단백질 폴딩, 전송, 및 방사성 펄스 체이스 하 여 살아있는 세포의 저하의 분석

요약

여기는 접는, 전송 및 라이브 셀에 따라 단백질의 저하의 운동 분석을 허용 하는 일반적인 펄스-체이스 메서드에 대 한 프로토콜에 설명 합니다.

초록

방사성 펄스-체이스 라벨 구조적 성숙, 그들의 기능 세포 위치와 라이브 셀에 대상 단백질의 저하를 전송 위한 강력한 도구입니다. 짧은 (펄스) radiolabeling 시간을 사용 하 여 (< 30 분) 체이스 시간을 엄격 하 게 제어 하 고 총 단백질 풀의 극히 일부에 고의 접는 따라 수. Nonreducing/감소 SDS polyacrylamide 젤 전기 이동 법 (SDS 페이지) 및 immunoprecipitation (나 란 특정) 항 체와 결합 될 때 프로세스를 접는 훌륭한 세부 사항에서 시험 될 수 있다. 이 시스템 단백질 용 해 단백질, 단일 및 멀티 패스 막 횡단 단백질, 무 겁 게 N 및 O 당화 단백질, 속성에 거 대 한 변화 및 광범위 한 이황화 없이 단백질의 폴딩 분석 하는 데 사용 되었습니다. 결합. 펄스 추적 방법 등 공동 및 posttranslational 수정, oligomerization, 중 합, 근본적으로 죽음에 출생에서 단백질의 분석을 수 있도록 추가 기능의 범위에 활동적인 연구의 기초입니다. 단백질 폴딩에 펄스 체이스 학문은 증가 시간적 해상도 생리 적인 정보를 제공 하 여 단백질에서 생체 외에서 공부에 대 한 생화학 및 생물 다른 방법으로 보완. 이 문서에서 설명 된 대로 메서드는 포유류 나 곤충 세포 시스템에서 표현할 수 있는 거의 모든 단백질 폴딩 공부를 쉽게 적응 됩니다.

서문

심지어 상대적으로 간단한 단백질의 폴딩 포함 많은 다른 접는 효소, 분자 보호자, 화학식 수정¹. 이러한 프로세스에서 생체 외에서 의 완전 한 재구성 실질적으로 불가능 하다, 관련 된 다른 구성 요소의 광대 한 번호. 그것은 매우 바람직한, 그러므로, 라이브 셀에서 vivo에서, 접히는 단백질을 공부 하입니다. 방사성 펄스-체이스 기술을 증명 합성, 접는, 전송, 그리고 그들의 자연적인 환경에 있는 단백질의 공부를 위한 강력한 도구.

대사 ³⁵S 표시 된 메티오닌 시스테인과 짧은 펄스 동안 단백질의 라벨, 방사성 라벨의 부재에 체이스 뒤, 넓은 셀룰러 환경에서 새로 합성된 단백질의 인구의 특정 추적을 수 있습니다. 그리고 대상 단백질 격리 를 통해 immunoprecipitation 수 분석을 통해 SDS 페이지 또는 다른 기술. 많은 단백질에 대 한 셀을 통해 그들의 여행은 SDS 페이지 젤에 표시 되는 수정에 의해 표시 됩니다. 예를 들어 골 복잡 한 당화 단백질 바인딩과 그물 (응급실)에서 교통은 종종 함께 N 연결 된 glycans의 수정 또는 O 연결 glycans^2,3의 추가 합니다. 이러한 수정 이동성 변화 SDS 페이지에 의해 볼 수 있는 명백한 분자 질량에 있는 큰 증가 일으킬. 성숙 신호 펩 티 드 분열 등 프로-펩 티 드, SDS 페이지 젤⁴에 쉽게 따라 할 수 있는 명백한 분자 질량에 있는 변화 결과로 제거 분해 분열에 의해 표시할 수 있습니다. 방사능 어디 소설 단백질 합성 방지, 긴 치료 세포에 독성 그리고 더 오래 된, 안정 상태에서 단백질의 대부분을 제외 하지 마십시오 cycloheximide 추격전 같은 유사한 기술에 비해 상당한 장점을 있는 분석, 일부 단백질 일의 반감기를가지고. 모두 nonreducing에서 단백질의 비교 조건 감소 고 이황화 결합 형성, 많은 분 비 단백질^4,,56, 의 폴딩에 중요 한 단계 분석 ⁷.

여기 우리가 방사성 펄스-체이스 방식을 사용 하 여 단백질 폴딩과 그대로 셀에 수송의 분석에 대 한 일반적인 방법을 설명 합니다. 우리로 방법을 제공 하는 목적으로 하는 동안, 가능한 상세한 프로토콜 적응성에 대 한 거의 무한 한 잠재력이 고 각 독자의 특정 단백질 공부를 최적화 하면.

두 개의 다른 펄스-체이스 프로토콜, 부착 셀 (여기에 제시 된 프로토콜의 단계 1.1)와 현 탁 액 셀 (여기에 제시 된 프로토콜의 단계 1.2) 제공 됩니다. 조건을 제공 여기 중간-높은 식 수준으로 표현 되는 단백질을 시각화 하기에 충분. 독자가 제대로 표현한 단백질 또는 여러 immunoprecipitations 등의 다양 한 posttreatment 조건으로 작동 하는 경우 그것이 접시 크기를 늘리거나 셀 번호를 적절 하 게 필요 합니다.

서 스 펜 션 펄스 체이스, 체이스 샘플 각 시간 지점에서 찍은 모두에서 가져옵니다 셀의 단일 튜브. 세척 단계 후 펄스는 생략; 대신, 추가 ³⁵S의 레이블이 메티오닌과 시스테인의 높은 과잉을 가진 희석에 의해 방지 된다.

제시 프로토콜 세포질 단백질 접히는 과정에 따라 방사성 ³⁵S 표시 된 시스테인 그리고 메티오닌을 사용 합니다. 연산자와 환경 방사능 방사선에의 한 노출을 최소화 하 여 지정 된 실험실에서 수행 될 적절 한 보호 조치를 사용 하 여 방사성 시 약으로 모든 작업을 수행 되어야 합니다. 펄스-체이스로 기술 라벨은 상대적으로 효율적인 짧은 펄스 시간에 (< 15 분), 방사능의 시작 금액의 1%는 새로 합성된 단백질에 포함 하는 보다는 더 적은. Immunoprecipitation 통해 대상 단백질의 농축 후 방사능의 시작 금액의 0.05% 미만 SDS 페이지에 대 한 샘플에 포함 되어 있습니다.

³⁵S 메티오닌과 시스테인 믹스 라벨 안정화는, 비록 일부 분해, 휘발성 방사성 화합물, 저조한 발생 합니다. 연구원 및 기구를 보호 하기 위해 몇 가지 예방 조치는 취해야 한다. 연구원 항상 로컬 방사선 안전 규칙을 순종 해야 하 고 숯 마스크 실험실 외 투와 (더블) 장갑 외에 간호를 입을 수 있습니다. 증기 두건에서 또는 로컬 포부 지점에서 ³⁵S 메티오닌과 시스테인 재고 튜브 항상 열 수 있습니다. 알려진된 실험실 오염 명소 원심 분리기, 펫, 물 욕, 인큐베이터 및 동영상 있습니다. 차콜 필터, 긍정적인 물개 microcentrifuge 튜브 ( 재료의 표참조), 펄스-체이스 요리에 붙어 물 목욕, 숯 필터 종이에 목탄 수족관 스폰지 피 펫 팁을 사용 하 여이 분야의 오염 감소 목탄 가드 포부 시스템 및 요리 incubators 및 스토리지 컨테이너에 숯 곡물의 배치.

프로토콜

모든 방사성 시 약 및 절차는 로컬 위트레흐트 대학 방사선 규칙 및 규정에 따라 처리 합니다.

1. 펄스 체이스

1. 부착 세포에 대 한 펄스 체이스
   참고: 여기에서 주어진 볼륨 기반으로 60 mm 셀 문화 요리 합니다. 35 m m 또는 100mm 요리, 곱합니다 볼륨 1/2 또는 2, 각각. 이 프로토콜은 0, 15, 30, 60, 120, 및 240 분의 10 분와 체이스의 펄스 시간을 사용합니다. 이러한 (아래 설명) 공부 되 고 특정 단백질에 따라 변화 될 수 있습니다.
   1. 그렇게 그들은 있을 것입니다 부착 세포 (예를 들어, HEK 293, 헬러, 조) 6 60mm 셀 문화 요리에서 씨앗 펄스 체이스의 날 subconfluent (80%-90%). 시간 포인트 또는 조건 당 적어도 1 개의 접시를 사용 합니다.
   2. 필요한 경우 transfect 셀 제조업체의 지침;에 따라 상용 transfection 시 약을 또는 virally transduce⁸ 셀 1 일전 펄스-체이스 실험 식에 대 한 적절 한 구성.
   3. 워시 버퍼 (행 크의 균형 소금 솔루션 [HBSS])의 2 개 mL와 설거지, 기아 매체 (일반 문화 매체 메티오닌과 시스테인 없이 최소 필수 매체 [가상 메모리] 같은 메티오닌과 시스테인 및 소 태아 혈 청 [FBS] 부족의 2 개 mL를 추가 하지만 10 mM HEPES, pH 7.4), 15 분 동안 5% CO₂ 와 37 ° C 습도 인큐베이터에서 요리를 놓습니다.
   4. 그들은 물과 접촉 하지만 떠 있 하지 않습니다 prewarmed 37 ° C 물 욕조에 선반에 요리를 전송. 타이머를 시작 합니다.
   5. 40에 s, 기아 중간 발음, 펄스 솔루션 (기아 미디어 + 55 µCi/35 m m 접시, 앞 단계 1.1.1 참고)의 600 µ L를 세우는 피 펫에 추가 부드럽게 접시의 중앙에 정확 하 게 1 분 반복에서이 단계 t에 대 일 분 간격 그 나머지 요리입니다. 실험 하는 동안 시간을 절약할 수 긴 체이스 샘플으로 시작 합니다.
      참고: 방사성 물질을 처리 하는 경우 필수적입니다 적절 한 예방 조치 및 로컬 규칙 및 우발적인 노출 및 오염 방지를 규정에 따라.
   6. 정확 하 게 11 분 및 0 분 체이스 샘플 제외한 모든 다음 요리 접시에 직접 체이스 중간의 2 개 mL를 추가 하 고, 발음 한 다시, 체이스 매체의 2 개 mL를 추가. 1 분 간격으로 나머지 요리에 대 한이 단계를 반복 합니다. 37 ° C 배양 기에 모든 요리를 전송.
   7. 정확히 16 분 체이스 중간의 2 개 mL를 추가 (일반 배양 + 10 mM HEPES [pH 7.4] 5mm 시스테인 그리고 메티오닌 5mm) 라벨; 막으려고 펄스 매체 위에 0 분 샘플 접시에 직접 즉시 발음, 냉각된 알루미늄 접시에 접시를 전송 그리고 얼음 정지 버퍼 (HBSS + 20mm N-ethylmaleimide [NEM])의 2 개 mL를 추가 합니다.
      참고: 이것은 0 분 체이스 샘플입니다. 이 샘플에 대 한 직접 1.1.9 단계를 진행 합니다.
   8. 다시 물 목욕 2 분 전에 각 체이스 (예를 들어, 15 분 체이스 24 분) 각 체이스 접시를 전송, 정확한 체이스에 (예를 들어, 15 분 체이스 26 분), 체이스 미디어 발음 (또는 microcentrifuge 튜브에 전송 하는 경우 다음과 같은 홍보 otein 분 비)와 냉각된 알루미늄 접시에 접시를 전송. 얼음 처럼 차가운 중지 버퍼의 2 개 mL를 추가 합니다.
   9. ≥5 분;에 대 한 중지 버퍼에 얼음에 모든 요리를 품 어 그리고, 그만 솔루션 발음 얼음 정지 솔루션의 2 mL와 함께 그것을 씻어. 세척을 발음 하 고 요리 세포의 용 해 버퍼의 600 µ L lyse (인산 염 버퍼 염 [PBS] + nondenaturing 세제 [참조 테이블의 자료] protease 억제제 + 20mm NEM). 셀 스 크레이 퍼를 사용 하 여 요리 양적 lysed 되도록.
   10. 1.5 mL microcentrifuge 튜브 및 15000-20000 x g 에서 10 분 및 작은 핵을 4 ° C 원심 분리기는 lysate 전송.
2. 현 탁 액 셀에 대 한 펄스 체이스
   참고: 효율적인 라벨 되도록 3 x 10⁶ 5 x 10⁶ 셀/mL의 농도에서 세포를 펄스와 체이스 볼륨 4 펄스 볼륨 배 이어야 한다. 다음 예제에서 우리는 5 x 10⁶ 셀 10 분 1 mL의 볼륨에 펄스, 항복에 5 시간 추적 (0, 15, 30, 60, 및 120 분)을 포함 하는 시간 포인트 당 1 x 10⁶ 셀 1 mL의 포인트. 모든 솔루션은 섹션 1.1에서와 같이.
   1. 세포의 충분 한 수는 실험의 시간에 시간 당 적어도 1 x 10⁶ 셀 포인트 및 조건 (예를 들어, 3T3, Jurkat)⁹ 이전 게시 된 프로토콜 따라 서 스 펜 션 셀 문화.
   2. 필요한 경우 셀 제조업체의 지침에 따라 상용 transfection 시 약 transfect 또는 virally transduce⁸ 셀 1 일전 펄스-체이스 실험 식에 대 한 적절 한 구성.
   3. 250 x g 실 온에서 5 분 동안 50 mL 튜브에 조건 당 5 x 10⁶ 세포 pellet, 그들을 씻어 기아 미디어의 5 mL을 1 x 그들을 다시, 펠 렛 및 기아 미디어의 1 mL에 그들을 resuspend.
   4. 37 ° C 물 목욕을 셀 전송 및 10-25 분 선동 튜브 하단에 정착에서 세포를 방지 하기 위해 모든 10-15 분에 대 한 그들을 품 어.
   5. 타이머를 시작 합니다. 정확 하 게 1 분에 세포를 포함 하는 튜브에 직접 undiluted 라벨의 275 µCi (55 µCi/1 x 10⁶ 셀)을 추가 하 고 혼합 소용돌이.
      참고: 방사성 물질을 처리 하는 경우 필수적입니다 적절 한 예방 조치 및 로컬 규칙 및 우발적인 노출 및 오염 방지를 규정에 따라.
   6. 정확 하 게 11 분 체이스 미디어의 4 mL를 추가 하 여 레이블 중지 합니다. 샘플을 혼합 하 고 즉시 차가운 정지 솔루션의 9 mL를 포함 하는 얼음에 1 mL 15 mL 튜브에 전송.
      참고: 이것은 0 분 체이스 샘플입니다.
   7. 각 연속 시간 지점에 대해이 단계를 반복 합니다. 일단 모든 시간 포인트를 수집 작은 250 x g 4 ° c.에 5 분에 대 한 셀 발음 매체 (또는 단백질 분 비를 다음과 같은 경우 새로운 15 mL 튜브에 전송). 정지 솔루션의 5 mL로 세포 세척 하 고 250 x g 4 ° c.에 5 분에 대 한 셀을 펠 렛
   8. 발음 그만 솔루션, 완전히 얼음 세포의 용 해 버퍼의 300 µ L로 세포를 lyse 하 고 완전 한 세포의 용 해 되도록 얼음에 20 분 동안 그들을 품 어. 1.5 mL microcentrifuge 튜브 및 작은 핵을 4 ° C에서 15000-20000 x g 에서 10 분 원심 분리기는 lysate 전송.

2입니다. Immunoprecipitation

1. 항 체를 결합 (토론 참조) 및 immunoprecipitation 구슬 (예를 들어, 단백질 A-Sepharose)의 50 µ L (10% 중지 [v] 세포의 용 해 버퍼 + 0.25% 소 혈 청 알 부 민 [BSA])는 microcentrifuge에서 튜브 및 ~ 30 분 통에 4 ° C에서 그들을 품 어.
2. 실 온에서 12000 x g 에서 1 분 동안 구슬 펠 렛 하 고는 상쾌한 발음. 항 체-비드 혼합물에 lysate의 200 µ L을 추가 하 고는 immunoprecipitation 요구 하는 경우 1 시간 또는 머리 오버 헤드에 대 한 통에 4 ° C에서 품 어 > 1 h.
3. 실 온에서 12000 x g 에서 1 분 동안 구슬 작은 발음은 상쾌한 고 immunoprecipitation 워시 버퍼의 1 mL를 추가 합니다. 5 분 동안 실 온에서 통에 샘플을 놓습니다.
4. 2.3 단계에서 설명한 대로 구슬 작은 고 반복 세척 1 x. 그리고, 발음은 상쾌한 테 버퍼, pH 6.8 (10 mM Tris HCl, 1 mM EDTA) 20 µ L에 구슬 resuspend. 소용돌이 샘플입니다.
5. 감소 시키는 대리인 없이 샘플 버퍼 x 2의 20 µ L 추가 소용돌이, 95 ° C, 그리고 소용돌이에 5 분 동안 그것을 다시 열.
   참고: 경우에 감소 샘플 준비, 500mm DTT의 2 µ L 추가 되어야 합니다이 시점에서. 그런 다음, 2.7 단계로 진행 합니다.
6. 작은 구슬 2.3 단계에서 설명한 대로. 500 mM DTT의 1 µ L을 포함 하는 신선한 microcentrifuge 튜브에 nonreduced 상쾌한의 19 µ L를 전송, 샘플 및 소용돌이 원심 95 ° C에서 5 분 동안 그것을 다시 열 전에.
7. 12000 x g;에 1 분 샘플 다운 스핀 이것은 감소 된 샘플 이다. 실 온까지 냉각 하 고는 감소 및 nonreduced 샘플을 1 M NEM의 1.1 µ L를 추가 합니다. 소용돌이 스핀 다운 샘플.

3입니다. SDS 페이지

1. 첫째, 적절 한 SDS 페이지 해결 젤 비율 단백질에 대 한 관심의 결정 합니다. 예를 들어 에이즈-1 gp120, deglycosylated, ~ 60 kDa에 실행 하 고 7.5% 젤에서 분석 된다.
2. 제조업체의 지침에 따라 TEMED 없이 해결 젤 혼합물 준비 (% 아크릴, 375 mM Tris HCl [pH 8.8,] 0.1 %SDS [w/v], x 그리고 0.05% 암모늄 persulfate [APS] [w/v]) 및 진공에 대 한 아래 드 > 15 분. 젤 혼합 기체 제거 동안 철저 하 게 70% 에탄올과 보풀 조직 젤 유리 접시를 청소 하 고 주조 장치에 그들을 배치.
3. TEMED (0.005% [v]의 최종 농도)에서 해결 젤 혼합물에 추가 하 고 혼합 철저 하 게, 유리 접시, 겹쳐 쌓이는 젤에 대 한 ~1.5 cm 공간 사이 플라스틱. 신중 하 게 이온된 H₂O 또는 소 프로 파 놀 젤 오버레이 그리고 유해를 두고.
4. 일단 해결 젤은 생산 준비 스태킹 젤 혼합물 (4% 아크릴, 125 mM Tris HCl [pH 6.8], 0.1 %SDS [w/v], 0.025 %APS [w/v]).
5. 이온 H₂O 해결 젤의 상단을 플러시 하 고, 다음, 모든 물을 제거.
   참고: 필터 종이 사용 하 여 마지막 방울을 제거.
6. TEMED 스태킹 젤 혼합물 (0.005% [v])를 추가, 철저 하 게, 혼합 고 겹쳐 쌓이는 젤과 해결 젤 오버레이 15 잘 빗을 삽입. 겹쳐 쌓이는 젤 생산은 일단 실행 약 실에 그것을 전송 하 고 위와 더 낮은 약 실 버퍼를 실행 하는 것을 채워 (25mm Tris HCl, 글리신 192 m m [pH 8.3], 그리고 0.1 %SDS [w/v]).
7. 15-레인 minigel에서 차선 당 샘플의 10 µ L을 로드 합니다. 처음에 샘플 및 젤에 마지막 차선을 로드 하지 않도록 고 밴드의 미소를 방지 하기 위해 모든 빈 차선에서 nonreducing 샘플 버퍼를 로드 합니다. 젤에서 실행 상수 25 mA/젤 염료 전면 젤의 아래쪽에 때까지.
8. 유리 접시에서 제거 하는 젤, 단백질 얼룩 솔루션 젤 얼룩 (10% 초 산 및 H₂O + 화려한 0.25%에서 30% 메탄올 블루 R250 [w/v]) 동요와 함께 5 분, 30 분에 대 한 솔루션 (얼룩을 destaining와 destain 그리고 화려한 블루 R250 없이 솔루션).
9. 정렬 젤 플라스틱에 얼굴 다운 포장 하 고, 다음, 0.4 m m 착 색 인쇄기 종이 그들의 위에 장소. 젤 샌드위치 크로마토그래피 종이 쪽 아래로 장소를 젤에 건조 합니다. 제조업체의 지침에 따라 건조 2 h 80 ° c.에 대 한 젤
10. 카세트에 말린된 젤 전송 및 autoradiography 영화 또는 인광 체 스크린 오버레이. Autoradiography 필름을 사용 하는 경우는 어두운 방에이 단계를 수행 해야 합니다.

결과

접는 에이즈-1 gp120 부착 펄스 체이스에서의 분 비는 그림 2에 표시 됩니다. (그림에서 셀 NR) nonreducing 젤 gp120의 산화 접는 보여줍니다. 체이스 진행 되는 동안, 밴드 마이그레이션합니다 통해 젤 다운 더욱 확산 꽉 밴드 (NT)에 축적 될 때까지 (그것) 중간체를 접는 펄스 직후 확산 밴드, 젤 높은 나타납니다 5 분 (0 분 체이스) gp120의 라벨 기본적으로 접힌...

토론

펄스 추적 방법 그대로 셀에 접히는 단백질의 과학자 들의 이해를 개발 하기 위한 필수 되었습니다. 우리가 가능한 일반적인 방법을 제공 하기 위해 시도 하 고,이 이렇게 공부 접는, 전송, 그리고 단백질의 인생 셀 내부를 하는 동안 발생 하는 다양 한 프로세스를 거의 무한 한 변이 위한 잠재력이 있다.

요리에 부착 세포를 사용 하 여 펄스 체이스를 수행할 때 각 접시 같은 별...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL safeseal microcentrifuge tubes	Sarstedt	72.706.400
Acetic Acid	Sigma	A6283	glacial acetic acid
BAS Storage phosphor screen 20x25 cm	GE Life Sciences	28956475
Bromophenol Blue	Sigma	B8026	Molecular biology grade
Carestream Biomax MR films	Kodak	Z350370-50EA
Cell-culture media	Various	N/A	Normal cell culture media for specific cell-lines used
Cell-culture media, no methionine/cysteine	Various	N/A	Same media formulation as normal culture media e.g DMEM/MEM/RPMI, lacking methionine and cysteine
Charcoal filter paper	Whatman	1872047
Charcoal filtered pipette tips	Molecular bioproducts	5069B
Charcoal vacu-guard	Whatman	67221001
Coomassie Brilliant Blue R250	Sigma	112,553	for electrophoresis
Cysteine	Sigma	C7352	Molecular biology grade, Make 500 mM stock, store at -20
Dithiothreitol (DTT)	Sigma	10197777001	Molecular biology grade
EasyTag Express35S Protein Labeling Mix	Perkin Elmer	NEG772014MC	Other size batches of label are available depending on useage
EDTA	Sigma	E1644	Molecular biology grade
Gel-drying equipment	Various	N/A
Glycerol	Sigma	G5516	Molecular biology grade
Grade 3 chromatography paper	GE Life Sciences	3003-917
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)	Gibco	24020117
Kimwipes delicate task wipes	VWR	21905-026
MES	Sigma	M3671	Molecular biology grade
Methanol	Sigma	MX0490
Methionine	Sigma	M5308	Molecular biology grade, Make 250 mM stock, store at -20
Minigel casting/running equipment	Various	N/A
NaCl	Sigma	S7653	Molecular biology grade
N-ethylmaleimide	Sigma	E3876	Molecular biology grade, Make 1M stock in 100% ethanol, store at -20
PBS	Sigma	P5368	Molecular biology grade
Protein-A Sepharose fastflow beads	GE health-care	17-5280-04
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)	Sigma	L3771	Molecular biology grade
Triton X-100	Sigma	T8787	Molecular biology grade
Trizma base (Tris)	Sigma	T6066	Molecular biology grade
Typhoon IP Biomolecular imager	Amersham	29187194
Unwire Test Tube Rack 20 mm for waterbath	Nalgene	5970-0320PK