂س + 0.25% الرائعة الأزرق R250 [w/v]) لمدة 5 دقائق مع الانفعالات، وثم، ديستين لمدة 30 دقيقة مع ديستينينج الحل (تلطيخ الحل دون الرائعة R250 الأزرق).
9. ترتيب المواد الهلامية الوجه للأسفل على بلاستيك التفاف، ومن ثم، ضع 0.4 مم كروماتوغرافيا الورق فوقهم. وضع هلام ساندويتش اللوني للورق-الجانب الأسفل على هلام مجفف. بناء على تعليمات الشركة المصنعة، الجاف للمواد الهلامية ح 2 عند 80 درجة مئوية.
10. نقل المواد الهلامية المجففة إلى كاسيت وتراكب لهم مع شاشة السينما أو الفوسفور أوتوراديوجرافي. في حالة استخدام الفيلم autoradiography، يجب إجراء هذه الخطوة في غرفة مظلمة.

النتائج

ويرد في الشكل 2قابلة للطي وإفراز gp120 فيروس نقص المناعة البشرية-1 من تشيس نبض ملتصقة. هلام نونريدوسينج (NR الخلايا في الشكل) يبين طي عنصر مؤكسد من gp120. فورا بعد النبض وسم من gp120 5 دقيقة (0 دقيقة تشيس) يظهر كعصابة منتشر في الهلام أعلى، وكما تقدم تشيس، ترحيل الفرقة أ...

Discussion

أساليب مطاردة نبض كانت ضرورية لتطوير فهم العلماء من البروتين قابلة للطي في خلايا سليمة. في حين أننا حاولنا أن توفر طريقة عامة قدر الإمكان، هذا النهج ينطوي على إمكانية للاختلافات لا حدود لها تقريبا لدراسة مختلف العمليات التي تحدث خلال قابلة للطي، النقل، والحياة للبروتينات داخل الخلية.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL safeseal microcentrifuge tubes	Sarstedt	72.706.400
Acetic Acid	Sigma	A6283	glacial acetic acid
BAS Storage phosphor screen 20x25 cm	GE Life Sciences	28956475
Bromophenol Blue	Sigma	B8026	Molecular biology grade
Carestream Biomax MR films	Kodak	Z350370-50EA
Cell-culture media	Various	N/A	Normal cell culture media for specific cell-lines used
Cell-culture media, no methionine/cysteine	Various	N/A	Same media formulation as normal culture media e.g DMEM/MEM/RPMI, lacking methionine and cysteine
Charcoal filter paper	Whatman	1872047
Charcoal filtered pipette tips	Molecular bioproducts	5069B
Charcoal vacu-guard	Whatman	67221001
Coomassie Brilliant Blue R250	Sigma	112,553	for electrophoresis
Cysteine	Sigma	C7352	Molecular biology grade, Make 500 mM stock, store at -20
Dithiothreitol (DTT)	Sigma	10197777001	Molecular biology grade
EasyTag Express35S Protein Labeling Mix	Perkin Elmer	NEG772014MC	Other size batches of label are available depending on useage
EDTA	Sigma	E1644	Molecular biology grade
Gel-drying equipment	Various	N/A
Glycerol	Sigma	G5516	Molecular biology grade
Grade 3 chromatography paper	GE Life Sciences	3003-917
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)	Gibco	24020117
Kimwipes delicate task wipes	VWR	21905-026
MES	Sigma	M3671	Molecular biology grade
Methanol	Sigma	MX0490
Methionine	Sigma	M5308	Molecular biology grade, Make 250 mM stock, store at -20
Minigel casting/running equipment	Various	N/A
NaCl	Sigma	S7653	Molecular biology grade
N-ethylmaleimide	Sigma	E3876	Molecular biology grade, Make 1M stock in 100% ethanol, store at -20
PBS	Sigma	P5368	Molecular biology grade
Protein-A Sepharose fastflow beads	GE health-care	17-5280-04
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)	Sigma	L3771	Molecular biology grade
Triton X-100	Sigma	T8787	Molecular biology grade
Trizma base (Tris)	Sigma	T6066	Molecular biology grade
Typhoon IP Biomolecular imager	Amersham	29187194
Unwire Test Tube Rack 20 mm for waterbath	Nalgene	5970-0320PK