Análise de proteínas, transporte e degradação em células vivas por pulso radioativo Chase

Resumo

Aqui descrevemos um protocolo para um método de pulso-perseguição geral que permite a análise cinética de dobramento, transporte e degradação de proteínas a serem seguidos em células vivas.

Resumo

Pulso-perseguição radioativo rotulagem é uma poderosa ferramenta para estudar a maturação conformacional, o transporte para sua localização celular funcional e a degradação de proteínas do alvo em células vivas. Com curto (pulso) radioativos vezes (< 30 min) e rigidamente controlado tempos de perseguição, é possível rotular apenas uma pequena fração da piscina proteína total e siga sua dobradura. Quando combinado com os/redução electroforese do gel de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE) e imunoprecipitação com anticorpos (conformação específicos), processos de dobramento pode ser examinado em grande detalhe. Este sistema tem sido usado para analisar o dobramento de proteínas com uma enorme variação nas propriedades, tais como proteínas solúveis, proteínas transmembrana única e multi-pass, fortemente glicosilados N - e O proteínas e proteínas com e sem bissulfeto de extensivo criar laços. Pulso-perseguição métodos são a base de estudos cinéticos em uma gama de recursos adicionais, incluindo co - e modificações do posttranslational oligomerização e polimerização, essencialmente, permitindo a análise de uma proteína desde o nascimento até a morte. Estudos de pulso-perseguição no enrolamento de proteínas são complementares com outros métodos de bioquímicos e biofísicos para estudar proteínas em vitro , fornecendo informações fisiológicas e maior resolução temporal. Os métodos descritos dentro deste papel adaptam-se facilmente para estudar o dobramento de quase qualquer proteína que pode ser expressa em sistemas de mamíferos ou inseto-célula.

Introdução

A dobradura do mesmo relativamente simples proteínas envolve muitas enzimas diferentes de dobramento moleculares chaperones e modificações covalentes¹. Uma reconstituição completa destes processos em vitro é praticamente impossível, dado o vasto número de diferentes componentes envolvidos. Portanto, é altamente desejável, para estudar a proteína dobra na vivo, em células vivas. Técnicas de pulso-perseguição radioativo provam uma poderosa ferramenta para estudar a síntese, dobradura, transporte e degradação de proteínas em seu ambiente natural.

A metabólica rotulagem de proteínas durante um curto pulso com ³⁵S-rotulado metionina/cisteína, seguido de uma perseguição na ausência de um marcador radioativo, permite o acompanhamento específico de uma população de proteínas recém sintetizadas no meio de uma maior celular. Em seguida, proteínas alvo podem ser isolado através de imunoprecipitação e analisaram através de SDS-PAGE ou outras técnicas. Para muitas proteínas, sua viagem através da célula é marcada por modificações visíveis no gel de SDS-PAGE. Por exemplo, o transporte de proteínas glicosilados de retículo endoplasmático (ER) para o complexo de Golgi é muitas vezes acompanhado por modificações de N-ligados os glicanos ou a adição de O-ligados os glicanos^2,3. Essas modificações causam grandes aumentos na massa molecular aparente, que pode ser vista por alterações de mobilidade em SDS-PAGE. Maturação também pode ser marcada por clivagens proteolíticas, tais como o peptídeo sinal clivagem ou a remoção de pro-peptídeos, resultando em mudanças na massa molecular aparente que possa ser seguido facilmente em gel de SDS-PAGE⁴. Radioactividade tem consideráveis vantagens sobre técnicas comparáveis como perseguições de cicloheximida, onde síntese proteica romance é impedida, como tratamentos mais longos são tóxicos para as células e não excluem a maioria das proteínas mais velhas, de estado estacionário do análise, como algumas proteínas têm meias-vidas de dias. A comparação de proteínas sob ambos os e reduzir as condições permite a análise da formação de ligação dissulfeto, um passo importante para a dobradura de muitas proteínas secretoras^{4,5,6, 7}.

Aqui nós descrevemos um método geral para a análise de proteínas e transporte nas células intactas, usando uma abordagem de pulso-perseguição radioativo. Enquanto nós ter mirado para fornecer o método como detalhada quanto possível, o protocolo tem um potencial quase ilimitado para adaptabilidade e permitirá otimização estudar proteínas específicas de cada leitor.

São fornecidos dois protocolos alternativos de pulso-perseguição, um para as células aderentes (etapa 1.1 do protocolo aqui apresentado) e outra para células de suspensão (etapa 1.2 do protocolo aqui apresentado). As condições fornecidas aqui são suficientes para visualizar uma proteína expressada com níveis de médio a alto-expressão. Se o leitor está trabalhando com proteínas mal expressas ou várias condições pós-tratamento, como moleculas múltiplas, é necessário aumentar o tamanho do prato ou número de células adequadamente.

Para perseguição de pulso de suspensão, as amostras de perseguição em cada ponto de tempo são todos retiradas um único tubo de células. As etapas de lavagem após o pulso são omitidos; em vez disso, mais incorporação de ³⁵S é evitada pela diluição com um elevado excesso de sem rótulo de metionina e cisteína.

Os protocolos apresentados usam radioativo ³⁵S-rotulado cisteína e metionina para acompanhar os processos de enrolamento de proteínas celulares. Todas as operações com reagentes radioativos devem ser realizadas utilizando medidas de proteção adequadas para minimizar a exposição do operador e o ambiente de radiação radioativa e ser realizada em um laboratório designado. Como o pulso-chase rotulando técnica é relativamente ineficaz em momentos de pulso curto (< 15min), menos de 1% do montante inicial da radioatividade é incorporado em proteínas recém sintetizadas. Após o enriquecimento da proteína do alvo através da imunoprecipitação, a amostra para SDS-PAGE contém menos de 0,05% do montante inicial da radioactividade.

Embora a ³⁵S metionina e cisteína, mistura de rotulagem é estabilizado, uma decomposição, produzindo compostos voláteis radioactivos, ocorrerá. Para proteger o pesquisador e o aparelho, devem ser tomadas algumas precauções. O pesquisador deve sempre obedecer as regras de segurança de radiação local e pode usar um carvão enfermagem máscara, além de um jaleco e luvas (duplas). Frascos de estoque com ³⁵S metionina e cisteína sempre devem ser abertos em uma coifa, ou sob um ponto de aspiração local. Pontos de contaminação do laboratório conhecidos são centrífugas, pipetas, banhos de água, incubadoras e agitadores. A contaminação destas áreas é reduzida pelo uso de pontas de pipetas com um filtro de carvão, positivo-selo microcentrifuga tubos (ver Tabela de materiais), esponjas de aquário carvão em papéis de filtro água banhos, carvão colados nos pratos, pulso-perseguição guarda do carvão vegetal no sistema de aspiração e o posicionamento dos pratos contendo grãos de carvão em incubadoras e recipientes de armazenamento.

Protocolo

Todos os reagentes radioativos e procedimentos foram tratados em conformidade com os regulamentos e regras locais de radiação de Universidade de Utrecht.

1. pulso Chase

1. Perseguição de pulso para células aderentes
   Nota: Os volumes dados aqui baseiam-se em pratos de cultura de células de 60 mm. Para 35mm ou pratos de 100 milímetros, multiplique os volumes por 1/2 ou 2, respectivamente. Este protocolo usa um tempo de pulso de 10 min e chase vezes de 0, 15, 30, 60, 120 e 240 min. Estas podem ser variadas dependendo as proteínas específicas estudadas (discutidas abaixo).
   1. Semente células aderentes (por exemplo, HEK 293, HeLa, CHO) em seis pratos de cultura de células de 60 mm, para que eles sejam subconfluent (80-90%), no dia da perseguição pulso. Use pelo menos um prato por ponto de tempo e/ou condição.
   2. Se necessário, transfect as células com reagentes de transfecção comercialmente disponível de acordo com as instruções do fabricante; ou, Viralmente transduce⁸ células 1 dia antes do pulso-perseguição experimentarem com a construção adequada para a expressão.
   3. Lavar a louça com 2 mL de tampão de lavagem (Hank está equilibrada solução salina [HBSS]), adicione 2 mL do meio de inanição (normal meio de cultura falta de metionina e cisteína e soro bovino fetal [FBS], como meio essencial mínimo [MEM] sem metionina e cisteína Mas com 10 mM HEPES, pH 7,4) e colocar os pratos numa incubadora umidificado de 37 ° C com 5% de CO₂ por 15 min.
   4. Transferi os pratos para as prateleiras em um banho de água escaldadas 37 ° C para que eles estejam em contacto com água, mas não flutuar. Inicie um timer.
   5. Em 40 s, Aspire o meio de inanição, elaborar 600 µ l da solução de pulso (fome media + 55 prato µCi/35 milímetros rótulo, consulte a observação anterior etapa 1.1.1) dentro da pipeta e adicioná-lo suavemente para o centro do prato em exatamente 1 min. Repita este passo em intervalos de 1 min para t pratos restantes. Comece com a amostra de perseguição mais longa para economizar tempo durante seu experimento.
      Nota: Ao manusear material radioativo, é essencial seguir as precauções apropriadas e regras locais e regulamentos para prevenir exposição acidental e/ou contaminação.
   6. A exatamente 11 min e para todos os seguintes pratos, exceto para a amostra de perseguição min 0, adicionar 2 mL do meio de perseguição diretamente ao prato, Aspire- e novamente, adicionar 2 mL do meio de perseguição. Repita este passo em intervalos de 1 min para os pratos restantes. Transferi todos os pratos para uma incubadora de 37 ° C.
   7. A exatamente 16 min, adicione 2 mL do meio de perseguição (meio de cultura normal + 10 mM HEPES [pH 7,4], cisteína de 5 mM e 5 mM metionina) diretamente para o prato de amostra 0 min em cima o meio de pulso para impedir a rotulagem; em seguida, Aspire imediatamente, transferir a cápsula para uma placa de alumínio refrigerado e adicionar 2 mL de tampão de parada gelada (HBSS + 20 mM N- proteà [NEM]).
      Nota: Esta é a amostra de perseguição 0 min. Para este exemplo, vá direto ao passo 1.1.9.
   8. Cada prato de perseguição de transferência para o banho de água a 2 min antes de cada tempo de perseguição (por exemplo, 24 min. para uma perseguição de 15 min) e, no assunto exato momento (por exemplo, 26 min. para uma perseguição de 15 min), aspirar a mídia de perseguição (ou transferi-lo para um tubo de microcentrifugadora se seguindo pr secreção de otein) e transferir a cápsula para uma placa de alumínio refrigerado. Adicione 2 mL de tampão de parada gelada.
   9. Incubar os pratos no gelo no buffer de paragem para ≥ 5 min; em seguida, Aspire a solução stop e lave-a com 2 mL de solução de paragem gelada. Aspire a lavagem e lyse pratos com 600 µ l de tampão de lise (tampão fosfato salino [PBS] + detergente nondenaturing [ver Tabela de materiais] + inibidores da protease + 20 mM NEM). Use um raspador de célula para garantir que os pratos lysed quantitativamente.
   10. Transfira o lisado no tubo de 1,5 mL microcentrifuga e centrifugação por 10min a 15.000-20.000 x g e 4 ° C para os núcleos de Pelotas.
2. Perseguição de pulso para suspensão de células
   Nota: Para garantir a eficiente rotulação, células devem ser pulsadas em uma concentração de 3 x 10⁶ a 5 x 10⁶ células/mL, e volumes de perseguição devem ser 4 vezes o volume do pulso. No exemplo a seguir, nós pulsada 5 x 10⁶ células em um volume de 1 mL para 10 min, para produzir cinco chase tempo pontos (0, 15, 30, 60 e 120 min) de 1 mL, contendo 1 x 10⁶ células por ponto de tempo. Todas as soluções são as mesmas do ponto 1.1.
   1. Cultura das células de suspensão (por exemplo, 3T3, Jurkat) de acordo com um protocolo previamente publicado⁹ para que haja um número suficiente de células no momento da experiência, pelo menos, 1 x 10⁶ células por tempo apontam e/ou condição.
   2. Se necessário, transfect células com reagentes de transfecção comercialmente disponível de acordo com as instruções do fabricante, ou transduce Viralmente⁸ células 1 dia antes do pulso-perseguição experimentarem com a construção adequada para a expressão.
   3. 5 x 10⁶ células por condição em um tubo de 50 mL durante 5 min à x 250 g à temperatura de Pelotas, lavá-los 1 x 5 ml de mídia de fome, de pelotas-los novamente e ressuspendê-los em 1 mL de mídia de fome.
   4. Transferir as células para banho maria a 37 ° C e incube-os para 10-25 min. agitar os tubos de cada 10-15 min para impedir que as células fixando-se na parte inferior.
   5. Inicie o temporizador. Em exatamente 1 minuto, adicionar µCi 275 (55 µCi/1 x 10⁶ células) do rótulo não diluído diretamente para o tubo contendo células e agitar.
      Nota: Ao manusear material radioativo, é essencial seguir as precauções apropriadas e regras locais e regulamentos para prevenir exposição acidental e/ou contaminação.
   6. Exatamente 11 min, pare de rotulagem adicionando 4 mL de mídia de perseguição. Misturar a amostra e imediatamente transfira 1 mL para um tubo de 15 mL no gelo, contendo 9 mL de solução de paragem gelada.
      Nota: Esta é a amostra de perseguição 0 min.
   7. Repita essas etapas para cada ponto de tempo sucessivos. Uma vez que todos os pontos de tempo são coletados, pelota as células por 5 min a 250 x g a 4 ° C. Aspire o meio (ou transferi-lo para um novo tubo de 15 mL se você seguir a secreção de proteínas). Lavar as células com 5 mL de solução de paragem e de pelotas as células por 5 min a 250 x g a 4 ° C.
   8. Aspirar a solução stop, completamente lisar as células com 300 µ l de tampão de Lise gelada e incube-os por 20 min no gelo para garantir uma lise completa. Transfira o lisado para um tubo de 1,5 mL microcentrifuga e centrifugar durante 10 minutos a 15.000-20.000 x g a 4 ° C para os núcleos de Pelotas.

2. a imunoprecipitação

1. Combinar o anticorpo (veja a discussão) e 50 µ l de grânulos imunoprecipitação (por exemplo, a proteína um Sepharose) (suspensão de 10% [v/v] em lise + 0,25% albumina de soro bovino [BSA]) numa microcentrifuga tubo e incube-os a 4 ° C ~ 30 min em uma coqueteleira.
2. Os grânulos por 1 min a 12.000 x g , à temperatura de pelotas e aspirar o sobrenadante. Adicionar 200 µ l de lisado para a mistura de anticorpo-grânulo e incubar a 4 ° C em uma coqueteleira para 1h ou cabeça-sobrecabeça se requer a imunoprecipitação > 1 h.
3. Granule os grânulos por 1 min a 12.000 x g , à temperatura ambiente. Aspirar o sobrenadante e adicionar 1 mL de tampão de lavagem da imunoprecipitação. Coloca a amostra em um shaker em temperatura ambiente por 5 min.
4. Os grânulos de Pelotas, conforme descrito na etapa 2.3 e repita a lavagem 1X. Em seguida, aspirar o sobrenadante e ressuspender as contas em 20 µ l de tampão TE, pH 6,8 (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA). A amostra de vórtice.
5. Adicionar 20 µ l de 2x do amortecedor da amostra sem o agente redutor, vórtice, aqueça-a durante 5 min à 95 ° C e o vórtice novamente.
   Nota: se apenas preparar amostras redutoras, 2 µ l de 500 mM DTT deve ser adicionado neste ponto. Em seguida, prossiga para a etapa 2.7.
6. Conforme descrito na etapa 2.3, Granule os grânulos. Transferir a 19 µ l do sobrenadante nonreduced para um tubo de microcentrifugadora fresco contendo 1 µ l de 500 mM DTT, centrifugar a amostra e o vórtice antes aquecendo-a novamente por 5 min a 95 ° C.
7. Girar a amostra por 1 min a 12.000 x g; Esta é a amostra reduzida. Resfriá-lo até a temperatura ambiente e adicionar 1.1 µ l de 1 M, NEM para a redução e a amostra nonreduced. Vórtice e spin-down as amostras.

3. SDS-PAGE

1. Primeiro, determine a SDS-PAGE resolução gel de percentagem adequada para a proteína de interesse. Por exemplo, o HIV-1 gp120, quando deglycosylated, é executado em ~ 60 kDa e é analisado em um gel de 7,5%.
2. Prepare a mistura de gel de resolução sem TEMED de acordo com as instruções do fabricante (x % do acrilamido, 375 mM Tris-HCl [pH 8.8,] 0,1% SDS [w/v] e 0,05% persulfato de amónio [APS] [w/v]) e desgaseificar sob vácuo para > 15 min. Enquanto a mistura de gel é a desgaseificação, cuidadosamente Limpe as placas de vidro de gel com 70% de etanol e fiapos de tecidos e colocá-los em um aparelho de fundição.
3. Adicionar TEMED para a mistura de gel de resolução (em uma concentração final de 0.005% [v/v]), homogeneizar e pipetar entre placas de vidro, deixando espaço de ~1.5 cm para o gel de empilhamento. Cuidadosamente, sobrepor o gel com desionizada H₂O ou isopropanol e deixá-lo para polimerizar.
4. Uma vez que o gel de resolução tem polimerizado, preparar a mistura de gel de empilhamento (4% acrilamida, 125 mM Tris-HCl [pH 6,8], 0,1% SDS [w/v] e 0.025% APS [w/v]).
5. Lave a parte superior do gel resolvendo com desionizada H₂O e, em seguida, remova toda a água.
   Nota: Utilize papel de filtro para remover as últimas gotas.
6. Adicionar TEMED para a mistura de gel de empilhamento (0.005% [v/v]), misture bem e o gel de resolução com gel de empilhamento de sobreposição e inserir um pente 15-bem. Uma vez que o gel de empilhamento tem polimerizado, transferi-lo para uma câmara de execução e encher as câmaras superiores e inferiores com executando o tampão (25 mM Tris-HCl, glicina 192mm [pH 8.3] e 0,1% SDS [w/v]).
7. Carrega 10 µ l de amostra por lane em um minigel 15 faixas. Evitar carregar as amostras na primeira e a última pista no gel e carregar o amortecedor da amostra os em todas as faixas vazias para evitar que o sorriso de bandas. Execute o gel constante um 25 mA/gel até a frente do corante é na parte inferior do gel.
8. Retire o gel as chapas de vidro, manchar o gel com solução de proteína-coloração (ácido acético a 10% e 30% de metanol em H₂O + 0,25% brilhante azul R250 [w/v]) por 5 min com agitação e em seguida, destain por 30 min com descoloração (coloração de solução solução sem R250 azul brilhante).
9. Organize os géis de face para baixo sobre um plástico enrole e, em seguida, coloque o papel de cromatografia de 0.4 mm em cima deles. Coloque o gel de sanduíche cromatografia em papel-lado para baixo em um gel secador. Seguindo as instruções do fabricante, secar o gel para 2 h a 80 ° C.
10. Transferir os géis secos para uma gaveta e sobrepô-los com tela de cinema ou fósforo autoradiografia. Se usando a película de autoradiografia, esta etapa deve ser realizada em um quarto escuro.

Resultados

O dobramento e a secreção de HIV-1 gp120 de uma perseguição de pulso aderentes é mostrado na Figura 2. O gel os (NR de células na figura) mostra o dobramento oxidativo da gp120. Imediatamente após o pulso de rotulagem da gp120 5 min (0 min perseguição) aparece como uma banda difusa superior no gel, e no decorrer do assunto, a banda migra para baixo o gel através de ainda mais difundida dobradura intermediários (IT), até que se acumula na banda ape...

Discussão

Pulso-perseguição métodos têm sido essenciais para o desenvolvimento da compreensão dos cientistas de proteína nas células intactas de dobramento. Enquanto tentamos fornecer um método que é tão geral quanto possível, esta abordagem tem o potencial para variações quase ilimitadas estudar vários processos que ocorrem durante o dobramento, o transporte e a vida das proteínas dentro da célula.

Ao realizar uma perseguição de pulso usando células aderentes em pratos, é essencial ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL safeseal microcentrifuge tubes	Sarstedt	72.706.400
Acetic Acid	Sigma	A6283	glacial acetic acid
BAS Storage phosphor screen 20x25 cm	GE Life Sciences	28956475
Bromophenol Blue	Sigma	B8026	Molecular biology grade
Carestream Biomax MR films	Kodak	Z350370-50EA
Cell-culture media	Various	N/A	Normal cell culture media for specific cell-lines used
Cell-culture media, no methionine/cysteine	Various	N/A	Same media formulation as normal culture media e.g DMEM/MEM/RPMI, lacking methionine and cysteine
Charcoal filter paper	Whatman	1872047
Charcoal filtered pipette tips	Molecular bioproducts	5069B
Charcoal vacu-guard	Whatman	67221001
Coomassie Brilliant Blue R250	Sigma	112,553	for electrophoresis
Cysteine	Sigma	C7352	Molecular biology grade, Make 500 mM stock, store at -20
Dithiothreitol (DTT)	Sigma	10197777001	Molecular biology grade
EasyTag Express35S Protein Labeling Mix	Perkin Elmer	NEG772014MC	Other size batches of label are available depending on useage
EDTA	Sigma	E1644	Molecular biology grade
Gel-drying equipment	Various	N/A
Glycerol	Sigma	G5516	Molecular biology grade
Grade 3 chromatography paper	GE Life Sciences	3003-917
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)	Gibco	24020117
Kimwipes delicate task wipes	VWR	21905-026
MES	Sigma	M3671	Molecular biology grade
Methanol	Sigma	MX0490
Methionine	Sigma	M5308	Molecular biology grade, Make 250 mM stock, store at -20
Minigel casting/running equipment	Various	N/A
NaCl	Sigma	S7653	Molecular biology grade
N-ethylmaleimide	Sigma	E3876	Molecular biology grade, Make 1M stock in 100% ethanol, store at -20
PBS	Sigma	P5368	Molecular biology grade
Protein-A Sepharose fastflow beads	GE health-care	17-5280-04
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)	Sigma	L3771	Molecular biology grade
Triton X-100	Sigma	T8787	Molecular biology grade
Trizma base (Tris)	Sigma	T6066	Molecular biology grade
Typhoon IP Biomolecular imager	Amersham	29187194
Unwire Test Tube Rack 20 mm for waterbath	Nalgene	5970-0320PK