قياس شكل وحجم الجسيمات للحماه معطلة في أجار مع أنبوب لبرمجيات مصدر المفتوح

Summary

حجم وشكل جزيئات في للحماه هي المعالم الهامة التي يتم قياسها باستخدام أساليب مختلفة. تنشأ أخطاء من العينات غير ممثلة، والصور دون المستوى الأمثل، والمعلمات تحليل ذاتي. لتقليل هذه الأخطاء وسهولة قياس، نقدم بروتوكول تحديد كل خطوة من خطوات، بما في ذلك أنبوب لبرمجيات مصدر مفتوح.

Abstract

المفاعلات الحيوية التجريبية، مثل تلك معالجة المياه المستعملة، وتحتوي على جزيئات الشكل والحجم الذي يتم المعالم الهامة. على سبيل المثال، حجم وشكل من فلكس للحماه يمكن الإشارة إلى الظروف السائدة في عبارة، وتؤثر أيضا بصورة مباشرة جيدا كيف يستقر الحمأة في انارات.

حجم الجسيمات والشكل قياسات شكل مضلل 'بسيطة' على حد سواء. العديد من القضايا الدقيقة، كثيرا ما لا تعالج في البروتوكولات غير رسمية، يمكن أن تنشأ عند أخذ العينات، والتصوير، وتحليل الجزيئات. طرق أخذ العينات قد تكون متحيزة أو لا توفر ما يكفي من القوة الإحصائية. قد يتم حفظ سيئة العينات أنفسهم أو الخضوع للتعديل أثناء التثبيت. قد لا تكون الصور ذات جودة كافية؛ تداخل الجسيمات، عمق الميدان ومستوى التكبير، والضوضاء المختلفة يمكن أن جميع نتائج الفقراء. يمكن إدخال التحليل المحدد سيئة التحيز، مثل تلك التي تنتجها العتبة صورة اليدوي وتجزئة.

ومن المستصوب جنبا إلى جنب مع إمكانية تكرار نتائج القدرة على تحمل التكاليف والإنتاجية. طريقة إنتاجية عالية بأسعار معقولة، ويمكن قياس الجسيمات أكثر تواترا، إنتاج العديد من الصور التي تحتوي على الآلاف من الجسيمات. يسمح أسلوب يستخدم الكواشف غير مكلفة ومجهر تشريح المشتركة وبرمجيات المصدر المفتوح متاحة بحرية لتحليل النتائج التجريبية قابلة للتكرار وموجودا واستنساخه، ومؤتمته جزئيا. علاوة على ذلك، يمكن أن تكون نتاج لمثل هذا الأسلوب مهيأ جيدا ومحددة تحديداً جيدا وفهمها بسهولة من قبل برامج تحليل البيانات، تخفيف داخل مختبر التحليلات والبيانات تبادل بين مختبرات.

هذا بروتوكول بالتفصيل الخطوات اللازمة لإنتاج هذه منتجات، بما في ذلك: أخذ العينات، وعينه من الإعداد والتثبيت في أجار، والحصول على الصور الرقمية، وتحليل الصور الرقمية، وأمثلة لتوليد الشكل الخاصة بالتجربة من نتائج التحليل. كما أدرجنا أنبوب تحليل بيانات المصدر المفتوح لدعم هذا البروتوكول.

Introduction

والغرض من هذا الأسلوب لتوفير أسلوب محددة جيدا وقابلة للتكرار، ومؤتمته جزئيا لتحديد حجم وشكل توزيعات الجسيمات في المفاعلات الحيوية، لا سيما تلك التي تحتوي على فلكس للحماه وحبيبات الهوائي^{1 , 2}-الأساس المنطقي وراء هذا الأسلوب زيادة في القدرة على تحمل التكاليف، والبساطة، والإنتاجية، والتكرار لدينا القائمة بروتوكولات داخلية^3،4، سهولة قياس الجسيمات للآخرين، وتيسير تبادل و مقارنة البيانات.

وهناك فئتين عريضتين من التحليل قياس الجسيمات-أساليب التصوير مباشرة واستنتاجي باستخدام مثل هذه الصفات تشتت الضوء⁵. على الرغم من أن أساليب استنتاجي يمكن أن يكون آليا وإنتاجية كبيرة، المعدات مكلفة. وباﻹضافة إلى ذلك، بينما يمكن تحديد أساليب استنتاجي بدقة ما يعادل حجم الجسيمات⁶، أنها لا توفر معلومات مفصلة الشكل⁷.

بسبب الحاجة إلى بيانات الشكل، ونحن قد أسلوبنا على أساس التصوير مباشرة. على الرغم من وجود بعض أساليب التصوير الفائق، أنها عادة تتطلب الأجهزة التجارية باهظة الثمن أو الحلول التي بنيت^8،9. وقد وضعت أسلوبنا لتوظيف الأجهزة المشتركة بأسعار معقولة والبرامج التي، على الرغم من أن الذين يعانون من انخفاض في الإنتاجية، وتنتج الصور الجسيمات أكثر بكثير من الحد الأدنى المطلوب للعديد من التحليلات¹⁰.

قد لا تحدد البروتوكولات القائمة أهمية أخذ العينات وخطوات الحصول على الصورة. بروتوكولات أخرى قد تحدد الخطوات اليدوية إدخال تحيز شخصي (مثل مستوى العتبة المخصصة¹¹). سيتم تعزيز أسلوب المعالم التي تحدد خطوات الحصول على العينات، والتثبيت وصورة جنبا إلى جنب مع برامج التحليل متاحة بحرية داخل مختبر تحليل الصور والمقارنات بين مختبرات. أحد الأهداف رئيسية من هذا البروتوكول هو توفير سير عمل والأدوات التي ينبغي أن تؤدي إلى النتائج استنساخه من مختبرات مختلفة لنفس العينة.

وبصرف النظر عن تطبيع عملية تحليل الصورة، البيانات التي تنتجها هذه الأنابيب يتم تسجيلها في ملف محددة تحديداً جيدا ومنسقة جيدا¹² مناسبة للاستخدام بشعبية بيانات تحليل الحزم^13،14، تخفيف التجربة تحليلات محددة (مثل توليد الرقم المخصص) وتيسير تبادل بين مختبرات البيانات.

ويقترح هذا البروتوكول وبخاصة للباحثين الذين تتطلب بيانات الشكل الجسيمات، ولا يستطيعون الوصول إلى أساليب استنتاجي، لا ترغب في وضع خط أنابيب تحليل الصور الخاصة بهم، وترغب في تبادل البيانات بسهولة مع الآخرين

Protocol

1-جمع عينات لتحليل الجسيمات

1. تحديد حجم العينة للمفاعلات المحددة التي سوف تنتج جسيمات كافية للتحليل الإحصائي¹⁰ (> 500) مع تجنب تداخل الجسيمات.
   1. تفترض أن طائفة من 0.5 إلى 2 مل كل عينة الخمور المختلطة غير كافية لعينات للحماه مع الخمور مختلطة تعليق المواد صلبة (مهنيين) بين 250 و 5,000 مغ/لتر.
   2. وبخلاف ذلك، إعداد ثلاث لوحات أجار اختبار باستخدام 0.5 و 2 و 5 مل من العينة (الخطوات 1، 2 عن طريق 2.7).
   3. تقدير بصريا الذي (أن وجدت) حجم العينة أفضل تلبية المعايير المذكورة في الخطوة 1، 1.
   4. إذا كان لا يزال تداخل جزيئات العينة 0.5 مل، كرر الخطوات من 1.1.2 و 1.1.3 مع عينات 0.5 مل ثلاثة إضعاف مع إضافة 0.5 و 1 و 2 مل من المحلول الملحي الفوسفات مخزنة لتحديد الدرجة التي يجب أن تضعف عينة 0.5 مل قبل الخطوة 2، 1.
      ملاحظة: الخطوات 1.1 − 1.1.4 بحاجة إلى إجراء فقط مرة واحدة كل تجربة، أو إذا كانت محتويات المفاعل التغيير أن القياسات اللاحقة لم تعد تفي بالمعايير الواردة في الخطوة 1، 1.
2. الحصول على عينة تمثيلية من جزء جيدا مختلطة من المفاعل بالاستيلاء على ~ 40 مل في الكأس أو أنبوب الطرد المركزي 50 مل، خلط بلطف، وصب حجم عينة العزم انتزاع جيدا مختلطة فورا إلى أنبوب الطرد مركزي 15 مل. تمييع العينة، الضرورية، كما يحدده خطوة 1.1.4.
   ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول هنا ويمكن تخزين العينة تحت التبريد (4 درجة مئوية) لمدة تصل إلى 48 ساعة. عدم تجميد العينة.
   تنبيه: الحفاظ على الوسائط الشائعة (مثل الفورمالديهايد/ميثلامين) ليست مناسبة. مساحة كبيرة من اللوحة، في تركيبة مع فتح حاوية، إنتاج الحرارة من مصدر الضوء، ويحتمل أن تكون سيئة التهوية مجهرية الإعداد ظروف خطرة دون داع لتحقيق مكاسب ضئيلة في جودة الصورة.

2-إعداد لوحات أجار الجسيمات الملون، والمعطل تداولها

1. إضافة 5 ميليلتر من 1% (w/v) الميثيلين الأزرق لكل عينة، ثم كاب وعكس بلطف في 3 مرات أقل المزيج. تسمح العينات وصمة عار على 5 على الأقل ولكن ليس أكثر من 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
2. إعداد حوالي 10 مل كل عينة أجار 7.5% (w/v) في المياه.
   ملاحظة: قد أنتجت قبل الموعد المحدد أجار وتخزينها إلى أجل غير مسمى إذا كان التعقيم. [اغروس] يمكن الاستعاضة، ولكن ليس إلى حد كبير تحسين الصور.
3. تذوب أجار استخدام حمام الماء أو الميكروويف والسماح لتبرد قليلاً قبل الاستعمال. ضمان أجار ذاب تماما ويصب بسهولة. كريات صلبة لاجار وصمة بشكل مختلف، تنتج صوراً رديئة النوعية.
4. نقل تكفي أجار 7.5% (w/v) يذاب بالانبوب الطرد المركزي لكي حجم إجمالي الأنبوب بين 6.5 و 9 مل.
5. خلاصة أنابيب الطرد المركزي، وعكس بلطف على الأقل 3 مرات لخلط.
6. بينما يشير الغطاء بعيداً عن نفسه، أو في غطاء محرك السيارة، فتح الغطاء. صب محتويات الأنبوبة في بلاستيك 100 مم طبق بيتري حين تعصف بلطف الطبق تحقيقا لطلاء كامل، على نحو سلس وتوزيعا بصريا موحد للجسيمات.
   تنبيه: قد تنتج الحرارة من أجار وسيلة طفيف في الأنبوب. وهذا غالباً ما تنتج همسة مسموعة ولديه القدرة على طرد قطيرات صغيرة من أجار الساخنة.
7. السماح لوحات لتبرد في درجة حرارة الغرفة لمدة على الأقل 5 دقائق، حتى يتصلب أجار.
   ملاحظة: قد يكون مؤقتاً في البروتوكول هنا. مخزن مطلي بالمقلوب ومختومة (على سبيل المثال، في كيس من بلاستيك ختم أو مع الفيلم البارافين) لمدة تصل إلى 48 ساعة تحت التبريد (4 درجات مئوية).

3-الحصول على صور الجسيمات باستخدام ستيريوميكروسكوبي والكاميرا الرقمية

1. ضع لوحة كشف الوجه حتى في مرحلة مجهر ستيريوميكروسكوبي قادرة على 10 x 20 x التكبير. تسليط الضوء العينة من أسفل مع ضوء منتشر، وحتى باستخدام المعدات مثل الوقوف إضاءة LED أو لوحة الخفيفة.
2. فتح برنامج التقاط الصور وضمان تعيين مسار الخفيفة الميكروسكوب إلى الصورة، وانقر فوق الكاميرا المناسبة من قائمة الكاميرا.
3. ضبط المجهر حيث تظهر جزيئات متعددة في البرنامج في المستوى البؤري مع حواف كبيرة ومحددة تحديداً جيدا. استخدم تكبير من 10-20 x لقياس الجسيمات مع الاحتفاظ المستوى البؤري العميقة نسبيا.
   1. مؤقتاً إزالة لوحة أجار ووضع الميكرومتر على المسرح. ضبط التركيز ما يرام حتى التخرج في الميكرومتر تظهر مركزة تركيزاً شديدا في برنامج التقاط الصور.
   2. إذا لم تكن محسوبة، سجل بكسل لنسبة صغيرة من أجل التكبير الحالي.
      1. تعيين التكبير/التصغير إلى 100% عن طريق النقر فوق التكبير > "الحجم الفعلي" وحدد خيارات > معايرة ثم قم بمحاذاة شريط المعايرة الأحمر في منفذ العرض الرئيسي على طول المحور الطويل ميكرومتر، مع أشرطة عمودية تركز على تخريج ميكرومتر 0 و 200. في شاشة معايرة ، أدخل مستوى التكبير الحالي والطول الفعلي من 200 مليميكرون.
   3. إذا كان الفعل معايرة حدد التكبير من شريط القوائم، وحدد التكبير الحالي المستوى وتأكيد المعايرة.
      1. حدد المقاييس > خط > التعسفي الخط. انقر فوق تقاطع التخرج 0 ومحور طويل ميكرومتر. انقر مرة أخرى فوق التقاطع في 200 والمحور منذ فترة طويلة. أ الصحيح المعايرة يجب عرض ما يقرب من 200 ميكرومتر. حذف السطر بالنقر على ذلك، حذف الملحة، والضغط على نعم في مربع التأكيد.
         ملاحظة: التعليمات المعطاة لاختيار الكاميرا والمعايرة الخاصة بالبرمجيات المستخدمة لهذا الجهاز. وظائف مماثلة ينبغي أن تكون متاحة في برامج التصوير الأخرى. والهدف تحديد بكسل لنسبة ميكرون من الصورة لقياس حجم الجسيمات الدقيقة.
4. استبدال لوحة أجار وضبط تركيز جيد لتحقيق أقصى قدر من التفصيل في برامج التصوير.
5. ضبط برامج التصوير بحيث يتم تحقيق جودة الصورة كحد أقصى.
   1. زيادة عمق البت إلى قيمة الحد الأقصى المسموح به، عن طريق تحديد زر الراديو في لوحة بت عمق الشريط الجانبي الكاميرا . تعيين البرنامج للحصول على الصور الرمادية بتحديد زر الخيار المناسب في لوحة اللون/رمادي الكاميرا في الشريط الجانبي.
   2. انهيار أي أفرقة فتح الشريط الجانبي بين التعرض والرسم البياني. تخفيض الربح إلى 1.0 وزيادة التعرض حتى يظهر صورة واضحة في إطار المعاينة، وحتى يظهر الرسم البياني توزيعه لا يتم قص أما نهاية مربع الرسم البياني.
   3. ضبط الرسم البياني لتجنب أكثر وناقص. في لوحة الرسم البياني للشريط الجانبي الكاميرا، الشريحة الحدود اليسرى من الرسم البياني للتو خارج قيم أدنى والحد الأيمن للتو خارج أعلى القيم.
6. حفظ الصورة TIFF غير مضغوط، بما في ذلك المعلومات التكبير في صورة بيانات التعريف باستخدام ملف > حفظ باسم مربع الحوار تحديد تنسيق TIFF، والتأكد من أن مربع حفظ معلومات المعايرة يتم فحص.
   ملاحظة: حفظ بيانات تعريف الصورة، بما في ذلك معايرة المكانية، قد تختلف بين اقتناء البرامج. فيجي¹⁵، البرامج الأساسية المستخدمة من قبل خط الأنابيب، وتفهم المتغيرات الأكثر شيوعاً. معلومات هامة لتسجيل هو الارتفاع بكسل، العرض، والوحدة (الوحدات) المرتبطة بها.
7. استخدام أما مرحلة متنقلة أو نقل اللوحة نفسها يدوياً، حدد مجال آخر، التي لا تتداخل الصور السابقة، بعد مسار التي المناوبين بين اليمين لليسار واليمين لليسار كأحد يتحرك أسفل اللوحة؛ يعرف أيضا باسم 'تهذيب الحشائش بحث نمط'. كرر الخطوة 3، 6 حتى يتم إنتاج الصور كافية لالتقاط الجسيمات بصريا ما يقدر 500 على الأقل، أكثر أفضل.
   ملاحظة: أنماط بدائل (مثلاً.، دائرية، عشوائي) مقبولة ولكن ينبغي الإبلاغ عنها. الحصول على صور متداخلة متعددة لتركيبة في فسيفساء عبر الرقمية تنتج خياطة حجم ملف الناتج الذي يعرقل إلى حد كبير التجهيز النهائي والتحف من خياطة قد أدخلت ولا ينصح حاليا.
8. الاحتفاظ بلوحات حتى بعد تحليل الصور لتصوير المتابعة المحتملة. وبعد التصوير النهائي، تجاهل حسب الاقتضاء للنفايات البيولوجية.

4-قياس وتحليل الجسيمات الظلية

1. تثبيت حزم البرامج تحليل الصورة المطلوبة
   1. تثبيت فيجي (نسخة محسنة من إيماجيج v1.52e "المعاهد الوطنية للصحة" اتباع الإرشادات التي تظهر في: https://imagej.net/Fiji/Downloads
   2. تثبيت بوابة، إذا لم يكن موجوداً بالفعل، باتباع التعليمات الموجودة على: https://git-scm.com/downloads
   3. الحصول على رمز تحليل الجسيمات من طريق الاستنساخ مستودع بوابة¹⁶.
      1. في سطر الأوامر، استرداد أحدث إصدار من التعليمات البرمجية بكتابة:
         بوابة استنساخ https://github.com/joeweaver/SParMorIA-Sludge-Particle-Morphological-Image-Analysis.git
         1. تثبيت تحليل التعليمات البرمجية التالية الإرشادات الموجودة في الملف النصي README.md موجود في الدليل الأعلى مستوى مستودع المستنسخة.
            ملاحظة: استخدام بوابة المفضل، كما أنه سيتم تلقائياً استرداد أحدث نسخة من التعليمات البرمجية. إذا لم يتوفر بوابة، من الممكن أيضا لتحميل التعليمات البرمجية كملف مضغوط على الصفحة الإصدار: https://github.com/joeweaver/SParMorIA-Sludge-Particle-Morphological-Image-Analysis/releases
   4. تحرير ملف نصي سرد الدلائل المراد معالجتها، جنبا إلى جنب مع المعلمات الاختيارية. الرجوع إلى الدليل الفرعي الأمثلة والتحليل للحصول على قائمة المعلمات وأمثلة.
2. قم بتشغيل التحليل سطر الأوامر بكتابة:
   < فيجي-مسار > \ImageJ-win64.exe-وحدة التحكم--الماكرو < بارامسفيلي > سبارموريا-SludgeParticle_Morphological_Image_Analysis
   حيث هو < فيجي-مسار > < بارامسفيلي > موقع ملف نص يصف إعداد التحليل والدليل الذي يقع إيماجيج-win64.exe
   ملاحظة: الاسم القابل للتنفيذ قد تختلف, اعتماداً على أي فيجي نظام التشغيل المثبت على. اعتماداً على عدد وحجم الصور، قد يستغرق بضع دقائق إلى ساعات التحليل وسيتم تشغيلها تلقائياً.
3. إجراء فحص مراقبة الجودة
   1. دراسة مراقبة جودة الملفات الموجودة في دليل فرعي للدليل الإخراج المحدد تراكب. ملاحظة الصور مع زائفة، وغاب، وسوء القبض على الجسيمات، كل شيء واضح كتظليل الخطوط العريضة التي لا تتطابق مع الخلفية. يشير إلى الرقم 3 للحصول على أمثلة من هذا القبيل. بيانات الجسيمات جاهزة الآن لتوليد الشكل التحليل الخاصة بالتجربة.
4. رفض لوحات كلها أو الجسيمات الفردية عن طريق تحديد في التعليمات البرمجية تحليل الملفات لاحظ و/أو الجسيمات معرفات لا يمكن تجاهله. أرجع إلى الأمثلة/رقابة في المستودع لرمز بيثون والتطوير ذات الصلة.
5. توليد أرقام محددة تجربة استخدام نتائج تحليل الصور لكل صورة مخزنة في ملف نصي فصل فاصلة مرتبة¹² في النتائج دليل فرعي للدليل الإخراج المحدد. الرجوع إلى الدلائل الفرعية أمثلة/أرقام/R وأمثلة/أرقام/بيثون لأمثلة على كيفية قراءة الملفات النتائج.

النتائج

الملفات التي تم إنشاؤها
عملية هو موضح في الشكل 1 سوف ينتج ملفين كل صورة تم تحليلها. الملف الأول هو فاصلة فصل ملف نص القيمة (CSV) حيث كل صف يناظر جسيمات فردية والأعمدة وصف مختلف المقاييس الجسيمات مثل منطقة، والتدوير، والصلابة، والمحددة في دليل إيما...

Discussion

على الرغم من أن نظام تحليل صورة قوية إلى حد ما وتتخذ خطوات مراقبة الجودة لضمان إزالة صور الفقراء، الاهتمام المناسب لقضايا محددة في أخذ العينات، وإعداد لوحة، والحصول على الصور يمكن تحسين كل من دقة البيانات ونسبة صور تمرير QC.

تركيز العينات
افتراض قد أخذت عينة تمثيل...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% Bleach solution	Chlorox	31009	For workspace disinfection.
15 mL centrifuge tube with cap	Corning	430790	Per sample.
50 mL Erlenmeyer flask	Corning	4980-50	Other vessels are suitable so long as they can contain > 40 mL of sample and allow mixing
500 mL Kimax Bottle	Kimble-Chase	14395-50	Or otherwise sufficient for agar handling
Agar	BD	214010	Solid, to prepare 7.5% gel. 7 mL per sample.
Data analysis software	N/A	N/A	R or Python are suggested
Deionized water	N/A	N/A	Sufficient to prepare stain and agar. If unavailable, tap should be fine.
Desktop computer	N/A	N/A	Image analysis is not CPU intensive, any 'ordinary' desktop computer circa 2017 should be sufficient.
External hard drive	Seagate	STEB5000100	Not fully required, but extremely useful given the number an size of images. 2 or more TB of storage suggested.
FIJI	NIH	version 1.51d	Version is ImageJ core. Plugins are updated as of writing. Available at: https://imagej.net/Fiji/Downloads
GIT	Open Source	version 2.19.1 or later	Available at: https://git-scm.com/
Image capture software	ToupView	version 3.7.5177	Any compatible with camera, may come with camera. Should allow saving TIFF images with spatial calibration data.
Mechanical (X/Y) Stage	OMAX	A512	Not fully required, but greatly aids image acquisition.
Methylene blue	Fisher	M291-100	Solid, to prepare 1% w/v solution. 5 uL solution per sample.
Microscope camera	OMAX	A35140U	Any digitial camera compatible with microscope. Resolution providing at least 5 um per pixel at 10x magnification and a dynamic range of at least 8 bits per pixel per color channel is suggested.
Optical Stage Micrometer	OMAX	A36CALM1	Or otherwise sufficient for spatial calibration.
Petri dish, 100 mm	Fisher	FB0875712	1 per sample.
PPE	N/A	N/A	Standard lab coat, gloves, and eyewear.
Sparmoria macro	NCSU	version 0.2.1	Available at github repository : https://github.com/joeweaver/SParMorIA-Sludge-Particle-Morphological-Image-Analysis
Stereo/dissecting microscope	Nikon	SMZ-2T	Should provide 10 to 20x magnficiation and allow digital photos either with a buit-in camera or profide a mounting point for a CCD.