Измерение на форму и размер частиц ила, иммобилизованных в Агаре с открытым исходным кодом программного конвейера

Резюме

Размер и форма частиц ила являются важными параметрами, которые измеряются с помощью различных методов. Неточности возникают от нерепрезентативная выборка, субоптимальный изображения и параметры субъективного анализа. Чтобы свести к минимуму эти ошибки и облегчения измерения, мы представляем протокол, указав каждый шаг, в том числе открытым исходным кодом программного конвейера.

Аннотация

Экспериментальная биореакторов, например те обработки сточных вод, содержат частицы, размер и форма которого являются важными параметрами. Например размер и форму хлопьев ила может указывать условия в микромасштабные, а также непосредственно влияют на насколько хорошо Ил оседает в отстойник.

Размер частиц и формы являются оба измерения, ошибочно «простой». Многие тонкие вопросы, зачастую нерешенными в неофициальных протоколов, могут возникнуть, когда выборки, обработки изображений и анализа частиц. Методы выборки может быть искажена или не обеспечивают достаточно статистической мощности. Образцы, сами могут быть плохо сохранились или претерпевают изменения во время иммобилизации. Изображения не может быть достаточно высокого качества; перекрывающиеся частицы, глубина резкости, масштаб и различных шума можно все производят плохие результаты. Плохо указанного анализа можно ввести предвзятости, например, производимый вручную изображения ограничивание и сегментации.

Доступность и производительность желательно вместе с воспроизводимостью. Метод доступным, высокая пропускная способность может позволить более частое измерение частиц, производить много изображений, содержащих тысячи частиц. Метод, который использует недорогие реактивы, общие рассечения микроскопа и свободно доступных открытым исходным кодом программное обеспечение для анализа позволяет повторяемые, доступной, воспроизводимые и частично автоматизированных экспериментальные результаты. Кроме того продукт такого метода может быть хорошо отформатированный, четкие и легко понять, программное обеспечение для анализа данных, облегчения анализов в лаборатории и обмена данными между лабораториями.

Мы представляем протокол, который подробно описаны шаги, необходимые для производства такой продукции, включая: отбор проб, образец подготовки и иммобилизации в агар, приобретения цифровых изображений, анализ цифровых изображений и примеры конкретного эксперимента рисунок поколения от результаты анализа. Мы также включили конвейера анализа данных открытым исходным кодом поддерживают этот протокол.

Введение

Этот метод предназначен для предоставления четко, повторяемые и частично автоматизированный метод для определения размера и формы распределения частиц в биореакторах, особенно те, которые содержат ила хлопьев и аэробных гранул^{1 , 2}. обоснование этого метода были для повышения доступности, простоты, пропускная способность, и повторяемость наших существующих собственных протоколов^3,4, облегчения измерения частиц для других и содействовать обмену и Сравнение данных.

Существует две широкие категории анализа измерения частиц - прямой визуализации и логически выведенная методы, с помощью таких качеств, как рассеяние света⁵. Хотя логически выведенная методы могут быть автоматизированы и имеют большой пропускной способности, оборудование стоит дорого. Кроме того хотя логически выведенная методы можно точно определить эквивалентный размер частиц⁶, они не дают подробную форму информации⁷.

Из-за необходимости данных фигуры на прямых изображений основе наш метод. Хотя существуют некоторые методы визуализации высокой пропускной способности, они традиционно требовали дорогостоящих коммерческих аппаратных или пользовательские построен решения^8,9. Использовать общие, доступного аппаратного и программного обеспечения, что, хотя страдает от снижения пропускной способности, производит гораздо больше изображений частиц, чем минимально необходимой для многих анализов¹⁰был разработан наш метод.

Существующие протоколы, может не указывать важные выборки и изображения приобретение шаги. Другие протоколы могут указать вручную, которые вводят субъективные уклоном (такие как ad hoc Бинаризация¹¹). Четко определенный метод, определяющий выборки, иммобилизации и изображения приобретение шаги, в сочетании с свободно доступных анализ программного обеспечения позволит повысить в лаборатории анализа изображений и сравнение между лабораториями. Основная цель настоящего Протокола заключается в рабочий процесс и инструменты, которые должны привести к воспроизводимость результатов от различных лабораторий для того же образца.

Отдельно от нормализации процесса анализа изображения, данные, подготовленные этот трубопровод записывается в четко определенных, хорошо отформатированный файл¹² , пригодные для использования популярных данных анализа пакетов^13,14, ослабление эксперимент конкретные анализы (например, пользовательские рисунок поколения) и облегчения обмена данными между лабораториями.

Этот протокол особенно предлагается для исследователей, которые требуют данные фигуры частиц, не имеют доступа к логически выведенная методы, не хотите, чтобы развивать свои собственные изображения анализа трубопровода и хотели бы поделиться своими данными легко с другими

протокол

1. сбор образцов для анализа частиц

1. Определить объем образца для конкретных реакторов, которые будут производить достаточно частиц для статистического анализа¹⁰ (> 500) избегая дублирования частиц.
   1. Предположим, что диапазон от 0,5 до 2 мл на образце смешанной ликер достаточно для проб ила с смешанной ликер приостановлено твердых (MLSS) между 250 и 5000 мг/л.
   2. В противном случае Подготовьте три плиты агара тест, используя 0.5, 2 и 5 мл образца (шаги 1.2 через 2.7).
   3. Визуально определить, какие (если имеются) лучший образец тома удовлетворяют критериям, перечисленные на этапе 1.1.
   4. Если частицы по-прежнему перекрываются для образца 0,5 мл, повторите шаги 1.1.2 и 1.1.3 с трех образцов 0,5 мл разбавляют добавлен 0,5, 1 и 2 мл фосфатный буфер для определения степени, в какой 0,5 мл образца должны быть разбавлен до шаг 2.1.
      Примечание: Шаги 1.1 − 1.1.4 должны выполняться только один раз за эксперимент, или если реактор содержание изменений, таким образом, что последующие измерения больше не отвечают критериям, указанным в шаге 1.1.
2. Приобрести репрезентативной выборки из перемешанных часть реактора, хватая ~ 40 мл в стакан или 50 мл пластиковых пробирок, нежно смешивания и сразу же заливки образца определяется объем перемешанных самосхвата в пластиковых пробирок 15мл. Разбавьте образца, необходимо, как определяется шагом 1.1.4.
   Примечание: Протокол может быть приостановлена здесь и образец может храниться в холодильнике (4 ° C) до 48 часов. Не замораживать образца.
   Предупреждение: Общий сохранение СМИ (например, формальдегид/формамид) не подходят. Большая площадь поверхности пластины, в сочетании с открытым контейнером, тепло от источника света и потенциально плохо вентилируемых микроскопии установки производят излишне опасные условия для мало пользы в качество изображения.

2. Подготовьте плиты агара окрашенных, подвижности частиц

1. 5 мкл Метиленовый синий 1% (w/v) для каждого образца, затем крышки и осторожно перевернуть на 3 наименее раз перемешать. Разрешить образцы пятно для по крайней мере 5, но не более 30 минут при комнатной температуре.
2. Подготовьте примерно 10 мл на сэмпл 7,5% (w/v) агар в деионизированной воде.
   Примечание: Агар может производиться досрочно и хранится бесконечно, если стерилизацию. Агарозы может быть заменен, но не существенно улучшить изображения.
3. Расплавьте агар с помощью микроволновой печи или водой ванну и слегка охладите перед использованием. Обеспечить агар полностью растаял и льет легко. Твердые шарики агар будет по-разному, пятно, производство низкое качество изображения.
4. Передачи достаточных расплавленный агар 7,5% (w/v), для пластиковых пробирок довести объем всего трубки до между 6.5 и 9 мл.
5. Повторение пробирок и осторожно перевернуть по крайней мере 3 раза смешивать.
6. Отмечая крышку от себя или в капюшоне, откройте крышку. Залейте содержимое трубки в 100 мм пластиковая Петри блюдо во время осторожно тряся блюдо для достижения полной, гладкие покрытия и визуально равномерное распределение частиц.
   Предупреждение: Тепла от агар может производить небольшое избыточное давление в трубе. Это часто производит слышен свист и имеет потенциал, чтобы изгнать маленькие капельки горячей агара.
7. Разрешить пластины остыть при комнатной температуре в течение по крайней мере 5 минут, до тех пор, пока агар затвердевает.
   Примечание: Протокол может быть приостановлена здесь. Магазин покрытием перевернутый и опечатаны (например, в герметизации пластиковый пакет или с парафином фильм) на срок до 48 часов в холодильнике (4 ° C).

3. получить частицы изображения с помощью стереомикроскопом и цифровой камеры

1. Место открытые пластины лицом вверх на микроскопа стереомикроскопом способны 10 x 20 x увеличение. Освещают образца ниже даже, рассеянный свет, с использованием оборудования, таких как светодиодные подсветки Стенд или подсветки номерного знака.
2. Откройте программное обеспечение захвата изображения, убедитесь, что на пути света микроскоп для фотои нажмите на соответствующую камеру из списка камеры.
3. Отрегулируйте Микроскоп, так что несколько частиц появляются в программном обеспечении в фокальной плоскости с большой, четко определенными краями. Используйте масштаб x 10-20 для измерения частиц при сохранении относительно глубоких фокальной плоскости.
   1. Временно удалить пластину агар и место микрометра на сцене. Отрегулируйте фокус штраф, до тех пор, пока выпускные на микрометра появляются четко обозначенных в программное обеспечение захвата изображения.
   2. Если калибровка не ранее, запишите пиксель микро соотношение для текущего масштаба.
      1. Установить масштаб 100%, нажав Zoom > фактический размер и выберите опции > Калибровка затем выравнивание панели красный калибровки в основные просмотра вдоль длинной оси микрометра, с вертикальные полосы, сосредоточены на 0 и 200 мкм градации. В диалоговом окне калибровки введите текущий уровень увеличения и фактическую длину 200 мкм.
   3. Если уже калиброванные выберите масштаб из строки меню, и выберите текущий масштаб уровня и подтверждения калибровки.
      1. Выберите измерения > линия > произвольных линии. Нажмите на пересечении 0 градации и длинной оси микрометра. Снова нажмите на пересечении в 200 и длинные оси. A правильной калибровки должно отображаться примерно 200 µm. удалить строку, нажав на него, нажатие удалить и нажмите Да в окне подтверждения.
         Примечание: Инструкции для выбора камеры и калибровки являются специфическими для программного обеспечения, используемого для данного оборудования. Аналогичные функции должны быть доступны в других изображений. Цель заключается в том, чтобы определить пикселя микрон соотношение изображения для измерения размера точной частиц.
4. Замените пластину агар и настроить фокус штраф для достижения максимальной детализации в визуализации программного обеспечения.
5. Отрегулируйте изображений программное обеспечение, так что качество изображения максимум достигается.
   1. Увеличьте разрядность максимальное значение разрешено, выбрав кнопку-переключатель на панели Битовую глубину боковой панели камеры . Установите программное обеспечение для получения изображения в оттенках серого, выбрав соответствующий переключатель на панели Серый цвет боковой панели камеры .
   2. Сверните все открытые боковой панели между воздействием и гистограммы. Уменьшить коэффициент усиления до 1.0 и увеличить экспозицию, пока не появится четкое изображение в видовом экране и до тех пор, пока появится гистограмма как распределение, которое не закреплены на концах поля гистограммы.
   3. Настройте гистограмму чтобы избежать над и недодержки. В панели гистограммы боковой панели камеры слайд левая граница гистограмма просто вне наименьшие значения и правая граница просто за пределами высшие ценности.
6. Сохранить изображение как несжатые TIFF, включая увеличение информацию в метаданных изображения, используя Файл > Сохранить как диалоговое окно, выбрав формат TIFF и обеспечение того, чтобы поле сохранить информацию калибровки проверяется.
   Примечание: Сохранение метаданных изображения, включая пространственные калибровки, может варьироваться между приобретение программы. Фиджи¹⁵, базового программного обеспечения, используемого в конвейер, понимает наиболее распространенные варианты. Важная информация для записи является пикселей высота, ширина и связанные устройства.
7. С помощью либо мобильная сцена или ручное перемещение пластину, сам, выберите другую область, которая не перекрываются предыдущих изображений, следуя по пути, который переключается между слева направо и справа налево как один движется вниз плита; также известен как «газонокосилку шаблон поиска». Повторите шаг 3,6 до тех пор, пока достаточно изображений производится захватить по меньшей мере 500 визуально оценкам частицы, более лучше.
   Примечание: Альтернативные шаблоны (например., циркуляр, случайные) являются приемлемыми, но должно быть сообщено. Приобретение нескольких перекрывающихся изображений для комбинации в мозаику через цифровой сшивание производит итоговый размер файла, который значительно препятствует последующей обработки и артефакты из строчки могут быть введены и в настоящее время не рекомендуется.
8. Сохраняют пластины до тех пор пока после анализа изображений для потенциальных последующей обработки изображений. После окончательной обработки изображений, отбросить как подходящие для биологических отходов.

4. измерения и анализа частиц силуэты

1. Установка пакетов программного обеспечения анализа необходимых изображений
   1. Установить Фиджи (расширенная версия национальных институтов здравоохранения ImageJ v1.52e следуя инструкциям в: https://imagej.net/Fiji/Downloads
   2. Установить git, если еще не установлены, следуя инструкциям на: https://git-scm.com/downloads
   3. Получить код анализа частиц от клонирования репозитория git¹⁶.
      1. В командной строке получить последнюю версию кода, введя:
         git clone https://github.com/joeweaver/SParMorIA-Sludge-Particle-Morphological-Image-Analysis.git
         1. Установите следующий код анализа, инструкции в текстовом файле README.md найти в каталоге верхнего уровня клонированного репозитория.
            Примечание: Использование git является предпочтительным, поскольку он будет автоматически получить последнюю версию кода. Если git не доступно, это также можно скачать код zip-файл на странице выпуска на: https://github.com/joeweaver/SParMorIA-Sludge-Particle-Morphological-Image-Analysis/releases
   4. Измените текстовый файл со списком каталогов для обработки, а также необязательные параметры. Обратитесь к подкаталог примеров/анализ для списка параметров и примеры.
2. Запустите анализ на командной строке, введя:
   < Фиджи-путь > \ImageJ-win64.exe--консоли - макрос < paramsfile > SParMorIA-SludgeParticle_Morphological_Image_Analysis
   где < Фиджи путь > — это каталог, в котором находится ImageJ-win64.exe и < paramsfile > местоположение текстового файла, описывающий настройки анализа
   Примечание: Имя исполняемого файла может отличаться, в зависимости от операционной системы Фиджи установлен на. В зависимости от количества и размера изображений анализ может занять несколько минут до часов и будет запускаться автоматически.
3. Выполните проверку контроля качества
   1. Просмотрите файлы контроля качества, расположенный в подкаталоге оверлея в указанный выходной каталог. Обратите внимание на изображения с ложные, пропущенных и плохо захваченные частицы, все ясно как затененный контуры, которые не соответствуют фон. Для примеров таких обратитесь к рис . Данные частицы теперь готовы для анализа конкретного эксперимента рисунок поколения.
4. Отвергать весь пластин или индивидуальных частиц, указав в анализ кода отметил файлов и/или частиц идентификаторов игнорироваться. Обратитесь к примеры/цензура в репозитории для соответствующих R и Python кода.
5. Генерировать конкретные цифры эксперимент с использованием результатов анализа изображения, для каждого изображения хранятся в АККУРАТНЫЕ¹² запятыми текстовый файл в подкаталог результатов в указанный выходной каталог. Обратитесь к примеры/цифры/R и примеры/цифры/Python подкаталоги для примеров о том, как читать файлы результатов.

Результаты

Файлы, созданные
Этот процесс показан на рисунке 1 будет производить два файлов для каждого изображения проанализированы. Первый файл — запятая запятыми значения (CSV) текстовый файл, где каждая строка соответствует отдельных частиц и столбц?...

Обсуждение

Хотя системы анализа изображений достаточно надежными и КК шаги для обеспечения бедных изображения удаляются, надлежащее внимание конкретным вопросам в выборки, пластины подготовки и загрузки изображений может повысить точность данных и доли изображения, передавая КК.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% Bleach solution	Chlorox	31009	For workspace disinfection.
15 mL centrifuge tube with cap	Corning	430790	Per sample.
50 mL Erlenmeyer flask	Corning	4980-50	Other vessels are suitable so long as they can contain > 40 mL of sample and allow mixing
500 mL Kimax Bottle	Kimble-Chase	14395-50	Or otherwise sufficient for agar handling
Agar	BD	214010	Solid, to prepare 7.5% gel. 7 mL per sample.
Data analysis software	N/A	N/A	R or Python are suggested
Deionized water	N/A	N/A	Sufficient to prepare stain and agar. If unavailable, tap should be fine.
Desktop computer	N/A	N/A	Image analysis is not CPU intensive, any 'ordinary' desktop computer circa 2017 should be sufficient.
External hard drive	Seagate	STEB5000100	Not fully required, but extremely useful given the number an size of images. 2 or more TB of storage suggested.
FIJI	NIH	version 1.51d	Version is ImageJ core. Plugins are updated as of writing. Available at: https://imagej.net/Fiji/Downloads
GIT	Open Source	version 2.19.1 or later	Available at: https://git-scm.com/
Image capture software	ToupView	version 3.7.5177	Any compatible with camera, may come with camera. Should allow saving TIFF images with spatial calibration data.
Mechanical (X/Y) Stage	OMAX	A512	Not fully required, but greatly aids image acquisition.
Methylene blue	Fisher	M291-100	Solid, to prepare 1% w/v solution. 5 uL solution per sample.
Microscope camera	OMAX	A35140U	Any digitial camera compatible with microscope. Resolution providing at least 5 um per pixel at 10x magnification and a dynamic range of at least 8 bits per pixel per color channel is suggested.
Optical Stage Micrometer	OMAX	A36CALM1	Or otherwise sufficient for spatial calibration.
Petri dish, 100 mm	Fisher	FB0875712	1 per sample.
PPE	N/A	N/A	Standard lab coat, gloves, and eyewear.
Sparmoria macro	NCSU	version 0.2.1	Available at github repository : https://github.com/joeweaver/SParMorIA-Sludge-Particle-Morphological-Image-Analysis
Stereo/dissecting microscope	Nikon	SMZ-2T	Should provide 10 to 20x magnficiation and allow digital photos either with a buit-in camera or profide a mounting point for a CCD.