Analisi della piegatura della proteina, trasporto e degradazione in cellule viventi di radioattivo Pulse Chase

Riepilogo

Qui descriviamo un protocollo per un metodo generale di pulse-chase che permette l'analisi cinetica di pieghevole, trasporto e degradazione delle proteine da seguire in cellule vive.

Abstract

Impulso-insegua radioattivo etichettatura è un potente strumento per lo studio della maturazione conformazionale, il trasporto a loro posizione cellulare funzionale e la degradazione di proteine in cellule vive. Utilizzando radiolabeling tempi brevi (impulso) (< 30 min) e strettamente controllato chase volte, è possibile aggiungere etichette solo una piccola frazione della piscina della proteina totale e seguire sua pieghevole. Quando combinato con non riducente/riducendo l'elettroforesi del gel di SDS-poliacrilammide (SDS-PAGE) e immunoprecipitazione con anticorpi (conformazione-specifici), processi di piegatura può essere esaminato in dettaglio. Questo sistema è stato utilizzato per analizzare il ripiegamento di proteine con una variazione enorme in proprietà quali proteine solubili, proteine transmembrana singole e multi-pass, pesantemente N - e O-glicosil proteine e proteine con e senza bisolfuro di vasto incollaggio. Impulso-insegua metodi sono alla base di studi cinetici in una gamma di funzionalità aggiuntive, tra cui co - e modifiche di posttranslational, oligomerizzazione e polimerizzazione, essenzialmente che consente l'analisi di una proteina dalla nascita alla morte. Impulso-Insegua gli studi sul folding delle proteine sono complementari con altri metodi biochimici e biofisici per lo studio delle proteine in vitro , fornendo una maggiore risoluzione temporale e informazioni fisiologiche. I metodi come descritto all'interno di questa carta sono adattati facilmente per studiare la piegatura di quasi tutta la proteina che può essere espressa nei sistemi mammiferi o insetto-cella.

Introduzione

La piegatura delle anche relativamente semplice proteine coinvolge molti diversi enzimi pieghevoli, chaperoni molecolari e modificazioni covalenti¹. Una ricostituzione completa di questi processi in vitro è praticamente impossibile, dato il vasto numero di differenti componenti coinvolti. È altamente auspicabile, pertanto, per studiare il folding delle proteine in vivo, in cellule vive. Impulso-insegua radioattivo tecniche rivelarsi uno strumento potente per studiare la sintesi, pieghevole, trasporto e degradazione delle proteine nel loro ambiente naturale.

Il metabolica etichettatura delle proteine durante un breve impulso con ³⁵S-labeled metionina/cisteina, seguita da un inseguimento in assenza di un'etichetta radioattiva, permette il rilevamento specifico di una popolazione di proteine appena sintetizzate nel più ampio ambiente cellulare. Quindi, proteine bersaglio possono essere isolato tramite immunoprecipitazione e analizzati tramite SDS-PAGE o altre tecniche. Per molte proteine, il loro viaggio attraverso la cella è segnata da modifiche che sono visibili su gel di SDS-PAGE. Ad esempio, il trasporto di proteine glicosilate dal reticolo endoplasmatico (ER) al complesso di Golgi è spesso accompagnato da modifiche dei glycans N-collegati o l'aggiunta di glicani O-collegata^2,3. Queste modifiche causare grandi aumenti nella massa molecolare apparente, che può essere visto dai cambiamenti di mobilità in SDS-PAGE. Maturazione può anche essere contrassegnato da fenditure proteolitici, come fenditura del peptide di segnale o la rimozione di pro-peptidi, conseguente cambiamenti nella apparente massa molecolare che possono essere seguite facilmente su gel di SDS-PAGE⁴. Radioattività ha notevoli vantaggi rispetto alle tecniche comparabili come inseguimenti cicloesimmide, dove sintesi proteica romanzo è impedita, come trattamenti di lunga durata sono tossici per le cellule e non escludono la maggior parte delle proteine più vecchio, allo steady-state dalla analisi, come alcune proteine hanno emivite di giorni. Il confronto di proteine sotto entrambi non riducente e condizioni riducenti permette l'analisi della formazione di legami disolfuro, un passo importante nella piegatura di molte proteine secretorie^{4,5,6, 7}.

Qui descriviamo un metodo generale per l'analisi del protein folding e trasporto in cellule intatte, utilizzando un approccio di impulso-insegua radioattivo. Mentre abbiamo l'obiettivo di fornire il metodo come dettagliato possibile, il protocollo ha un potenziale quasi illimitato per adattabilità e permetterà di ottimizzazione studiare le proteine specifiche di ogni lettore.

Sono disponibili due protocolli alternativi pulse-chase, uno per cellule aderenti (passo 1.1 del protocollo presentato qui) e uno per cellule in sospensione (punto 1.2 del protocollo presentato qui). Le condizioni di cui qui sono sufficienti per visualizzare una proteina espressa con livelli di medio-alta espressione. Se il lettore sta lavorando con proteine mal espresse o varie condizioni dopo trattamento, quali immunoprecipitati multiple, è necessario aumentare le dimensioni del piatto o numero di cellulare in modo appropriato.

Per chase di impulso di sospensione, i campioni di chase prelevati in ogni momento sono tutti presi da un singolo tubo di cellule. Le fasi di lavaggio dopo l'impulso vengono omessi; invece, ulteriore incorporazione di ³⁵S è impedita da diluizione con un elevato eccesso di adenoida metionina e cisteina.

I protocolli presentati utilizzano radioattivo ³⁵S-labeled cisteina e metionina per seguire processi di folding delle proteine cellulari. Tutte le operazioni con i reagenti radioattivi devono essere eseguite utilizzando adeguate misure di protezione per ridurre al minimo qualsiasi esposizione dell'operatore e dell'ambiente di radiazione radioattiva ed essere eseguite in un laboratorio designato. Come la pulse-chase etichettatura tecnica è relativamente inefficiente a volte di impulso corto (< 15 min), meno di 1% dell'importo iniziale di radioattività è incorporato nelle proteine recentemente sintetizzate. Dopo l'arricchimento della proteina tramite immunoprecipitazione destinazione, il campione per SDS-PAGE contiene meno dello 0.05% della quantità iniziale di radioattività.

Anche se il ³⁵S metionina e cisteina etichettatura mix è stabilizzato, si verificherà alcune decomposizione, producendo composti radioattivi volatili. Per proteggere il ricercatore e l'apparato, dovrebbero essere prese alcune precauzioni. Il ricercatore deve sempre obbedire alle regole di sicurezza di radiazione locale e può indossare un carboncino maschera, oltre a un camice da laboratorio e guanti (doppie) di professione d'infermiera. Stock flaconcini con ³⁵S metionina e cisteina devono sempre essere aperto in una cappa, o sotto un punto di aspirazione locale. Macchie di contaminazione noto laboratorio sono centrifughe, pipette, bagni d'acqua, incubatori e agitatori. La contaminazione di queste aree è ridotto mediante l'utilizzo di puntali per pipette con un filtro al carbone, positivo-seal per microcentrifuga (Vedi Tabella materiali), Acquario carbone spugne in acqua bagni, carbone filtri di carta incollati nei piatti pulse-chase, guardia del carbone di legna nel sistema di aspirazione e il posizionamento dei piatti che contiene granelli di carbone di legna in incubatrici e contenitori di stoccaggio.

Protocollo

Tutti i reagenti radioattivi ed erano gestite conformemente alle norme e regolamenti di radiazione locali Università di Utrecht.

1. pulse Chase

1. Inseguimento di impulso per le cellule aderenti
   Nota: I volumi qui riportati sono basati su piastre di coltura cellulare di 60 mm. Per piatti di 100 mm o 35 mm, moltiplicare i volumi da 1/2 o 2, rispettivamente. Questo protocollo utilizza un tempo di impulso di 10 min e chase volte di 0, 15, 30, 60, 120 e 240 min. Questi può essere variati a seconda le proteine specifiche in fase di studio (discusse sotto).
   1. Semi di cellule aderenti (ad es., HEK 293, HeLa, CHO) in sei piastre di coltura delle cellule di mm 60 affinché siano subconfluent (80% - 90%) il giorno della caccia impulso. Utilizzare almeno un piatto al punto di tempo e/o condizione.
   2. Se necessario, transfect le cellule con i reagenti di transfezione commercialmente disponibili secondo le istruzioni del produttore; in alternativa, viralmente trasdurre⁸ cellule 1 giorno prima la pulse-chase sperimentare con il costrutto appropriato per l'espressione.
   3. Lavare i piatti con 2 mL di tampone di lavaggio (Hank equilibrata soluzione salina [HBSS]), aggiungere 2 mL di terreno di inedia (normale mezzo di coltura privo di metionina e cisteina e siero bovino fetale [FB], come minimo mezzo essenziale [MEM] senza metionina e cisteina ma con 10 mM HEPES, pH 7.4) e mettere i piatti in un incubatore 37 ° C con 5% CO₂ per 15 min.
   4. Trasferire i piatti per i rack in un bagno di acqua preriscaldata 37 ° C in modo che sono a contatto con acqua, ma non galleggiano. Avviare un timer.
   5. 40 s, aspirare il mezzo di inedia, redigere 600 µ l di soluzione di impulso (media di inedia + 55 µ ci/35 mm piatto label, vedere la nota precedente punto 1.1.1) nella pipetta e aggiungerlo delicatamente al centro del piatto in esattamente 1 minuto Ripeti questo passaggio a intervalli di 1 min per t piatti rimanenti di lui. Iniziare con il campione di inseguimento più lungo per risparmiare tempo durante l'esperimento.
      Nota: Durante la manipolazione di materiale radioattivo, è essenziale seguire le precauzioni appropriate e regolamenti per prevenire l'esposizione accidentale e/o contaminazione locale.
   6. A esattamente 11 min e per tutti i seguenti piatti, fatta eccezione per il campione di chase 0 min, aggiungere 2 mL di terreno di caccia direttamente al piatto, aspirare esso e ancora una volta, aggiungere 2 mL di terreno di caccia. Ripetere questo passaggio a intervalli di 1 min per piatti rimanenti. Trasferire tutti i piatti in un incubatore a 37 ° C.
   7. A esattamente 16 min, aggiungere 2 mL di terreno di caccia (terreno di coltura normale + 10 mM HEPES [pH 7.4], 5mm cisteina e metionina 5 mM) direttamente per il piatto di campione 0 min in cima il mezzo di impulso per interrompere etichettatura; quindi, aspirare immediatamente, trasferire il piatto su una lastra di alluminio raffreddato e aggiungere 2 mL di tampone di arresto ghiacciata (HBSS + 20 mM N- ethylmaleimide [NEM]).
      Nota: Questo è l'esempio di chase 0 min. Per questo esempio, procedere direttamente al passaggio 1.1.9.
   8. Trasferire ogni piatto chase torna a bagnomaria 2 min prima ogni chase (ad es., 24 min per un inseguimento 15 min) e, al tempo esatto chase (ad es., 26 min per un inseguimento 15 min), aspirare i media chase (o trasferirlo su un tubo del microcentrifuge se seguito pr secrezione di stabilizzati) e trasferire il piatto su una lastra di alluminio raffreddato. Aggiungere 2 mL di tampone di arresto ghiacciata.
   9. Incubare tutti i piatti sul ghiaccio nel buffer di stop per ≥ 5 min; aspirare la soluzione di arresto, quindi lavarla con 2 mL di soluzione di arresto ghiacciata. Aspirare il lavaggio e lisare piatti con 600 µ l di tampone di lisi (tampone fosfato salino [PBS] + nondenaturing detergente [vedi Tabella materiali] + inibitori della proteasi + 20mm NEM). Utilizzare un raschietto di cella per garantire che i piatti vengono lisati quantitativamente.
   10. Trasferire il lisato una provetta per microcentrifuga da 1,5 mL e centrifugare per 10 min a 15.000-20.000 x g e 4 ° C per appallottolare i nuclei.
2. Pulse Chase per cellule in sospensione
   Nota: Per garantire etichettatura efficiente, dovrebbero essere pulsate cellule ad una concentrazione di 3 x 10⁶ a 5 x 10⁶ cellule/mL e chase volumi dovrebbero essere 4 volte il volume di impulso. Nell'esempio seguente, abbiamo pulsata 5 x 10⁶ cellule in un volume di 1 mL per 10 min, a cedere cinque chase tempo punti (0, 15, 30, 60 e 120 min) da 1 mL, contenente 1 x 10⁶ cellule per punto nel tempo. Tutte le soluzioni sono le stesse della sezione 1.1.
   1. Coltura le cellule in sospensione (ad es., 3T3, Jurkat) secondo un protocollo precedentemente pubblicato⁹ in modo che vi sia un numero sufficiente di cellule al momento dell'esperimento, almeno 1 x 10⁶ cellule per tempo punto e/o condizionano.
   2. Se necessario, transfect cellule con reagenti di transfezione commercialmente disponibili secondo le istruzioni del produttore, o viralmente trasdurre⁸ cellule 1 giorno prima la pulse-chase sperimentare con il costrutto appropriato per l'espressione.
   3. A pellet di 5 x 10⁶ cellule per condizione in una provetta da 50 mL per 5 min a 250 x g a temperatura ambiente, lavarli 1 x 5 ml di media di inedia, appallottolarli nuovamente e li risospendere in 1 mL di media di inedia.
   4. Trasferire le cellule a bagnomaria a 37 ° C ed incubare li per 10-25 min. Agitare i tubi ogni 10-15 minuti per impedire le cellule di depositarsi sul fondo.
   5. Avviare il timer. A esattamente 1 min, aggiungere 275 µ ci (55 µ ci/1 x 10⁶ cellule) dell'etichetta non diluito direttamente nella provetta contenente cellule e per mescolare.
      Nota: Durante la manipolazione di materiale radioattivo, è essenziale seguire le precauzioni appropriate e regolamenti per prevenire l'esposizione accidentale e/o contaminazione locale.
   6. A esattamente 11 min, smettere di etichettatura con l'aggiunta di 4 mL di terreno di caccia. Mescolare il campione e immediatamente trasferire 1 mL in una provetta da 15 mL sul ghiaccio, contenente 9 mL di soluzione di arresto ghiacciata.
      Nota: Questo è l'esempio di chase 0 min.
   7. Ripetere questi passaggi per ogni punto di tempo successivi. Una volta sono raccolti tutti i punti di tempo, agglomerare le cellule per 5 min a 250 x g a 4 ° C. Aspirare il mezzo (o trasferirlo in una provetta da 15 mL nuovo se seguendo la secrezione della proteina). Lavare le cellule con 5 mL di soluzione di arresto e agglomerare le cellule per 5 min a 250 x g a 4 ° C.
   8. Aspirare la soluzione di arresto, completamente lisare le cellule con 300 µ l di tampone di lisi ghiacciata e li Incubare per 20 minuti sul ghiaccio per garantire una lisi completa. Trasferire il lisato una provetta per microcentrifuga da 1,5 mL e centrifugare per 10 min a 15.000-20.000 x g a 4 ° C per appallottolare i nuclei.

2. immunoprecipitazione

1. Combinare l'anticorpo (Vedi la discussione) e 50 µ l di immunoprecipitazione Perline (ad es., proteina un-Sepharose della) (10% sospensione [v/v] in tampone di lisi + 0,25% di sieroalbumina bovina [BSA]) in una microcentrifuga tube e li Incubare a 4 ° C per circa 30 min in uno shaker.
2. A pellet le perline per 1 min a 12.000 x g a temperatura ambiente e aspirare il supernatante. Aggiungere 200 µ l di lisato alla miscela dell'anticorpo-perlina e incubare a 4 ° C in un agitatore per 1 h o testa-testa-se richiede l'immunoprecipitazione > 1 h.
3. A pellet le perline per 1 min a 12.000 x g a temperatura ambiente. Aspirare il supernatante e aggiungere 1 mL di tampone di lavaggio di immunoprecipitazione. Il campione viene posto in uno shaker a temperatura ambiente per 5 min.
4. Le perline il pellet come descritto al punto 2.3 e ripetere il lavaggio 1X. Quindi, aspirare il supernatante e risospendere le sfere in 20 µ l di buffer di TE, pH 6.8 (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA). Vortexare il campione.
5. Aggiungere 20 µ l di 2x buffer del campione senza l'agente riduttore, vortice, riscaldare per 5 minuti a 95 ° C e vortexare ancora.
   Nota: se solo preparazione campioni riducentesi, 2 µ l di 500 mM DTT deve essere aggiunto a questo punto. Quindi, procedere al punto 2.7.
6. Pellet, le perle come descritto al punto 2.3. 19 µ l del surnatante nonreduced di trasferimento ad un tubo del microcentrifuge fresco contenente 1 µ l di 500 mM DTT, centrifugare il campione e vortice prima riscaldarla nuovamente per 5 min a 95 ° C.
7. Rotazione verso il basso il campione per 1 min a 12.000 x g; si tratta di campione ridotto. Raffreddare fino a temperatura ambiente e aggiungere 1,1 µ l di 1 M NEM sia ridotto e l'esempio di nonreduced. Vortex e centrifugare i campioni.

3. SDS-PAGE

1. In primo luogo, determinare l'appropriata percentuale di gel di risoluzione SDS-PAGE per la proteina di interesse. Ad esempio, gp120 di HIV-1, quando deglicosilata, corre a ~ 60 kDa ed è analizzato in un gel di 7,5%.
2. Preparare la miscela di gel di risoluzione senza TEMED secondo le istruzioni del produttore (x % di acrilammide, 375 mM Tris-HCl [pH 8.8,] 0,1% SDS [p/v] e 0.05% ammonio persolfato [APS] [p/v]) e degassare sotto vuoto per > 15 min. Mentre la miscela di gel è degasaggio, pulire le piastre di vetro di gel con etanolo al 70% e privo di lanugine tessuti e inserirli in un apparato di colata.
3. Aggiungere TEMED per la miscela di gel di risoluzione (a una concentrazione finale di 0,005% [v/v]), mescolare accuratamente e pipettare tra lastre di vetro, lasciando uno spazio di ~1.5 cm per il gel d'impilamento. Attentamente il gel con deionizzata H₂O o isopropanolo di sovrapposizione e lasciarlo a polimerizzare.
4. Una volta che il gel di risoluzione ha polimerizzato, preparare la miscela di gel di impilamento (4% di acrilammide, 125 mM Tris-HCl [pH 6.8], 0,1% SDS [p/v] e 0.025% APS [p/v]).
5. Lavare la parte superiore del gel di risoluzione con deionizzata H₂O e, successivamente, togliere tutta l'acqua.
   Nota: Utilizzare carta da filtro per rimuovere le ultime gocce.
6. Aggiungere TEMED per la miscela di gel di impilamento (0,005% [v/v]), mescolare accuratamente e il gel di risoluzione con gel d'impilamento di sovrapposizione e inserire un pettine 15-pozzo. Una volta che il gel d'impilamento ha polimerizzato, trasferirlo in una camera di esecuzione e riempire le camere superiori e inferiori con tampone di corsa (25 mM Tris-HCl, glicina 192 mM [pH 8.3] e 0,1% SDS [p/v]).
7. Caricare 10 µ l di campione per corsia in un minigel 15-lane. Evitare di caricare i campioni nella prima e l'ultima corsia sul gel e caricare il buffer del campione non riducente in tutte le corsie vuote per evitare la sorridente delle bande. Eseguire i gel al costante un 25 mA/gel, fino a quando la parte anteriore della tintura è nella parte inferiore del gel.
8. Rimuovere il gel da lastre di vetro, macchia i gel con soluzione di macchiatura della proteina (acido acetico al 10% e 30% metanolo in H₂O + 0,25% brillante blu R250 [p/v]) per 5 min con agitazione e quindi, decolorare per 30 min con soluzione (colorazione decolorante soluzione senza R250 blu brillante).
9. Organizzare i gel a faccia in giù su una plastica avvolgono e, quindi, inserire carta di cromatografia di 0,4 mm in cima loro. Collocare il panino gel cromatografia su carta-lato giù su un gel di asciugatrice. Seguendo le istruzioni del produttore, asciugare il gel per 2 ore a 80 ° C.
10. Trasferire i gel secchi su una videocassetta e le rivestirai con schermo pellicola o fosforo autoradiografia. Se si utilizza pellicola autoradiografia, questo passaggio deve essere eseguita in una stanza buia.

Risultati

La piegatura e la secrezione di gp120 di HIV-1 da un inseguimento di impulso aderente è illustrato nella Figura 2. Il gel non riducente (cellule NR nella figura) viene illustrato il folding ossidativo di gp120. Immediatamente dopo l'impulso di etichettatura di gp120 5 min (0 min chase) appare come una banda diffusa superiore nel gel, e col progredire della chase, la band migra verso il basso il gel attraverso ancora più diffusa pieghevole intermedi (IT) fin...

Discussione

Impulso-insegua metodi sono stati essenziali per sviluppare la comprensione degli scienziati del ripiegamento proteico nella cellule intatte. Mentre abbiamo cercato di fornire un metodo che è più generale possibile, questo approccio ha il potenziale per variazioni quasi illimitate di studiare i vari processi che si verificano durante la piegatura, il trasporto e la vita delle proteine all'interno della cellula.

Quando si esegue un inseguimento di impulso utilizzando cellule aderenti nei piat...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL safeseal microcentrifuge tubes	Sarstedt	72.706.400
Acetic Acid	Sigma	A6283	glacial acetic acid
BAS Storage phosphor screen 20x25 cm	GE Life Sciences	28956475
Bromophenol Blue	Sigma	B8026	Molecular biology grade
Carestream Biomax MR films	Kodak	Z350370-50EA
Cell-culture media	Various	N/A	Normal cell culture media for specific cell-lines used
Cell-culture media, no methionine/cysteine	Various	N/A	Same media formulation as normal culture media e.g DMEM/MEM/RPMI, lacking methionine and cysteine
Charcoal filter paper	Whatman	1872047
Charcoal filtered pipette tips	Molecular bioproducts	5069B
Charcoal vacu-guard	Whatman	67221001
Coomassie Brilliant Blue R250	Sigma	112,553	for electrophoresis
Cysteine	Sigma	C7352	Molecular biology grade, Make 500 mM stock, store at -20
Dithiothreitol (DTT)	Sigma	10197777001	Molecular biology grade
EasyTag Express35S Protein Labeling Mix	Perkin Elmer	NEG772014MC	Other size batches of label are available depending on useage
EDTA	Sigma	E1644	Molecular biology grade
Gel-drying equipment	Various	N/A
Glycerol	Sigma	G5516	Molecular biology grade
Grade 3 chromatography paper	GE Life Sciences	3003-917
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)	Gibco	24020117
Kimwipes delicate task wipes	VWR	21905-026
MES	Sigma	M3671	Molecular biology grade
Methanol	Sigma	MX0490
Methionine	Sigma	M5308	Molecular biology grade, Make 250 mM stock, store at -20
Minigel casting/running equipment	Various	N/A
NaCl	Sigma	S7653	Molecular biology grade
N-ethylmaleimide	Sigma	E3876	Molecular biology grade, Make 1M stock in 100% ethanol, store at -20
PBS	Sigma	P5368	Molecular biology grade
Protein-A Sepharose fastflow beads	GE health-care	17-5280-04
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)	Sigma	L3771	Molecular biology grade
Triton X-100	Sigma	T8787	Molecular biology grade
Trizma base (Tris)	Sigma	T6066	Molecular biology grade
Typhoon IP Biomolecular imager	Amersham	29187194
Unwire Test Tube Rack 20 mm for waterbath	Nalgene	5970-0320PK