Análisis del plegamiento de la proteína, el transporte y degradación en las células vivas por pulso radiactivo Chase

Resumen

Aquí se describe un protocolo para un método de Pulso-persiga general que permite el análisis de la cinético de plegamiento, transporte y degradación de proteínas en células vivas.

Resumen

Radiactivos de Pulso-persiga el etiquetado es una poderosa herramienta para el estudio de la maduración conformacional, el transporte y su localización celular funcional, la degradación de las proteínas de la blanco en células vivas. Mediante el uso de tiempos radiolabeling cortos (pulso) (< 30 min) y firmemente controlada por tiempos de persecución, es posible que sólo una pequeña fracción de la piscina de la proteína total de la etiqueta y seguir su plegamiento. Cuando se combina con nonreducing, reduciendo electroforesis del gel de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE) y la inmunoprecipitación con anticuerpos (específicos de conformación), procesos de plegamiento puede examinarse con gran detalle. Este sistema se ha utilizado para analizar el plegado de proteínas con una gran variación de propiedades como proteínas solubles, proteínas transmembranales únicas y de multipaso, pesadamente proteínas N - y O-glicosiladas y proteínas con y sin extenso disulfuro de la vinculación. Pulso-persiga los métodos son la base de estudios cinéticos en una gama de características adicionales, incluyendo co - modificaciones del posttranslational, Oligomerización y polimerización, esencialmente, lo que permite el análisis de una proteína desde el nacimiento hasta la muerte. Pulso-persiga los estudios en el plegamiento de la proteína son complementarios con otros métodos bioquímicos y biofísicos para el estudio de proteínas en vitro proporcionando información fisiológica y mayor resolución temporal. Los métodos como se describe en este artículo se adaptan fácilmente para estudiar el plegamiento de casi cualquier proteína que puede expresarse en sistemas mamíferos o insectos-cell.

Introducción

El plegamiento de incluso relativamente simple de las proteínas consiste en muchas diversas enzimas plegables chaperones moleculares y modificaciones covalentes¹. Una reconstitución completa de estos procesos en vitro es prácticamente imposible, dado el gran número de diferentes componentes involucrados. Es altamente deseable, por lo tanto, estudiar la proteína plegable en vivo, en células vivas. Técnicas radiactivas Pulso-persiga probar una herramienta poderosa para el estudio de la síntesis, plegable, transporte y degradación de proteínas en su ambiente natural.

El metabólico etiquetado de proteínas durante un pulso corto con ³⁵S-labeled metionina/cisteína, seguido de una persecución en la ausencia de una etiqueta radiactiva, permite el seguimiento específico de una población de proteínas recién sintetizadas en el más amplio medio celular. Luego, las proteínas blanco pueden ser aislada mediante inmunoprecipitación y analizan por SDS-PAGE u otras técnicas. Para muchas proteínas, su viaje a través de la célula se caracteriza por modificaciones visibles en gel de SDS-PAGE. Por ejemplo, el transporte de proteínas glicosiladas desde el retículo endoplásmico (ER) del complejo de Golgi es acompañado a menudo por modificaciones de glycans N-ligados o la adición de O-linked glycans^2,3. Estas modificaciones provocan grandes aumentos en la masa molecular aparente, que puede verse por los cambios de movilidad en SDS-PAGE. Maduración también puede ser marcada por las divisiones proteolíticas, tales como péptido señal escote o la eliminación de pro-péptidos, dando por resultado cambios en la masa molecular aparente que puede seguirse fácilmente en gel de SDS-PAGE⁴. Radiactividad tiene considerables ventajas sobre técnicas comparables como persecuciones de cicloheximida, donde se impide la síntesis de nuevas proteínas, como tratamientos más largos son tóxicos para las células y no excluyen a la mayoría de las proteínas mayores, estado de la Análisis, como algunas proteínas tienen vidas medias de días. La comparación de proteínas en ambos nonreducing y reducción de condiciones permite el análisis de la formación del enlace de disulfuro, un paso importante en el plegamiento de las proteínas secretoras muchos de^{4,5,6, 7}.

Aquí describimos un método general para el análisis del plegamiento de la proteína y el transporte en las células intactas, utilizando un enfoque de Pulso-persiga radiactivos. Mientras que nos hemos dirigido para proporcionar el método detallado como sea posible, el protocolo tiene un potencial casi ilimitado para la adaptabilidad y permitirá la optimización para el estudio de proteínas específicas de cada lector.

Se proporcionan dos protocolos alternativos Pulso-persiga, para células adherentes (paso 1.1 del protocolo presentado aquí) y las células de suspensión (paso 1.2 del protocolo presentado aquí). Las condiciones proporcionan aquí son suficientes para visualizar una proteína expresada con niveles de media a alta expresión. Si el lector está trabajando con proteínas mal expresadas o varias condiciones posttreatment, tales como múltiples immunoprecipitations, es necesario aumentar el tamaño del plato o número de células adecuado.

Para la persecución de pulso de suspensión, las muestras de chase tomadas en cada momento se toman de un solo tubo de células. Los pasos de lavado después de que el pulso se omiten; en cambio, más incorporación de ³⁵S es prevenida por dilución con un alto exceso de cisteína y metionina sin etiqueta.

Los protocolos presentados usan radiactivos ³⁵S etiquetado cisteina y metionina para seguir procesos de plegamiento de proteínas celulares. Todas las operaciones con reactivos radiactivos deben realizarse utilizando medidas de protección adecuadas para reducir al mínimo cualquier exposición del operador y el medio ambiente a la radiación radiactiva y realizarse en un laboratorio designado. Pulso-persiga etiquetado técnica es relativamente ineficaz en tiempos de pulso corto (< 15 min), menos del 1% de la cantidad a partir de la radiactividad se incorpora en las proteínas recién sintetizadas. Después el enriquecimiento de la proteína mediante inmunoprecipitación de blanco, la muestra para SDS-PAGE contiene menos de 0.05% de la cantidad inicial de radiactividad.

Aunque los ³⁵S metionina y cisteína etiquetado mezcla se estabiliza, se producirá cierta descomposición, produciendo compuestos radiactivos. Para proteger el investigador y el aparato, se deben tomar algunas precauciones. El investigador siempre debe obedecer a las normas de seguridad de radiación local y puede llevar carbón y una máscara, además de una bata de laboratorio y guantes (doble) de enfermería. Los frascos de stock con ³⁵S metionina y cisteína siempre deben abrirse en una campana de humos, o bajo un punto de aspiración local. Puntos de contaminación de laboratorio conocidas son centrífugas, pipetas, baños, incubadoras y agitadores. La contaminación de estas áreas se reduce mediante el uso de puntas de pipeta con filtro de carbón, tubos de microcentrífuga de sello positivo (véase Tabla de materiales), esponjas de carbón de acuario de agua baños, carbón filtro papeles pegados en los platos de Pulso-persiga, protector de carbón en el sistema de aspiración y la colocación de platos que contienen carbón granos en incubadoras y recipientes de almacenamiento.

Protocolo

Todos los procedimientos y reactivos radiactivos se manejaron con arreglo a las normas y reglas locales de radiación de la Universidad de Utrecht.

1. pulso Chase

1. Pulso Chase para células adherentes
   Nota: Los volúmenes dados aquí se basan en platos de cultivo celular 60 mm. Para 35 mm o 100 mm platos, multiplicar los volúmenes por 1/2 o 2, respectivamente. Este protocolo utiliza un tiempo de pulso de tiempos de 0, 15, 30, 60, 120 y 240 min 10 min y chase. Estos pueden variar dependiendo de las proteínas específicas estudiadas (discutidas abajo).
   1. Las células adherentes (por ejemplo, HEK 293, HeLa, CHO) de la semilla en seis platos de cultura de célula de 60 mm para que sean subconfluent (80% - 90%) en el día de la persecución del pulso. Utilice al menos uno de los platos por momento y condición.
   2. Si es necesario, transfectar las células con reactivos de transfección comercialmente disponibles según las instrucciones del fabricante; o virus transduce⁸ las células 1 día antes del pulso-persiga experimentan con la estructura adecuada para la expresión.
   3. Lavar los platos con 2 mL de tampón de lavado (Hank equilibrada solución de sal [HBSS]), agregar 2 mL de medio de hambre (normal medio de cultivo carece de metionina y cisteína y suero bovino fetal [SBF], como medio esencial mínimo [MEM] sin metionina y cisteína pero con 10 mM HEPES, pH 7,4) y colocar los platos en una incubadora humidificada de 37 ° C con 5% CO₂ durante 15 minutos.
   4. Transferir los platos a las barras en un baño de agua precalentado 37 ° C para que estén en contacto con agua, pero no flotar. Iniciar un temporizador.
   5. A los 40 s, aspirar el medio de la inanición, elaborar 600 μl de solución de pulso (hambre media + 55 plato μCi/35 mm etiqueta, véase la nota anterior paso 1.1.1) con la pipeta y agregarla suavemente al centro del plato en exactamente 1 minuto repetir este paso en intervalos de 1 minuto para t platos restantes. Comience con la mayor muestra de chase para ahorrar tiempo durante el experimento.
      Nota: Cuando se maneja material radioactivo, es esencial seguir las precauciones apropiadas y normas y regulaciones locales para prevenir la exposición accidental y contaminación.
   6. En exactamente 11 minutos para todos los platos siguientes, excepto la muestra de la persecución de 0 min, agregar 2 mL de medio de chase directamente al plato, aspirarlo y otra vez, añadir 2 mL de medio de chase. Repetir a intervalos de 1 minuto para platos restantes. Transferir todos los platos a una incubadora de 37 ° C.
   7. Exactamente 16 min, agregar 2 mL de medio de chase (medio de cultivo normal + 10 mM HEPES [pH 7.4], 5 mM cisteína y metionina de 5 mM) directamente en el plato de muestra de 0 min encima medio pulso deje de etiquetado; Luego, aspirar inmediatamente, transferir el plato a una placa de aluminio refrigerado por y añadir 2 mL de tampón de helada parada (HBSS + 20 mM N- etilmaleimida [NEM]).
      Nota: Esta es la muestra de la persecución de 0 min. Para esta muestra, proceder directamente a paso 1.1.9.
   8. Transferir cada plato de chase a baño María 2 min antes de cada tiempo de persecución (p. ej., 24 min para una persecución de 15 min) y, en el momento de la persecución exacta (por ejemplo, 26 min para una persecución de 15 min), aspirar los medios de comunicación de chase (o transferir a un tubo de microcentrífuga si pr otein secreción) y el plato se transfieren a una placa de aluminio refrigerado. Añadir 2 mL de helado Tope amortizante.
   9. Incubar todos los platos en el hielo en el Tope amortizante de ≥5 min; Luego, aspirar la solución y lavar con 2 mL de solución de parada fría. Aspire el lavado y lyse platos con 600 μl de tampón de lisis (tampón fosfato salino [PBS] + nondenaturing detergente [véase Tabla de materiales] inhibidores de la proteasa + 20 mM NEM). Use un raspador celular para asegurar que los platos son lisis cuantitativo.
   10. Transferir el lisado a un tubo de microcentrífuga de 1.5 mL y centrifugar durante 10 min a 15.000-20.000 x g y 4 ° C para que sedimenten los núcleos.
2. Persecución de pulso para la suspensión de las células
   Nota: Para garantizar un etiquetado eficaz, deben ser pulsadas células a una concentración de 3 x 10⁶ a 5 x 10⁶ células/mL y volúmenes de persecución deben ser 4 x el volumen de pulso. En el siguiente ejemplo, hemos pulsado 5 x 10⁶ células en un volumen de 1 mL por 10 min, para producir cinco perseguir tiempo puntos (0, 15, 30, 60 y 120 min) de 1 mL, que contiene 1 x 10⁶ células por momento. Todas las soluciones son las mismas que en la sección 1.1.
   1. Las células de suspensión (p. ej., 3T3, Jurkat) según un protocolo previamente publicados⁹ la cultura por lo que hay un número suficiente de células en el momento del experimento, por lo menos 1 x 10⁶ células por tiempo punto o condición.
   2. Si es necesario, transfectar las células con reactivos de transfección comercialmente disponibles según las instrucciones del fabricante, o virus transduce⁸ las células 1 día antes del pulso-persiga experimentan con la estructura adecuada para la expresión.
   3. 5 x 10⁶ células por condición en un tubo de 50 mL por 5 min a x 250 g a temperatura ambiente de la pelotilla, lavar 1 x con 5 mL de medio de hambre, otra vez de los pellets y resuspender en 1 mL de medio de hambre.
   4. Transferir las células a un baño de agua de 37 ° C e incubarlos de 10-25 minutos agitar los tubos cada 10-15 minutos para evitar que las células de colocar en la parte inferior.
   5. Iniciar el temporizador. En exactamente 1 minuto, añada 275 μCi (55 μCi/1 x 10⁶ células) de etiqueta sin diluir directamente en el tubo que contiene las células y agitar para mezclar.
      Nota: Cuando se maneja material radioactivo, es esencial seguir las precauciones apropiadas y normas y regulaciones locales para prevenir la exposición accidental y contaminación.
   6. En exactamente 11 minutos, parada de etiquetado añadiendo 4 mL de medio de chase. Mezcle la muestra e inmediatamente transferir 1 mL a un tubo de 15 mL en hielo, que contiene 9 mL de solución de parada fría.
      Nota: Esta es la muestra de la persecución de 0 min.
   7. Repita estos pasos para cada punto de tiempo sucesivos. Una vez recopilados todos los puntos de tiempo, sedimenten las células durante 5 minutos a 250 x g a 4 ° C. Aspire el medio (o transferir a un nuevo tubo de 15 mL si después de la secreción de la proteína). Lavar las células con 5 mL de solución de parada y sedimenten las células durante 5 minutos a 250 x g a 4 ° C.
   8. Aspire la solución de parada, totalmente lyse las células con 300 μL de tampón de lisis helada e incubar por 20 min en hielo para garantizar una lisis completa. Transferir el lisado a un tubo de microcentrífuga de 1.5 mL y centrifugar durante 10 min a 15.000-20.000 x g a 4 ° C para que sedimenten los núcleos.

2. inmunoprecipitación

1. Combina el anticuerpo (véase la discusión) y 50 μl de inmunoprecipitación granos (p. ej., proteína A-sefarosa) (10% suspensión [v/v] en tampón de lisis + 0.25% albúmina de suero bovino [BSA]) en una microcentrífuga tubo e incubar a 4 ° C por 30 min en una coctelera Boston.
2. Los granos durante 1 min a 12.000 x g a temperatura ambiente de la pelotilla y aspirar el sobrenadante. Añadir 200 μL de lisado a la mezcla de grano de anticuerpo e incubar a 4 ° C en un agitador de 1 h o cabeza sobre cabeza si requiere la inmunoprecipitación > 1 h.
3. De pellets los granos durante 1 min a 12.000 x g a temperatura ambiente. Aspirar el sobrenadante y agregar 1 mL de tampón de lavado de inmunoprecipitación. Colocar la muestra en un agitador a temperatura ambiente durante 5 minutos.
4. Los granos de la pelotilla como se describe en el paso 2.3 y repetir el lavado 1 x. A continuación, aspirar el sobrenadante y resuspender las cuentas en 20 μl de tampón TE pH 6.8 (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA). Vórtice de la muestra.
5. Añadir 20 μl de 2 x de buffer de muestra sin el agente de reducción, vortex, calentar por 5 min a 95 ° C y agitar nuevamente.
   Nota: Si sólo preparar muestras reductoras, 2 μl de 500 mM DTT se debe agregar en este punto. A continuación, proceda al paso 2.7.
6. Como se describe en el paso 2.3 de pellets los granos. Transferencia de 19 μl del sobrenadante nonreduced a un tubo de microcentrífuga fresco que contiene 1 μl de 500 mM DTT, centrifugar la muestra y vortex antes de calentar por 5 min a 95 ° C nuevamente.
7. Desactivación de la muestra durante 1 min a 12.000 x g; se trata de la muestra reducida. Enfriar a temperatura ambiente y añadir 1,1 μl de 1 M NEM a la reducción y la muestra nonreduced. Vórtice y giro de las muestras.

3. SDS-PAGE

1. En primer lugar, determinar el apropiado SDS-PAGE resolución gel porcentaje de la proteína de interés. Por ejemplo, HIV-1 gp120, cuando deglycosylated, a ~ 60 kDa y se analiza en un gel de 7,5%.
2. Preparar la mezcla de gel de resolución sin TEMED según las instrucciones del fabricante (x % acrilamida, 375 mM Tris-HCl [pH 8.8,] SDS 0.1% [p/v] y 0.05% persulfato de amonio [APS] [w/v]) y desgasificación bajo vacío para > 15 minutos. Mientras que la desgasificación de la mezcla de gel, bien limpiar las placas de vidrio gel con etanol al 70% y los tejidos libres de pelusas y colocarlos en un aparato de fundición.
3. Añadir TEMED a la mezcla de gel de resolución (en una concentración final de 0.005% [v/v]), homogeneizar y pipeta entre placas de vidrio, dejando de ~1.5 cm para el gel de apilamiento. Cuidadosamente el gel con desionizada H₂O o isopropanol del recubrimiento y dejar polimerizar.
4. Una vez que el gel de resolución ha polimerizado, preparar la mezcla de gel de apilamiento (4% de acrilamida, 125 mM Tris-HCl [pH 6.8], SDS 0.1% [p/v] y 0.025% APS [p/v]).
5. Lave la parte superior del gel de resolución con desionizada H₂O y, a continuación, quitar toda el agua.
   Nota: Utilice papel de filtro para eliminar las últimas gotas.
6. Añadir TEMED a la mezcla de gel de apilamiento (0,005% [v/v]), mezclar bien y el gel de resolución con el gel de apilamiento del recubrimiento e inserte un peine de 15 pozos. Una vez que ha polimerizado el gel de apilamiento, traslado a una cámara de ejecución y llenar las cámaras superiores e inferiores con el almacenador intermediario de funcionamiento (25 mM Tris-HCl, glicina 192 mM [pH 8.3] y 0.1% SDS [p/v]).
7. Cargar 10 μl de muestra por carril en un minigel de 15 carriles. Evitar cargar las muestras en el primer y el último carril en el gel y el tampón de muestra nonreducing en todos los carriles vacíos para evitar que la sonrisa de bandas de carga. Corren los geles constante 25 mA/gel hasta el frente de tinte es en la parte inferior del gel.
8. Retire el gel de las placas de vidrio, teñir los geles con solución de tinción de proteínas (10% de ácido acético y metanol 30% H₂O + brillante 0.25% azul R250 [w/v]) durante 5 minutos con agitación y luego, desmanchar por 30 min con extracción (coloración de la solución solución sin R250 azul brillante).
9. Organizar los geles boca abajo sobre un plástico abrigo y, luego, coloque papel de cromatografía de 0.4m m encima de ellos. Ponga el gel sandwich cromatografía en papel-lado abajo en un gel secador. Siguiendo las instrucciones del fabricante, secar los geles por 2 h a 80 ° C.
10. Transferir los geles secos en una casete y recubrimiento con pantalla de cine o fósforo de autorradiografía. Si usan la película de autorradiografía, este paso debe realizarse en un cuarto oscuro.

Resultados

El plegamiento y la secreción de la gp120 del VIH-1 de una persecución de pulso adherente se muestra en la figura 2. El gel nonreducing (Nº de células en la figura) muestra el plegamiento oxidativo de gp120. Inmediatamente después del pulso de etiquetado de gp120 de 5 min (min 0 chase) aparece como una banda difusa en el gel, y conforme avanza la persecución, la banda migra por el gel a través de la aún más difundida plegamiento intermedios (IT) hast...

Discusión

Pulso-persiga métodos han sido esenciales para el desarrollo de la comprensión de los científicos del plegamiento en las células intactas de la proteína. Mientras que hemos intentado ofrecer un método que es tan general como sea posible, este enfoque tiene el potencial de las variaciones casi ilimitadas estudiar varios procesos que ocurren durante el plegamiento, el transporte y la vida de las proteínas dentro de la célula.

Cuando se realiza una persecución de pulso utilizando célula...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL safeseal microcentrifuge tubes	Sarstedt	72.706.400
Acetic Acid	Sigma	A6283	glacial acetic acid
BAS Storage phosphor screen 20x25 cm	GE Life Sciences	28956475
Bromophenol Blue	Sigma	B8026	Molecular biology grade
Carestream Biomax MR films	Kodak	Z350370-50EA
Cell-culture media	Various	N/A	Normal cell culture media for specific cell-lines used
Cell-culture media, no methionine/cysteine	Various	N/A	Same media formulation as normal culture media e.g DMEM/MEM/RPMI, lacking methionine and cysteine
Charcoal filter paper	Whatman	1872047
Charcoal filtered pipette tips	Molecular bioproducts	5069B
Charcoal vacu-guard	Whatman	67221001
Coomassie Brilliant Blue R250	Sigma	112,553	for electrophoresis
Cysteine	Sigma	C7352	Molecular biology grade, Make 500 mM stock, store at -20
Dithiothreitol (DTT)	Sigma	10197777001	Molecular biology grade
EasyTag Express35S Protein Labeling Mix	Perkin Elmer	NEG772014MC	Other size batches of label are available depending on useage
EDTA	Sigma	E1644	Molecular biology grade
Gel-drying equipment	Various	N/A
Glycerol	Sigma	G5516	Molecular biology grade
Grade 3 chromatography paper	GE Life Sciences	3003-917
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)	Gibco	24020117
Kimwipes delicate task wipes	VWR	21905-026
MES	Sigma	M3671	Molecular biology grade
Methanol	Sigma	MX0490
Methionine	Sigma	M5308	Molecular biology grade, Make 250 mM stock, store at -20
Minigel casting/running equipment	Various	N/A
NaCl	Sigma	S7653	Molecular biology grade
N-ethylmaleimide	Sigma	E3876	Molecular biology grade, Make 1M stock in 100% ethanol, store at -20
PBS	Sigma	P5368	Molecular biology grade
Protein-A Sepharose fastflow beads	GE health-care	17-5280-04
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)	Sigma	L3771	Molecular biology grade
Triton X-100	Sigma	T8787	Molecular biology grade
Trizma base (Tris)	Sigma	T6066	Molecular biology grade
Typhoon IP Biomolecular imager	Amersham	29187194
Unwire Test Tube Rack 20 mm for waterbath	Nalgene	5970-0320PK