מדידת לצורה ולגודל החלקיקים בוצה מופעל מרותק למיטה בטיפול אגר עם צינור תוכנה קוד פתוח

Summary

הגודל והצורה של חלקיקים ב בוצה מופעל הם פרמטרים חשובים זה נמדדים באמצעות שיטות שונות. אי דיוקים נובעים דגימה בלתי מייצג, שיוצרת תמונות ופרמטרים ניתוח סובייקטיבית. כדי למזער שגיאות אלה להקל על המדידה, אנו מציגים פרוטוקול ציון בכל שלב, כולל צינור תוכנה של קוד פתוח.

Abstract

ריאקטורים ניסיוני, כגון אלה לטיפול בשפכים, מכילים חלקיקים בגודל ובצורה של מי הם פרמטרים חשובים. לדוגמה, הגודל והצורה של בוצה מופעל flocs ניתן לציין את התנאים-microscale, משפיעים גם ישירות על מה טוב כל הטינופת בסבלך clarifier של '.

גודל החלקיקים צורה שתי מדידות בניגוד לשמו 'פשוט' בקרב אנשי עסקים ותיירים כאחד. רבים בנושאים עדינים, לעיתים קרובות ללא התיחסות בפרוטוקולים פורמלי, יכול להיווצר כאשר הדגימה, הדמיה, ניתוח חלקיקים. שיטות דגימה עשויים להיות מוטים או אינם מספקים מספיק חשמל סטטיסטי. הדגימות עצמם ייתכן יישמרו לקוי או לעבור שינוי במהלך הנייח. תמונות אינה בהכרח באיכות טובה דיה; חופפים חלקיקים, עומק שדה, רמת הגדלה ו רעש שונים יכול כל לייצר תוצאות המסכן. ניתוח לקוי שצוין ניתן להטיה, כגון כי המיוצר על-ידי קביעת סף תמונה ידנית פילוח.

כל אחד מהחדרים מכיל ותפוקת הם רצויים לצד הפארמצבטית. שיטת תפוקה גבוהה, במחיר סביר יכול לאפשר מדידה חלקיקים בתדירות גבוהה יותר, הפקת תמונות רבות המכיל אלפי חלקיקים. שיטה המשתמשת ריאגנטים זולה, מיקרוסקופ ויבתר נפוצות וכן תוכנת ניתוח זמינה בחופשיות קוד פתוח מאפשר תוצאות ניסויית הדיר, נגיש, הדירים חלקית-ממוחשב. עוד, התוצר של השיטה יכולה להיות מעוצבת היטב, מוגדרים היטב, להבין בקלות על ידי תוכנת ניתוח נתונים, הקלות במרחק המעבדה ניתוחים והן שיתוף בין מעבדות נתונים.

אנו מציגים פרוטוקול לפירוט השלבים הדרושים כדי לייצר מוצר שכזה, לרבות: דגימה, לטעום הנייח אגר, ייבוא תמונות דיגיטליות, ניתוח תמונות דיגיטליות ו דוגמאות של דור איור ניסוי ספציפי מן והכנה תוצאות ניתוח. כללנו גם את צינור ניתוח נתונים פתוח כדי לתמוך בפרוטוקול זה.

Introduction

מטרת שיטה זו היא כדי לספק שיטה מוגדרים היטב, הדיר ו חלקית-ממוחשב לקביעת הפצות הגודל והצורה של חלקיקים בתוך ריאקטורים, במיוחד אלה המכילים flocs בוצה מופעל ואת בגרגרים אירובי^{1 , 2}. הרציונל מאחורי שיטה זו היו כדי לשפר את מקלחון, פשטות, תפוקה, הדיר שלנו קיימים פרוטוקולים ללא צורך במיקור חוץ^3,4, להקל על מדידת חלקיקים אחרים, וכדי להקל על שיתוף ועל השוואה של נתונים.

ישנן שתי קטגוריות כלליות של חלקיקים מדידה ניתוח - ישיר הדמיה הסקתית ושיטות באמצעות תכונות כאלה כמו פיזור אור⁵. למרות שיטות הסקתית יכול להיות אוטומטי ויש תפוקה גדולה, הציוד יקר. בנוסף, בעוד שיטות הסקתית ניתן לקבוע במדויק הגודל המקביל של חלקיקים⁶, הם אינם מספקים מידע מפורט צורה⁷.

בשל הצורך נתוני צורה, לנו בסיס השיטה שלנו על הדמיה ישירה. בעוד כמה שיטות הדמיה של תפוקה גבוהה קיימים, הם נדרשים באופן מסורתי חומרה מסחרי יקר או פתרונות מותאמים אישית הבנויה^8,9. השיטה שלנו פותחה להעסיק משותף, במחירים סבירים חומרה ותוכנה זה, למרות סובל לירידה בתפוקה, מייצרת תמונות חלקיקים הרבה יותר מהמינימום הדרוש עבור ניתוחים רבים¹⁰.

קיימים פרוטוקולים עשויה לציין לא הדגימה חשוב והשלבים רכישת התמונה. פרוטוקולים אחרים עשויה לציין שלבים ידניים זה גורם להטיה סובייקטיביות (כגון קביעת סף אד הוק¹¹). שיטה מוגדר היטב כי קביעת שלבי רכישת דגימה, קיבעון ותמונה בשילוב עם ניתוח זמינה בחופשיות תוכנה יהיה לשפר ניתוח תמונה בתוך-מעבדה וגם השוואות בין מעבדות. יעד מרכזי של פרוטוקול זה נועד לספק זרימת עבודה וכלים צריך להוביל לתוצאות לשחזור של מעבדות שונות באותה דגימת זרע.

מלבד נרמול תהליך ניתוח התמונה, הנתונים המיוצר על ידי צינור זה נרשם גם עם קובץ מוגדר היטב, מעוצבת היטב¹² מתאים לשימוש על-ידי הנתונים הפופולריים ניתוח חבילות^13,14, הקלות ניסוי ניתוחים ספציפיים (כגון יצירת דמות אישית) ונתונים והקלה על שיתוף בין מעבדות.

פרוטוקול זה במיוחד הוא הציע לחוקרים אשר דורשים נתוני צורה של חלקיקים, אין גישה לשיטות הסקתית, לא הייתי רוצה לפתח צינור ניתוח התמונה שלהם, ורוצים לשתף בקלות את הנתונים שלהם עם משתמשים אחרים

Protocol

1. לאסוף דגימות לניתוח חלקיקים

1. לקבוע את אמצעי האחסון מדגם עבור כורים ספציפיים אשר יפיקו חלקיקים מספיק עבור ניתוח סטטיסטי¹⁰ (> 500) תוך הימנעות חפיפה של חלקיקים.
   1. נניח כי בטווח של 0.5 עד 2 מ לכל דגימה של משקאות מעורבים מספיקה עבור דגימות בוצה מופעל עם מוצקים משקאות מעורבים מושעה (מיס) בין 250 ל- 5000 מ ג/ל'
   2. אחרת, להכין שלוש צלחות אגר הבדיקה באמצעות 0.5, 2 ו- 5 מ של דגימה (שלבים 1.2 דרך 2.7).
   3. מבחינה ויזואלית מעריכים אשר (אם בכלל) מדגם אמצעי האחסון הטובה ביותר בקריטריונים המפורטים בשלב 1.1.
   4. אם החלקיקים עדיין חופפים עבור המדגם 0.5 mL, חזור על שלבים 1.1.2 ו 1.1.3 עם שלוש דוגמאות 0.5 mL מדולל עם הוסיף 0.5, 1, ו 2 מ ל תמיסת פוספט buffered כדי לקבוע את מידת שאליו מדגם 0.5 mL חייב להיות מדולל לפני שלב 2.1.
      הערה: השלבים 1.1 − 1.1.4 צריך לבצע אך ורק פעם אחת לכל ניסוי, או אם הכור תוכן שינוי כזה מדידות שלאחר מכן כבר לא עומד בקריטריונים המפורטים בשלב 1.1.
2. לרכוש מדגם מייצג של חלק מעורבים היטב הכור על-ידי גרירה ~ 40 מ"ל כוס כימית או 50 מ ל צנטריפוגה הצינור, בעדינות ערבוב, מיד לשפוך נפח דגימה נחוש החטיפה מעורבב היטב לתוך שפופרת צנטרפוגה 15 מ"ל. לדלל את הדגימה, יש צורך, כפי שנקבע על ידי צעד 1.1.4.
   הערה: הפרוטוקול אפשר לעצור כאן, ניתן לאחסן את הדגימה תחת קירור (4 ° C) עד 48 שעות. אין להקפיא את הדגימה.
   זהירות: שימור הנפוץ מדיה (למשל, פורמלדהיד/formamide) אינם מתאימים. שטח גדול של הצלחת, בשילוב עם המיכל פתוח, חום מתוך מקור האור ולאחר ההתקנה מיקרוסקופית פוטנציאלית מאוורר לייצר תנאים מסוכנים שלא לצורך רווח קטן באיכות התמונה.

2. להכין פלטות אגר של חלקיקים מוכתם, קיבוע

1. להוסיף 5 µL של 1% (w/v) מתילן כחול כל דגימה, ואז קאפ, היפוך בעדינות ב 3 פעמים לפחות לערבב. אפשר דוגמאות כתם לפחות 5 אבל לא יותר מ 30 דקות בטמפרטורת החדר.
2. להכין כ- 10 מ"ל לכל דגימה של 7.5% (w/v) אגר במים יונים.
   הערה: אגר עשוי להיות המופק מבעוד מועד, מאוחסנים ללא הגבלת זמן אם עיקור. Agarose יכול להיות מוחלף, אך לא באופן משמעותי לשפר תמונות.
3. להמיס אגר באמצעות אמבט מיקרוגל או מים ומאפשרים כדי לצנן מעט לפני השימוש. ודא אגר הוא נמס לגמרי נשפך בקלות. צבע אחיד של אגר אכתים אחרת, הפקת תמונות באיכות ירודה.
4. העברה מספיק אגר 7.5% (w/v) מומסת הצינור צנטריפוגה כדי להביא האחסון סה כ צינור בין 6.5 ו 9 מ.
5. לסכם צנטריפוגה צינורות, בעדינות היפוך לפחות 3 פעמים כדי לערבב.
6. תוך כדי שהם מצביעים הכיפה מן האדם עצמו או בשכונה, פתח את הפקק. שופכים את תוכן צינור לתוך פלסטיק 100 מ מ פטרי תוך בעדינות נדנדה המנה כדי להשיג ציפוי מלא, חלק בהתפלגות אחידה מבחינה ויזואלית של חלקיקים.
   התראה: בחום אגר עשויה לייצר את הלחץ קלה בצינור. זה לעתים קרובות מייצרת של היס נשמעים, יש פוטנציאל לגרש את טיפות קטנות של אגר חם.
7. לאפשר את הצלחות להתקרר בטמפרטורת החדר, לפחות 5 דקות, עד אגר עפור.
   הערה: הפרוטוקול עשוי להיות עצר כאן. חנות מצופה הפוכה ואטום (למשל, בתוך שקית פלסטיק לאטימת או עם סרט פרפין) עד 48 שעות תחת קירור (4 ° C).

3. לרכוש תמונות של חלקיקים באמצעות stereomicroscope מצלמה דיגיטלית

1. מקם את פני צלחת חשפו את הבמה מיקרוסקופ של stereomicroscope מסוגל x 10 כדי 20 x הגדלה. להאיר את הדגימה מלמטה עם תיקו, לפזר אור באמצעות ציוד כגון LED המאייר לעמוד או צלחת אור.
2. לפתוח את התוכנה לכידת התמונה, להבטיח שהנתיב מיקרוסקופ אור מוגדר צילוםולחץ על המצלמה המתאימה מתוך הרשימה המצלמה.
3. להתאים את המיקרוסקופ כך מרובות חלקיקים מופיעים התוכנה ב מישור מוקד עם קצוות מוגדרים היטב, גדול. להשתמש הגדלה של 10-20 x כדי למדוד חלקיקים תוך שמירה על מטוס מוקד יחסית עמוק.
   1. הסר את לוחית אגר ולמקם את מיקרומטר באופן זמני על הבמה. התאם את המוקד בסדר עד טקסי-מיקרומטר מופיעים בחדות ממוקד בתוכנה לכידת התמונה.
   2. אם בעבר לא מכויל, לתעד את הפיקסל מיקרו יחס ההגדלה הנוכחית.
      1. הגדר את הזום ל- 100% על-ידי לחיצה על זום > גודל ממשי ובחר אפשרויות > כיול ואז ליישר את הסרגל כיול אדום האשנב הראשי לאורך ציר זמן מיקרומטר, עם פסי אנכי מרוכז על סיום לימודים מיקרומטר 0 ו-200. בתיבת הדו-שיח כיול , הזן את רמת ההגדלה הנוכחית ואת האורך הממשי של 200 מיקרומטר.
   3. אם כבר מכויל בחר ההגדלה של שורת התפריט, בחר ההגדלה הנוכחית ברמה ו לאשר את הכיול.
      1. בחר המידות > קו > שרירותי קו. לחץ על ההצטלבות של סיום 0, ציר זמן מיקרומטר. לחץ שוב על 200 ו הציר הארוך. בצומת. A נכונה כיול אמורה להציג כ-200 מיקרומטר. למחוק את השורה על-ידי לחיצה עליו, הקשה על delete, והקשה כן בתיבת האישור.
         הערה: ההוראות שניתנו לבחירת מצלמה וכיול הספציפיים התוכנה ששימשה עבור חומרה זו. פונקציות דומות צריך להיות זמין תוכנות הדמיה אחרות. המטרה היא לקבוע את הפיקסל מיקרון יחס של התמונה עבור מדידת גודל חלקיקים מדויק.
4. להחליף את צלחת אגר והתאימו את המוקד בסדר כדי להשיג פרטים מירביים בתוכנת הדמיה.
5. להתאים את תוכנת הדמיה כך איכות תמונה מקסימלית מושגת.
   1. להגדיל את עומק הסיביות לערך המרבי המותר, על-ידי בחירה בלחצן האפשרויות בחלונית ' עומק סיביות ' של הסרגל הצידי המצלמה . להגדיר את התוכנה כדי לרכוש תמונות בגווני אפור על-ידי בחירה בלחצן המתאים בחלונית ' צבע/אפור ' של הסרגל הצידי המצלמה .
   2. לכווץ את כל לוחות הצידי פתוח בין חשיפה היסטוגרמה. להפחית את הרווח 1.0 ולהגדיל את החשיפה להופעת תמונה ברורה של האשנב, ועד ההיסטוגרמה מופיעה התפלגות זה לא ייחתך על ידי אחד מהקצוות של תיבת היסטוגרמה.
   3. להתאים את ההיסטוגרמה להימנע לגבי ואת מצילום. בחלונית ' היסטוגרמה ' של סרגל הצד מצלמה, להחליק את הגבול הימני של ההיסטוגרמה אל מחוץ הערכים הנמוכים ביותר ואת הגבול הנכון אל מחוץ הערכים הגבוהים ביותר.
6. שמור את התמונה TIFF לא דחוסה, לרבות מידע הגדלה ב- metadata תמונה, באמצעות קובץ > שמירה בשם בתיבת הדו-שיח, בחירת תבנית TIFF, ומבטיחה כי תיבת שמור עם כיול מידע נבדקת.
   הערה: שמירת תמונה מטה-נתונים, כולל כיול המרחבי, עשויים להשתנות בין תוכניות רכישה. פיג'י¹⁵, התוכנה הבסיסית ששימשה על-ידי הצבר, מבינים גרסאות הנפוץ ביותר. המידע החשוב לתעד הוא פיקסל גובה, רוחב, unit(s) המשויך.
7. שימוש בכל שלב ניידים או להזיז ידנית את הצלחת עצמה, בחר תחום נוסף, אשר אינו חופף תמונות קודמות, בעקבות נתיב אשר מעבר לסירוגין בין שמאל לימין, מימין-לשמאל כאחד נע למטה את הצלחת; ידוע גם בשם "מכסחת דשא חיפוש דפוס'. חזור על שלב 3.6 עד מספיק תמונות מיוצרים כדי ללכוד חלקיקים באופן חזותי משוער לפחות 500, יותר טובים.
   הערה: חלופות דפוסים (למשל., מעגליות, אקראי) מקובלים אבל יש לדווח. רכישת תמונות חופפות מרובות עבור שילוב לתוך. פסיפס דרך דיגיטלי מפיק תפירה וכתוצאה מכך גודל קובץ אשר מאוד מפריע במורד הזרם עיבוד וממצאים מן תפרים עשוי להיות מוצג והיא אינה מומלצת כיום.
8. שומרים על לוחות עד לאחר ניתוח תמונות עבור פוטנציאל ומעקב הדמיה. לאחר הדמיה הסופי, להתעלם בהתאם לפסולת ביולוגית.

4. למדוד ולנתח חלקיקים צלליות

1. התקנת חבילות תוכנה ניתוח התמונה הנדרש
   1. התקנת פיג'י (גרסה משופרת של ImageJ v1.52e מכוני הבריאות הלאומיים של ההוראות ב: https://imagej.net/Fiji/Downloads
   2. התקנת לגית, אם לא שכבר קיים, על פי ההוראות ב: https://git-scm.com/downloads
   3. רוכשים את הקוד ניתוח חלקיקים על-ידי שיבוט של מאגר לגית¹⁶.
      1. בשורת הפקודה, לאחזור הגירסה האחרונה של הקוד על-ידי הקלדת:
         לגית שיבוט https://github.com/joeweaver/SParMorIA-Sludge-Particle-Morphological-Image-Analysis.git
         1. התקן הבאות קוד ניתוח ההוראות בקובץ הטקסט README.md שנמצאו בספריית השורש של המאגר משובטים.
            הערה: שימוש לגית הוא המועדף, כמו זה יהיה לאחזר באופן אוטומטי את הגירסה העדכנית ביותר של הקוד. אם לגית אינה זמינה, זה גם אפשרי להוריד את הקוד בתור קובץ zip בדף שחרור ב: https://github.com/joeweaver/SParMorIA-Sludge-Particle-Morphological-Image-Analysis/releases
   4. ערוך את קובץ הטקסט המפרט את הספריות להיות מעובד, יחד עם פרמטרים אופציונליים. עיין ספריית המשנה דוגמאות/ניתוח לקבלת רשימה של פרמטרים ודוגמאות.
2. הפעל הניתוח של שורת הפקודה על-ידי הקלדת:
   < פיג'י-נתיב > \ImageJ-win64.exe - מסוף - מאקרו SParMorIA-SludgeParticle_Morphological_Image_Analysis < paramsfile >
   כאשר < פיג'י-נתיב > הוא מדריך בהם נמצאת ImageJ-win64.exe ו- < paramsfile > המיקום של קובץ הטקסט המתאר את הכיוונון ניתוח
   הערה: שם קובץ ההפעלה עשויים להשתנות, בהתאם פיג'י מערכת ההפעלה המותקנת. בהתאם המספר והגודל של תמונות, הניתוח עלול לקחת כמה דקות עד שעות, יפעלו באופן אוטומטי.
3. לבצע בדיקת בקרת איכות
   1. בדוק את בקרת איכות הקבצים הנמצאים המשנה שכבת-על ספריית הפלט שצוינה. הערה תמונות עם כדין, שלא נענו, גרוע שנתפסו חלקיקים, לכאורה כל כקווי מתאר המוצלת אשר אינן תואמות את הרקע. עיין איור 3 לקבלת דוגמאות כאלה. הנתונים חלקיקים מוכנים עכשיו לדור דמות ספציפית בניסוי ניתוח.
4. דוחים את כל הצלחות או חלקיקים בודדים על-ידי ציון בקוד ה-ניתוח של קבצים ציין ו/או חלקיק מזהים שיש להתעלם ממנה. עיין דוגמאות/לצנזר במאגר עבור קוד R ופייתון הרלוונטיים.
5. ליצור דמויות ספציפיות ניסוי שימוש בתוצאות ניתוח תמונה עבור כל תמונה מאוחסנות בקובץ טקסט מופרדים באמצעות פסיקים מסודר¹² ב ספריית המשנה תוצאות של ספריית הפלט שצוינה. עיין ספריות דוגמאות/דמויות/R ודוגמאות/דמויות/פיתון עבור דוגמאות כיצד לקרוא את הקבצים תוצאות.

תוצאות

קבצים שנוצרו
התהליך מאויר באיור 1 יהיה לייצר שני קבצים לכל תמונה מנותח. הקובץ הראשון הוא פסיק מופרדים בקובץ הטקסט ערך (CSV) שבו כל שורה מקבילה לאפשרות חלקיקים בודדים ולתאר העמודות מדדים שונים של חלקיקים כגון אזור, מעגליות אחידות הגדרה ידנית ImageJ

Discussion

למרות מערכת ניתוח התמונה היא די חסונים, QC הפעולות הננקטות כדי להבטיח תמונות המסכן יוסרו, תשומת לב המתאים הנושאים הספציפיים דגימה, הכנת צלחת, ייבוא תמונות יכול לשפר גם את הדיוק של הנתונים וגם היחס תמונות עובר QC.

ריכוז דגימה
בהנחה שנלקח מדגם מייצג, הוא הצעד החשוב ביו...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% Bleach solution	Chlorox	31009	For workspace disinfection.
15 mL centrifuge tube with cap	Corning	430790	Per sample.
50 mL Erlenmeyer flask	Corning	4980-50	Other vessels are suitable so long as they can contain > 40 mL of sample and allow mixing
500 mL Kimax Bottle	Kimble-Chase	14395-50	Or otherwise sufficient for agar handling
Agar	BD	214010	Solid, to prepare 7.5% gel. 7 mL per sample.
Data analysis software	N/A	N/A	R or Python are suggested
Deionized water	N/A	N/A	Sufficient to prepare stain and agar. If unavailable, tap should be fine.
Desktop computer	N/A	N/A	Image analysis is not CPU intensive, any 'ordinary' desktop computer circa 2017 should be sufficient.
External hard drive	Seagate	STEB5000100	Not fully required, but extremely useful given the number an size of images. 2 or more TB of storage suggested.
FIJI	NIH	version 1.51d	Version is ImageJ core. Plugins are updated as of writing. Available at: https://imagej.net/Fiji/Downloads
GIT	Open Source	version 2.19.1 or later	Available at: https://git-scm.com/
Image capture software	ToupView	version 3.7.5177	Any compatible with camera, may come with camera. Should allow saving TIFF images with spatial calibration data.
Mechanical (X/Y) Stage	OMAX	A512	Not fully required, but greatly aids image acquisition.
Methylene blue	Fisher	M291-100	Solid, to prepare 1% w/v solution. 5 uL solution per sample.
Microscope camera	OMAX	A35140U	Any digitial camera compatible with microscope. Resolution providing at least 5 um per pixel at 10x magnification and a dynamic range of at least 8 bits per pixel per color channel is suggested.
Optical Stage Micrometer	OMAX	A36CALM1	Or otherwise sufficient for spatial calibration.
Petri dish, 100 mm	Fisher	FB0875712	1 per sample.
PPE	N/A	N/A	Standard lab coat, gloves, and eyewear.
Sparmoria macro	NCSU	version 0.2.1	Available at github repository : https://github.com/joeweaver/SParMorIA-Sludge-Particle-Morphological-Image-Analysis
Stereo/dissecting microscope	Nikon	SMZ-2T	Should provide 10 to 20x magnficiation and allow digital photos either with a buit-in camera or profide a mounting point for a CCD.