ניתוח של קיפול חלבונים, תחבורה, והשפלה בתאים חיים על ידי הדופק רדיואקטיבי צ'ייס

Summary

כאן נתאר פרוטוקול עבור שיטה כללית. צ'ייס הדופק המאפשר ניתוח קינטי של קיפול, תחבורה, והשפלה של חלבונים להיות בעקבות בתאים חיים.

Abstract

תיוג רדיואקטיבי. צ'ייס הדופק הוא כלי רב עוצמה עבור הלומדים ההבשלה הסתגלותי, התעבורה מיקומם הסלולר פונקציונלי, ההשפלה של היעד חלבונים בתאים חיים. באמצעות לזמנים קצרים (פעימה) radiolabeling (< 30 דקות) ומבוקר בחוזקה פעמים צ'ייס, זה אפשרי תווית רק חלק קטן של הבריכה הכולל חלבון ולעקוב אחרי הקיפול שלה. בשילוב עם nonreducing/הפחתת מרחביות-לזיהוי בג'ל (מרחביות-עמוד), immunoprecipitation עם נוגדנים (קונפורמציה-ספציפי), קיפול תהליכים אפשר לבחון בפירוט רב. במערכת זו נעשה שימוש כדי לנתח את קיפול חלבונים עם וריאציה ענק מאפיינים כגון חלבונים מסיסים, חלבונים transmembrane יחיד, מרובה עוברים, בכבדות N O glycosylated חלבונים, חלבונים עם ובלי דיסולפידי נרחב מליטה. . צ'ייס הדופק שיטות הן הבסיס של לימודי קינטית לתוך מגוון של תכונות נוספות, לרבות co - שינויים posttranslational, oligomerization ואת פלמור, בעיקרו של דבר המאפשר הניתוח של חלבון מלידה למוות. . צ'ייס הדופק מחקרים על קיפול חלבונים הם משלימים עם שיטות אחרות הביוכימי, biophysical ללמוד חלבונים במבחנה על ידי מתן רזולוציה טמפורלית מוגברת אינפורמציה פיזיולוגית. השיטות כפי שמתואר בתוך הנייר הזה מותאמים בקלות ללמוד קיפול של כמעט כל חלבון זה יכול לבוא לידי ביטוי במערכות יונקים או חרק-cell.

Introduction

קיפול של אפילו יחסית פשוטה חלבונים כרוך השונות מתקפלים אנזימים רבים, מלווים מולקולרית ו שינויים קוולנטיות¹. שיחזור מלא של אלה תהליכים במבחנה הוא בלתי אפשרי כמעט, בהתחשב ומספר עצום של מרכיבים שונים המעורבים. לכן, רצוי מאוד, ללמוד חלבון מתקפל ויוו, בתאים חיים. טכניקות רדיואקטיבי. צ'ייס הדופק להוכיח כלי רב עוצמה עבור הלומדים את סינתזה, קיפול, תחבורה, והשפלה של חלבונים בסביבתם הטבעית.

חילוף החומרים תיוג של חלבונים במהלך דופק קצר עם ³⁵התווית על-ידי S מתיונין/ציסטאין, ואחריו מרדף בהיעדר תווית רדיואקטיבי, מאפשר מעקב מסוים של אוכלוסייה של חלבונים לאחרונה מסונתז ב חצרו הסלולר רחב יותר. לאחר מכן, חלבונים היעד יכול להיות מבודדים באמצעות immunoprecipitation, נותחו באמצעות מרחביות-עמוד או בטכניקות אחרות. חלבונים רבים, המסע שלהם דרך התא מסומן על-ידי שינויים הנראים לעין על ג'ל מרחביות-דף. לדוגמה, העברת מהחלבונים glycosylated תוך-פלזמית (ER) למתחם גולג'י לעיתים קרובות מלווה שינויים של glycans מקושרים-N או התוספת של^2,O מקושרים glycans³. שינויים אלה גורמות גדול לעלייה המסה המולקולרית לכאורה, אשר ניתן לראות על ידי ניידות שינויים בדף-מרחביות. ההבשלה יכולים גם להיות מסומנים על ידי אדמירל הפרוטאוליטי, כגון אות-פפטיד מחשוף או ההסרה של pro-פפטידים, וכתוצאה מכך שינוי המסה המולקולרית לכאורה ניתן בעקבות בקלות על ג'ל מרחביות-דף⁴. רדיואקטיביות יש יתרונות ניכר על טכניקות דומות כגון cycloheximide רודף, איפה סינתזה של חלבון הרומן מנועה, כמו טיפולי ארוך רעילים לתאים, אינה שוללת את הרוב המכריע של מבוגר, מצב יציב מהחלבונים ניתוח, כמו כמה חלבונים יש מחצית החיים של ימים. ההשוואה של חלבונים תחת שניהם nonreducing הפחתת התנאים מאפשר הניתוח של היווצרות קשר דיסולפידי, צעד חשוב בקיפול של הרבה חלבונים הפרשה^{4,5,6, 7}.

כאן אנו מתארים שיטה כללית לניתוח של קיפול חלבונים ותעבורה תאים שלמים, תוך שימוש בגישה רדיואקטיבי. צ'ייס דופק. בעוד אנחנו כיוונת לספק שיטת כמו מפורט ככל האפשר, הפרוטוקול פוטנציאלי כמעט בלתי מוגבלת של הסתגלות ויאפשר אופטימיזציה ללמוד חלבונים ספציפיים של כל קורא.

שני פרוטוקולים הדופק חלופי-צ'ייס, אחד עבור תאים חסיד (שלב 1.1 של פרוטוקול המובאת כאן) ואחד עבור השעיה תאים (שלב 1.2 של פרוטוקול המובאת כאן) הינם מסופקים. התנאים הניתנים כאן מספיקים להמחיש חלבון שבאה לידי ביטוי עם רמות בינונית-גבוהה הביטוי. אם הקורא הוא עובד עם חלבונים ביטוי לקוי או תנאים posttreatment שונים, כגון immunoprecipitations מרובות, זה הכרחי להגדיל את גודל המנה או הנייד שלי כראוי.

לצ'ייס הדופק ההשעיה, הדגימות צ'ייס שצולמו לכל נקודת זמן כל לקוחים מתוך שפופרת אחת של תאים. השלבים לשטוף אחרי הדופק מושמטים; במקום זאת, בהמשך תיאגוד ³⁵S נמנעת באמצעות דילול עם עודף גבוה של מתיונין ללא תווית, ציסטאין.

הפרוטוקולים הציג להשתמש רדיואקטיבי ³⁵התווית על-ידי S ציסטאין ומתיונין לעקוב אחר תהליכים קיפול חלבונים תאיים. כל הפעולות עם ריאגנטים רדיואקטיבי צריכה להתבצע באמצעות אמצעי הגנה מתאימים כדי למזער כל חשיפה של המפעיל לבין הסביבה לקרינה רדיואקטיבית, ניתן לבצע בתוך מעבדה ייעודית. . המרדף הדופק תיוג טכניקה הוא יעיל יחסית בזמנים קצרים הדופק (< 15 דקות), פחות מ 1% מהסכום ההתחלתי של רדיואקטיביות מעוגנת את החלבונים עתה מסונתז. לאחר העשרת של חלבון המטרה באמצעות immunoprecipitation, המדגם מרחביות-דף מכיל פחות מ- 0.05% מהסכום ההתחלתי של רדיואקטיביות.

למרות מתיונין ³⁵S של ציסטאין תיוג מיקס מתייצב, כמה ריקבון, מניב רדיואקטיבי תרכובות נדיפות, תתרחש. כדי להגן על החוקר, את המנגנון, כמה אמצעי זהירות יש לנקוט. החוקר תמיד צריך לציית? לחוקים בטיחות קרינה מקומית, ניתן ללבוש של פחם סיעוד מסכה, מלבד חלוק מעבדה וכפפות (זוגי). מניות צלוחיות עם ³⁵S מתיונין, ציסטאין תמיד אמור להיפתח בשכונה fume, או תחת נקודת שאיפה מקומיים. מעבדה ידוע זיהום שהנקודות צנטריפוגות, פיפטות, מרחצאות מים, חממות, ומנענעים. הזיהום של אזורים אלה מצטמצם באמצעות פיפטה טיפים עם מסנן פחם, צינורות microcentrifuge חיובי-חותם (ראה טבלה של חומרים), אקווריום פחם ספוגים מים אמבטיות, פחם מסנן עיתונים מודבקים את הכלים. צ'ייס דופק, פחם משמר מערכת השאיפה, ואת המיקום של מאכלים המכילים גרגרים פחם חממות, מיכלי אחסון.

Protocol

כל ריאגנטים רדיואקטיבי והתהליכים שטופלו בהתאם המקומי אוניברסיטת אוטרכט קרינה חוקים ותקנות.

1. דופק צ'ייס

1. הדופק צ'ייס על תאים חסיד
   הערה: אמצעי האחסון שניתנו כאן מבוססים על 60 מ מ תא תרבות מנות. 35 מ מ או מנות 100 מ מ, הכפילו את אמצעי האחסון ב- 1/2 או 2, בהתאמה. פרוטוקול זה משתמש זמן הדופק של פי 10 דקות וצ'ייס של 0, 15, 30, 60, 120 ו- 240 דקות. אלה יכולים להיות מגוונים בהתאם חלבונים ספציפיים הנלמדים (נדונה להלן).
   1. זרע תאים חסיד (למשל, HEK 293, הלה, צ'ו) במנות תרבות תא 60 מ מ 6, כך הם יהיו subconfluent (80% - 90%) ביום של המרדף דופק. השתמש צלחת לפחות אחת לכל נקודת זמן ו/או תנאי.
   2. אם נדרש, transfect את התאים עם ריאגנטים זמינים מסחרית תקנים בהתאם להוראות היצרן; לחלופין, לשווק מגלי⁸ התאים יום אחד לפני. צ'ייס הדופק הניסוי עם הבונה המתאים לביטוי.
   3. לשטוף את הכלים עם 2 מ של מאגר לשטוף (של האנק מאוזנת תמיסת מלח [HBSS]), להוסיף 2 מ של רעב בינוני (נורמלי תרבות בינוני חסר מתיונין, ציסטאין, סרום שור בעובר [FBS], כגון בינוני חיוני מינימלי [מ] ללא מתיונין, ציסטאין אבל עם 10 מ מ HEPES, pH 7.4), למקם את הכלים 37 ° C humidified חממה עם 5% CO₂ למשך 15 דקות.
   4. להעביר את הכלים המדפים באמבט מים prewarmed-37 ° C כך הם במגע עם מים אך לא לצוף. להפעיל טיימר.
   5. בגיל 40 s, תשאף המדיום הרעבה, ולהורות על 600 µL של פתרון הדופק (רעב מדיה + צלחת µCi/35 מ מ 55 תווית, לראות את הפתק הקודם שלב 1.1.1) אל הפיפטה ולהוסיף אותו בעדינות במרכז המנה-בדיוק 1 דק. חזור על שלב זה במרווחים 1 דקות ב- t הוא מנות הנותרים. להתחיל עם הדגימה צ'ייס הארוך כדי לחסוך זמן במהלך הניסוי שלך.
      הערה: בעת טיפול חומר רדיואקטיבי, זה חיוני לעקוב אחר הזהירות המתאימה ואת מקומי חוקים ותקנות למניעת חשיפה מקרית ו/או זיהום.
   6. -בדיוק 11 דקות ועבור כל המנות הבאות, חוץ המדגם צ'ייס 0 דקות, להוסיף 2 מ של צ'ייס בינוני ישירות לצלחת תשאף את זה, שוב, להוסיף 2 מ של צ'ייס בינוני. חזור על שלב זה במרווחים 1 דקות עבור מנות הנותרים. העברת כל המנות חממה 37 ° C.
   7. בדיוק 16 דקות, להוסיף 2 מ של צ'ייס בינוני (נורמלי תרבות בינוני + 10 מ מ HEPES [pH 7.4], 5 מ מ ציסטאין ומתיונין 5 מ מ) ישירות אל המנה מדגם 0 דקות על המדיום הדופק להפסיק תיוג; לאחר מכן, תשאף מיד, להעביר את הצלחת צלחת אלומיניום מקורר ולהוסיף 2 מ של מאגר עצירה כקרח (HBSS + 20 מ מ N- ethylmaleimide [NEM]).
      הערה: זהו המדגם צ'ייס דקות 0. עבור דוגמה זו, להמשיך היישר לשלב 1.1.9.
   8. העברת כל מנה צ'ייס בחזרה אל המים הרותחים 2 דקות לפני כל הזמן צ'ייס (למשל, מין 24 על מרדף 15 דקות), בזמן המדויק צ'ייס (למשל, 26 דקות עבור מרדף 15 דקות), תשאף התקשורת צ'ייס (או להעביר אותו צינור microcentrifuge אם בעקבות יחסי ציבור הפרשת otein) ולהעביר את הצלחת צלחת אלומיניום מקורר. להוסיף 2 מ של מאגר עצירה קר כקרח.
   9. דגירה כל המנות על הקרח במאגר עצירה ≥5 דקות; לאחר מכן, תשאף הפתרון להפסיק, לשטוף אותו עם 2 מיליליטר כקרח להפסיק פתרון. האחות לשטוף את ואת lyse מנות עם 600 µL של פירוק מאגר (באגירה פוספט תמיסת מלח [PBS] + אבקת nondenaturing [ראה טבלה של חומרים] מעכבי פרוטאז + 20 מ מ NEM). להשתמש במגרדת התא כדי להבטיח כי הכלים הם lysed באופן כמותי.
   10. להעביר את lysate 1.5 mL microcentrifuge ובשעות צנטריפוגה עבור 10 דקות ב 15,000-20,000 x g ו- 4 ° C עד הצניפה הגרעינים.
2. הדופק צ'ייס עבור תאים השעיה
   הערה: כדי להבטיח תיוג יעיל, תאים צריך להיות פעמו-ריכוז של 3 x 10⁶ 5 x 10⁶ תאים למ"ל, כרכים צ'ייס צריך להיות 4 x האחסון דופק. בדוגמה הבאה, אנחנו פעמו 5 x 10⁶ תאים נפח של 1 מ ל 10 דקות, להניב חמש צ'ייס זמן נקודות (0, 15, 30, 60 ו- 120 דקות) של 1 מ"ל, המכיל תאים⁶ עונה 1 פרק 10 לכל נקודת זמן. כל הפתרונות יהיו זהים לאלה בסעיף 1.1.
   1. התרבות התאים ההשעיה (למשל, 3T3, Jurkat) על פי פרוטוקול שפורסמו בעבר⁹ כך יש מספר מספיק של תאים בזמנו של הניסוי, לפחות עונה 1 פרק 10⁶ תאים בכל פעם הצבע ו/או תנאי.
   2. אם נדרש, transfect תאים עם ריאגנטים זמינים מסחרית תקנים על פי הוראות היצרן, או לשווק מגלי⁸ התאים יום אחד לפני. צ'ייס הדופק הניסוי עם הבונה המתאים לביטוי.
   3. גלולה 5 x 10⁶ תאים לכל תנאי בשפופרת 50 מל במשך 5 דקות ב 250 x g בטמפרטורת החדר, ותוא וקינ 1 x 5 מ של רעב מדיה, גלולה אותם שוב, ואני resuspend אותם ב 1 מ"ל של רעב מדיה.
   4. להעביר את התאים באמבט מים 37 ° C, דגירה אותם עבור 10-25 מינימלית להתסיס הצינורות כל 10-15 דקות כדי למנוע את התאים ליישוב בתחתית.
   5. התחל את הטיימר. ב בדיוק 1 דקה, להוסיף µCi 275 (55 µCi/1 x 10⁶ תאים) של תווית מדולל ישירות אל הצינור המכיל תאים ו מערבולת לערבב.
      הערה: בעת טיפול חומר רדיואקטיבי, זה חיוני לעקוב אחר הזהירות המתאימה ואת מקומי חוקים ותקנות למניעת חשיפה מקרית ו/או זיהום.
   6. בדיוק 11 דקות, הפסיק תיוג על-ידי הוספת 4 מ"ל של צ'ייס מדיה. לערבב המדגם ולהעביר מיד 1 מ"ל ל צינור 15 מ"ל בקרח, המכיל 9 מיליליטר כקרח להפסיק פתרון.
      הערה: זהו המדגם צ'ייס דקות 0.
   7. חזור על שלבים אלה עבור כל נקודת זמן רצופים. לאחר כל הזמן נקודות נאספים, גלולה את התאים עבור 5 דקות ב x 250 g ב- 4 מעלות צלזיוס. האחות המדיום (או להעביר אותו צינור 15 מ"ל אם בעקבות הפרשת חלבון). לשטוף את התאים עם 5 מיליליטר להפסיק פתרון, גלולה את התאים עבור 5 דקות ב x 250 g ב- 4 מעלות צלזיוס.
   8. האחות הפתרון להפסיק, לחלוטין lyse התאים עם 300 µL מאגר פירוק קר כקרח, דגירה אותם במשך 20 דקות על קרח כדי להבטיח פירוק מוחלט. להעביר את lysate 1.5 mL microcentrifuge ובשעות צנטריפוגה 10 דקות ב 15,000-20,000 x g ב- 4 ° C עד הצניפה הגרעינים.

2. Immunoprecipitation

1. לשלב נוגדנים (ראה את הדיון) ו- 50 µL של immunoprecipitation חרוזים (למשל, חלבון A-Sepharose) (10% השעיה [וי/v] מאגר פירוק + 0.25% אלבומין שור [BSA]) ב- microcentrifuge צינור, דגירה אותם ב 4 ° C ~ 30 דקות ב שייקר.
2. גלולה של חרוזי 1 דקות ב x 12,000 g בטמפרטורת החדר, וארוקן את תגובת שיקוע. להוסיף 200 µL של lysate התערובת נוגדן-חרוז, דגירה ב 4 ° C ב שייקר 1 h או ראש-ראש-נגמר אם דורש immunoprecipitation > 1 h.
3. גלולה של חרוזי 1 דקות ב x 12,000 g בטמפרטורת החדר. וארוקן את תגובת שיקוע והוסף 1 מ"ל immunoprecipitation שטיפת המאגר. מקם את הדגימה ב שייקר בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות.
4. גלולה החרוזים כפי שמתואר בשלב 2.3 וחזור לשטוף את 1 x. לאחר מכן, וארוקן את תגובת שיקוע, resuspend את החרוזים ב 20 µL טה מאגר, pH 6.8 (10 מ"מ טריס-HCl, 1 מ מ EDTA). מערבולת המדגם.
5. להוסיף 20 µL של 2 x דוגמת המאגר ללא הסוכן של צמצום, מערבולת, אחמם את זה למשך 5 דקות ב 95 ° C, ו מערבולת שוב.
   הערה: אם רק הכנת דוגמאות תוך צמצום, 2 µL של 500 מ מ DTT להוסיף בשלב זה. לאחר מכן, המשך לשלב 2.7.
6. גלולה החרוזים כפי שמתואר בשלב 2.3. להעביר µL 19 של תגובת שיקוע nonreduced צינור microcentrifuge טריים המכילים µL 1 של 500 מ מ DTT, centrifuge את הדגימה, ואת מערבולת בעבר חימום זה עבור 5 דקות ב 95 ° C שוב.
7. בדוגמה עבור 1 דקות ב x 12,000 g; זוהי הדוגמה מופחת. תירגע עד לטמפרטורת החדר ומוסיפים µL 1.1 של 1 מ' NEM את מופחת והן את הדגימה nonreduced. מערבולת, ספין למטה הדגימות.

3. מרחביות-דף

1. ראשית, קובעים את המתאים מרחביות-דף פתרון ג'ל אחוז עבור החלבון עניין. לדוגמה, HIV-1 gp120, כאשר deglycosylated, פועל במהירות ~ 60 kDa ומנותח ב- 7.5% ג'ל.
2. להכין לתערובת ג'ל פתרון ללא TEMED על פי הוראות היצרן (x % אקרילאמיד, 375 מ"מ טריס-HCl [pH 8.8,] מרחביות 0.1% [w/v], ו 0.05% קירור [APS] [w/v]), דגה תחת ואקום עבור > 15 דקות. בעוד התערובת ג'ל הוא degassing, ביסודיות לנקות צלחות זכוכית ג'ל עם 70% אתנול ורקמות נטולת ולמקם אותם לתוך מנגנון הליהוק.
3. הוסף TEMED לתערובת ג'ל פתרון (ב ריכוז סופי של 0.005% [וי/v]), לערבב ביסודיות, פיפטה בין לוחות זכוכית, עוזב ~1.5 ס מ מרחב הג'ל הערימה. כיסוי את הג'ל עם יונים H₂O או אלכוהול איזופרופיל ובזהירות אנו נותנים פולימריזציה.
4. ברגע הג'ל פתרון כולל polymerized, להכין לתערובת ג'ל הערימה (אקרילאמיד 4%, מ מ 125 [pH 6.8], טריס-HCl 0.1% מרחביות [w/v], 0.025% APS [w/v]).
5. ריקון העליון של הג'ל פתרון עם יונים H₂O ולהסיר, אז כל המים.
   הערה: השתמש נייר סינון כדי להסיר את הטיפות האחרונות.
6. להוסיף TEMED לתערובת ג'ל הערימה (0.005% [וי/v]), לערבב ביסודיות, ואת כיסוי הג'ל פתרון עם ג'ל הערימה והכנס מסרק 15-. טוב. ברגע הג'ל הערמה יש polymerized, להעביר אותו התא פועל ולמלא התאים העליונים והתחתונים עם הפעלת מאגר (25 מ מ טריס-HCl, גליצין 192 מ"מ [pH 8.3] ו- 0.1% מרחביות [w/v]).
7. לטעון µL 10 מדגם לכל ליין minigel 15-ליין. להימנע מטעינה את הדגימות הראשון ולא את הסמטה האחרונה הג'ל וטען המאגר מדגם nonreducing ב כל מסלולים ריקים כדי למנוע החיוכים של להקות. לפעול ג'לים-קבוע mA/ג'ל 25 עד החזית צבע היא בחלק התחתון של הג'ל.
8. הסר את ג'לים הזכוכיות, כתם של ג'לים עם פתרון מכתים חלבון (חומצה אצטית 10%-30% מתנול H₂O + 0.25% מבריק הכחול R250 [w/v]) עבור חמש דקות עם עצבנות, ולא לאחר מכן, destain במשך 30 דקות עם destaining פתרון (צביעת פתרון ללא R250 כחול מבריק).
9. לארגן ג'ל פנים כלפי מטה על פלסטיק לעטוף, אז, במקום נייר כרומטוגרפיה 0.4 מ מ מעליהם. מניחים ג'ל כריך כרומטוגרפיה הנייר-הצד למטה על גבי ג'ל מייבש. עקבתי אחרי ההוראות של היצרן, לייבש את ג'לים עבור 2 h ב- 80 מעלות צלזיוס.
10. להעביר את ג'לים מיובשים קסטה, כיסוי אותם עם מסך קולנוע או זרחן autoradiography. אם משתמש autoradiography סרט, שלב זה חייב להתבצע בחדר חשוך.

תוצאות

קיפול ואת הפרשת HIV-1 gp120 לצ'ייס הדופק חסיד מוצג באיור2. הג'ל nonreducing (תאים NR באיור) מציגה קיפול חמצוני של gp120. מיד אחרי הדופק תיוג של 5 דקות (מינימום 0 צ'ייס) gp120 שמופיע בתור להקת ' מאטום לשקוף ' גבוה יותר בג'ל ולאחר בהמשך צ'ייס, הלהקה נודד למטה הג'ל דרך אפילו יותר תופס ...

Discussion

. צ'ייס הדופק שיטות היו חיוניים לפיתוח הבנה המדענים של חלבון מתקפל לתוך תאים שלמים. ניסינו לספק שיטה זה כמו כללי ככל האפשר, גישה זו יש הפוטנציאל של וריאציות כמעט בלתי מוגבלת ללמוד תהליכים שונים המתרחשים בזמן קיפול, את התחבורה ואת החיים של חלבונים בתוך התא.

בעת ביצוע מרדף הדופ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL safeseal microcentrifuge tubes	Sarstedt	72.706.400
Acetic Acid	Sigma	A6283	glacial acetic acid
BAS Storage phosphor screen 20x25 cm	GE Life Sciences	28956475
Bromophenol Blue	Sigma	B8026	Molecular biology grade
Carestream Biomax MR films	Kodak	Z350370-50EA
Cell-culture media	Various	N/A	Normal cell culture media for specific cell-lines used
Cell-culture media, no methionine/cysteine	Various	N/A	Same media formulation as normal culture media e.g DMEM/MEM/RPMI, lacking methionine and cysteine
Charcoal filter paper	Whatman	1872047
Charcoal filtered pipette tips	Molecular bioproducts	5069B
Charcoal vacu-guard	Whatman	67221001
Coomassie Brilliant Blue R250	Sigma	112,553	for electrophoresis
Cysteine	Sigma	C7352	Molecular biology grade, Make 500 mM stock, store at -20
Dithiothreitol (DTT)	Sigma	10197777001	Molecular biology grade
EasyTag Express35S Protein Labeling Mix	Perkin Elmer	NEG772014MC	Other size batches of label are available depending on useage
EDTA	Sigma	E1644	Molecular biology grade
Gel-drying equipment	Various	N/A
Glycerol	Sigma	G5516	Molecular biology grade
Grade 3 chromatography paper	GE Life Sciences	3003-917
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)	Gibco	24020117
Kimwipes delicate task wipes	VWR	21905-026
MES	Sigma	M3671	Molecular biology grade
Methanol	Sigma	MX0490
Methionine	Sigma	M5308	Molecular biology grade, Make 250 mM stock, store at -20
Minigel casting/running equipment	Various	N/A
NaCl	Sigma	S7653	Molecular biology grade
N-ethylmaleimide	Sigma	E3876	Molecular biology grade, Make 1M stock in 100% ethanol, store at -20
PBS	Sigma	P5368	Molecular biology grade
Protein-A Sepharose fastflow beads	GE health-care	17-5280-04
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)	Sigma	L3771	Molecular biology grade
Triton X-100	Sigma	T8787	Molecular biology grade
Trizma base (Tris)	Sigma	T6066	Molecular biology grade
Typhoon IP Biomolecular imager	Amersham	29187194
Unwire Test Tube Rack 20 mm for waterbath	Nalgene	5970-0320PK