Messung von Form und Größe der Belebtschlamm Partikel unbeweglich in Agar mit einer Open-Source-Software-Pipeline

Zusammenfassung

Die Größe und Form der Partikel im Belebtschlamm sind wichtige Parameter, die mit unterschiedlichen Methoden gemessen werden. Ungenauigkeiten ergeben sich aus nicht-repräsentative Probenahme, suboptimalen Bildern und subjektive Analyseparameter. Um diesen Fehler zu minimieren und Messung zu erleichtern, präsentieren wir ein Protokoll angeben, jeden Schritt, einschließlich einer open-Source-Software-Pipeline.

Zusammenfassung

Experimentelle Bioreaktoren, wie z. B. die Behandlung von Abwasser enthalten Partikel, deren Größe und Form wichtige Parameter sind. Beispielsweise können die Größe und Form des Belebtschlammes Flocken geben die Bedingungen an den Microscale und auch direkt beeinflussen, wie gut der Schlamm in einem Nachklärbecken absetzt.

Partikelgröße und-Form sind beide fälschlich "einfachen" Messungen. Viele subtile Probleme, oft unadressierte in informelle Protokolle können entstehen, wenn Probenahme, Bildgebung und Partikel zu analysieren. Probenahmeverfahren voreingenommen sein können oder nicht genügend statistische Strom liefern. Die Proben selbst können nur schlecht erhalten oder Veränderung während der Ruhigstellung zu unterziehen. Bilder möglicherweise nicht von ausreichender Qualität sind; überlappende Partikel, produzieren Schärfentiefe, Vergrößerungsstufe, und verschiedene Geräusche alle schlechte Ergebnisse. Schlecht spezifizierten Analyse kann Vorurteile, wie durch die manuelle Bild Schwellwerte und Segmentierung einführen.

Erschwinglichkeit und Durchsatz sind neben Reproduzierbarkeit wünschenswert. Eine erschwingliche, hoher Durchsatz-Methode können häufigere Partikel Messung, viele Bilder, die mit Tausenden von Partikel produzieren. Eine Methode, die preiswerte Reagenzien, eine gemeinsame sezierenden Mikroskop und frei verfügbaren open-Source-Analyse-Software ermöglicht wiederholbare, zugänglich, reproduzierbare und teilweise automatisiert Versuchsergebnisse. Darüber hinaus kann das Produkt einer solchen Methode gut formatierte, klar definierte und Datenanalyse-Software, Lockerung in Laboranalysen und Datenaustausch zwischen den Labors leicht verständlich sein.

Präsentieren wir eine Protokoll, das beschreibt die notwendigen Schritte um solch ein Produkt herzustellen, einschließlich: probieren, probieren, Vorbereitung und Immobilisierung in Agar, digitale Bildaufnahme, digitale Bildanalyse und Beispiele der Experiment-spezifische Abbildung Generation aus der die Ergebnisse der Analyse. Wir haben auch eine Open-Source-Daten-Analyse-Pipeline für dieses Protokoll aufgenommen.

Einleitung

Der Zweck dieser Methode ist, eine klar definierte, reproduzierbare und teilweise automatisiert Verfahren zur Bestimmung der Größe und Form-Distributionen von Partikeln in Bioreaktoren, besonders diejenigen mit Belebtschlamm Flocken und aerobe Granulat^{1 , 2}. waren die Beweggründe für diese Methode zur Verbesserung der Erschwinglichkeit, Einfachheit, Durchsatz und Wiederholbarkeit unserer bestehenden internen Protokollen^3,4, Partikel-Messung für andere zu erleichtern und Austausch erleichtern und Vergleich der Daten.

Es gibt zwei große Kategorien von Messung Partikelanalyse - direct imaging und schlussfolgernde Methoden mit solchen Qualitäten als Lichtstreuung⁵. Obwohl folgernd Methoden automatisiert werden können und großen Durchsatz haben, ist die Ausrüstung teuer. Darüber hinaus während folgernd Methoden der gleicher Größe eines Teilchens⁶genau bestimmen können, bieten sie keine detaillierte Form Informationen⁷.

Wegen der Notwendigkeit der Shape-Daten haben wir unsere Methode auf direkte Bildgebung basiert. Während einige Hochdurchsatz-bildgebenden Verfahren vorhanden sind, müssen sie traditionell entweder teure kommerzielle Hardware oder Sonderlösungen gebauten^8,9. Unsere Methode wurde entwickelt, um gemeinsame, kostengünstige Hardware und Software, die zwar eine Reduzierung des Durchsatzes, leiden weit mehr Partikelbilder als das Minimum für viele Analysen¹⁰benötigt produziert zu beschäftigen.

Bestehende Protokolle können keinen wichtigen Probenahme und Bild Erwerb Schritte angeben. Andere Protokolle können manuelle Schritte angeben, die subjektive Voreingenommenheit (z. B. ad-hoc-Schwellwerte¹¹) einzuführen. Eine klar definierte Methode, die Probenahme, Immobilisierung und Bild Erwerb Schritte kombiniert mit frei verfügbaren Analysesoftware angibt wird im Labor Bildanalyse und Vergleiche zwischen den Labors verbessern. Ein wesentliches Ziel dieses Protokolls ist, einen Workflow und Tools, die aus verschiedenen Labors für die gleiche Probe zu reproduzierbaren Ergebnissen führen sollten.

Neben der Normalisierung des Analyseprozesses Bild, werden die Daten durch diese Pipeline produziert in einem klar definierten, gut formatierte Datei¹² geeignet für den Einsatz von beliebten Daten Analyse Pakete^13,14, Lockerung Experiment aufgezeichnet. spezifische Analysen (z. B. benutzerdefinierte Zahl Generation) und erleichtern den Datenaustausch zwischen Labors.

Dieses Protokoll wird vor allem für Forscher vorgeschlagen, die Partikel-Shape-Daten benötigen, haben keinen Zugang zu schlussfolgernde Methoden, wollen nicht ihre eigenen Bild-Analyse-Pipeline zu entwickeln, und ihre Daten einfach mit anderen teilen möchten

Protokoll

1. sammeln Sie Proben für die Partikelanalyse

1. Bestimmen die Probenmenge für bestimmte Reaktoren, die genügend Partikel für statistische Analysen¹⁰ produzieren (> 500) Partikel Überschneidungen zu vermeiden.
   1. Davon ausgehen Sie, dass eine Reihe von 0,5 bis 2 mL pro Probe des gemischten Schnaps ausreichend für Belebtschlamm Proben mit einer gemischten Alkohol ausgesetzt Feststoffe (MLSS) zwischen 250 und 5.000 mg/L.
   2. Ansonsten bereiten Sie drei Test-Agarplatten mit 0,5, 2 und 5 mL der Probe (Stufen 1,2 bis 2,7).
   3. Visuell zu schätzen, (falls vorhanden) die beste Probenvolumina in Schritt 1.1 aufgeführten Kriterien erfüllen.
   4. Wenn Partikel immer noch für die 0,5 mL Probe überschneiden, wiederholen Sie die Schritte 1.1.2 und 1.1.3 mit drei 0,5 mL Proben verdünnt mit einer zusätzlichen 0,5, 1 und 2 mL Phosphat gepufferte Kochsalzlösung zu prüfen, inwieweit eine 0,5 mL Probe vor Schritt 2.1 verdünnt werden muss.
      Hinweis: Schritte 1.1 − 1.1.4 müssen nur einmal pro Experiment durchgeführt werden, oder wenn der Reaktor Änderung Inhalt, so dass nachfolgende Messungen nicht mehr aufgeführten Kriterien erfüllen in Schritt 1.1.
2. Erwerben Sie eine repräsentative Stichprobe von einem gut durchmischten Teil des Reaktors durch aufmerksamkeitsstarke ~ 40 mL in ein Becherglas oder 50 mL Zentrifugenröhrchen, vorsichtig mischen und sofort Gießen der ermittelten Probenvolumen von dem gut durchmischten greifen in ein Zentrifugenröhrchen 15 mL. Verdünnen der Probe notwendig, da durch Schritt 1.1.4 bestimmt.
   Hinweis: Das Protokoll kann hier angehalten und die Probe kann für bis zu 48 Stunden im Kühlschrank (4 ° C) gelagert werden. Die Probe nicht einfrieren.
   Vorsicht: gemeinsame Bewahrung Medien (z. B. Formaldehyd/Formamid) sind nicht geeignet. Die große Oberfläche der Platte, in Kombination mit den offenen Behälter von der Lichtquelle und potentiell schlecht belüfteten Mikroskopie Einrichtung Wärmeproduktion unnötig gefährliche Bedingungen für wenig Gewinn an Bildqualität.

2. bereiten Sie Agarplatten gefärbt, immobilisierten Partikel

1. Jede Probe 5 µL 1 % (w/V) Methylenblau hinzufügen dann verschließe und sanft Invertiere 3 zumindest zeitweise zu mischen. Lassen Sie Proben, für mindestens 5 aber nicht mehr als 30 Minuten bei Raumtemperatur zu beflecken.
2. Ca. 10 mL pro Probe von 7,5 % (w/V) Agar in entionisiertem Wasser vorzubereiten.
   Hinweis: Agar kann vor der Zeit produziert und auf unbestimmte Zeit gespeichert, wenn sterilisiert. Agarose kann ersetzt werden, aber Bilder nicht wesentlich verbessert.
3. Schmelzen Sie Agar mit Mikrowelle oder Wasserbad und leicht vor der Anwendung abkühlen lassen. Stellen Sie sicher der Agar vollständig geschmolzen ist und leicht gießt. Feste Kügelchen Agar färbt anders produzieren Bilder in schlechter Qualität.
4. Ausreichende geschmolzene 7,5 % (w/V)-Agar auf Zentrifugenröhrchen bringen das gesamte Rohr Volumen zwischen 6,5 und 9 mL zu übertragen.
5. Rekapitulieren Sie Zentrifuge Röhren und invertieren Sie sanft mindestens 3 Mal mischen.
6. Und zeigt die Kappe weg von sich selbst oder in einer Kapuze, öffnen Sie die Kappe. Gießen Sie den Rohr-Inhalt in einem 100 mm Kunststoff Petrischale während sanft schaukelnden das Gericht um eine volle, glatte Beschichtung und eine optisch gleichmäßige Verteilung der Teilchen zu erreichen.
   Achtung: Die Wärme aus dem Agar kann einen leichten Überdruck im Rohr führen. Oft erzeugt ein hörbares Zischen und hat das Potenzial, kleine Tropfen der heißen Agar zu vertreiben.
7. Lassen Sie die Platten für mindestens 5 Minuten, bis der Agar erstarrt bei Zimmertemperatur abkühlen.
   Hinweis: Das Protokoll kann hier angehalten werden. Store vernickelt invertiert und versiegelt (z.B. in einen abdichtenden Plastiksack oder mit Paraffin Film) für bis zu 48 Stunden im Kühlschrank (4 ° C).

(3) erwerben Sie Partikelbilder mit einem Stereomikroskop und Digitalkamera

1. Legen Sie die unbedeckten Platte aufgedeckte auf Mikroskoptisch eines Stereomikroskops in der Lage, 10 X, 20 X Vergrößerung. Beleuchten Sie die Probe von unten mit gleichmäßigen, diffusen Licht mit Geräten wie z. B. eine LED Beleuchtung Stand oder leichte Platte.
2. Öffnen Sie die Image-Capture-Software, sicherzustellen Sie, dass das Mikroskop Strahlengang Fotoeingestellt ist, und klicken Sie auf die entsprechende Kamera aus der Kameraliste.
3. Einstellen Sie das Mikroskop so, dass mehrere Partikel in der Software in der Brennebene mit großen, gut definierte Ränder angezeigt werden. Verwenden Sie eine Vergrößerung von 10-20 X, um Partikel messen und gleichzeitig relativ tief Brennebene.
   1. Vorübergehend entfernen Sie die Agarplatte und platzieren Sie der Mikrometer auf der Bühne zu. Einstellen Sie feine Schärfe, bis die Abstufungen auf den Mikrometer stark konzentriert in der Bild-Capture-Software angezeigt werden.
   2. Wenn nicht vorher kalibriert, Aufzeichnen der Pixel Mikro-Verhältnis für die aktuelle Vergrößerung.
      1. Stellen Sie den Zoom auf 100 %, indem Sie auf Zoom > Originalgröße und wählen Sie Optionen > kalibrieren richten Sie dann die rote Kalibrierung Bar im großen Ansichtsfenster entlang der Längsachse der Mikrometer mit den vertikalen Balken zentriert auf die 0 und 200 µm-Abstufungen. Geben Sie im Dialogfeld kalibrieren den aktuellen Vergrößerungsstufe und tatsächliche Länge von 200 µm.
   3. Wenn bereits kalibriert wählen Sie Vergrößerung aus der Menüleiste und wählen Sie die aktuelle Vergrößerung Ebene und die Kalibrierung zu bestätigen.
      1. Wählen Sie Messungen > Zeile > willkürliche Linie. Klicken Sie auf den Schnittpunkt der 0 Graduierung und Längsachse der Mikrometer. Klicken Sie erneut auf die Kreuzung 200 und die lange Achse. A korrekte Kalibrierung sollte angezeigt werden, etwa 200 µm. löschen Sie die Zeile durch anklicken, ENTF drücken, und auf dem Feld zur Bestätigung drücken Ja .
         Hinweis: Die Anweisungen für die Auswahl der Kamera und Kalibrierung sind spezifisch für die Software für diese Hardware. Ähnliche Funktionen sollten in anderen imaging-Software verfügbar sein. Ziel ist es, die Pixel Mikron-Verhältnis des Bildes für genaue Partikelgrößenmessung bestimmen.
4. Ersetzen Sie der Agarplatte und passen Sie die Feinfokussierung um maximale Details in der imaging-Software zu erreichen.
5. Einstellen Sie die imaging-Software so, dass maximale Bildqualität erreicht wird.
   1. Erhöhen Sie die Bit-Tiefe, der zulässige Höchstwert, indem Sie das Optionsfeld im Bedienfeld " Bit-Tiefe " der Kamera Seitenleiste auswählen. Stellen Sie die Software Graustufenbilder zu erwerben, indem Sie das entsprechende Optionsfeld im Bedienfeld " Farbe/grau " von der Kamera -Seitenleiste auswählen.
   2. Offenen Seitenleiste Platten zwischen Belichtung und Histogramm zusammenbrechen. Reduzieren Sie die Verstärkung auf 1.0 und erhöhen Sie die Belichtung zu, bis ein klares Bild erscheint im Ansichtsfenster und bis das Histogramm erscheint als eine Distribution, die nicht von beiden Enden des Feldes Histogramm befestigt ist.
   3. Passen Sie das Histogramm, über zu vermeiden und Unterbelichtung. Schieben Sie im Bedienfeld "Histogramm" von der Kamera-Seitenleiste der linken Begrenzung des Histogramms auf knapp außerhalb der niedrigsten Werte und Rechte Begrenzung auf knapp außerhalb der höchsten Werte.
6. Speichern Sie das Bild als eine unkomprimierte TIFF, einschließlich Vergrößerung Informationen in den Bild-Metadaten, mit Hilfe der Datei > Speichern als Dialogfeld, das TIFF-Format auswählen und sicherstellen, dass Feld mit Kalibrierungsinformationen speichern wird geprüft.
   Hinweis: Bild-Metadaten, einschließlich der räumlichen Kalibrierung speichern variieren zwischen Erwerb Programme. Fidschi¹⁵, die zugrunde liegende Software, die von der Pipeline verwendet versteht gebräuchlichsten Varianten. Die wichtige Informationen zu erfassen ist der Pixelhöhe, Breite und damit verbundenen Stck.
7. Verwenden entweder eine mobile Bühne oder manuelles Verschieben der Platte selbst, wählen Sie einen anderen Bereich, der früheren Bilder, nach einem Weg, der abwechselnd rechts-links- und rechts-nach-links als eine bewegt sich die Platte nicht überlappt; auch bekannt als ein "Rasenmäher Suchmuster". Wiederholen Sie Schritt 3,6 bis genügend Bilder produziert werden, um mindestens 500 optisch geschätzte Partikel erfassen mehr sind besser.
   Hinweis: Alternativen Muster (z. B.., runden, zufällige) sind akzeptabel, aber sollten gemeldet werden. Erwerb von mehreren überlappenden Bildern für Kombination in ein Mosaik über digitale Nähte erzeugt eine Dateigröße die downstream-Processing und Artefakte aus Nähten stark behindert eingeführt werden kann und wird derzeit nicht empfohlen.
8. Platten bis nach Bildanalyse für potenzielle Follow-up-Bildgebung zu behalten. Nach dem endgültigen Imaging, je nach Bedarf für Biomüll entsorgen.

(4) messen und analysieren von Partikel-Silhouetten

1. Die gewünschte Bild-Analyse-Software-Pakete installieren
   1. Installieren von Fidschi (eine erweiterte Version des National Institutes of Health ImageJ v1.52e gemäß den Anweisungen an: https://imagej.net/Fiji/Downloads
   2. Installieren Sie Git, falls nicht bereits vorhanden, indem Sie die Anweisungen auf: https://git-scm.com/downloads
   3. Erwerben Sie der Partikel Analysecode von durch Klonen der Git Repository¹⁶.
      1. In der Befehlszeile zum Abrufen der neuesten Version des Codes eingeben:
         Git Clone https://github.com/joeweaver/SParMorIA-Sludge-Particle-Morphological-Image-Analysis.git
         1. Installieren der Analyse folgende Code die Anweisungen in der README.md-Textdatei im obersten Verzeichnis des geklonten Repository gefunden.
            Hinweis: Mit Git wird bevorzugt, da es die neueste Version des Codes automatisch abgerufen werden. Wenn Git nicht verfügbar ist, ist es auch möglich, den Code als Zip-Datei auf die Release-Seite auf download: https://github.com/joeweaver/SParMorIA-Sludge-Particle-Morphological-Image-Analysis/releases
   4. Bearbeiten einer Textdatei Auflisten der Verzeichnisse zusammen mit optionalen Parameter verarbeitet werden. Sie finden Sie im Unterverzeichnis Beispiele/Analyse um eine Liste der Parameter und Beispiele.
2. Führen Sie die Analyse in der Befehlszeile, indem Sie eingeben:
   < Fidschi-Pfad > \ImageJ-win64.exe--console - Makro SParMorIA-SludgeParticle_Morphological_Image_Analysis < Paramsfile >
   wo < Fidschi-Pfad > ist das Verzeichnis, in dem ImageJ-win64.exe befindet, und < Paramsfile > die Lage der Textdatei, in der Analyse Einrichtung beschrieben
   Hinweis: Der Name der ausführbaren Datei kann abweichen, je nachdem, welches Betriebssystem Fidschi auf installiert ist. Je nach Anzahl und Größe der Bilder die Analyse kann ein paar Minuten zu Stunden dauern und wird automatisch ausgeführt.
3. Durchführen einer Qualitätskontrolle
   1. Untersuchen Sie die Qualitätskontrolle-Dateien befinden sich im Unterverzeichnis "Overlay" von der angegebenen Ausgabeverzeichnis. Beachten Sie die Bilder mit der fadenscheinigen, verpasste und schlecht aufgenommene Partikel, nur offensichtlich als schattierte Umrisse, die Hintergrund nicht übereinstimmen. Beispiele für solche finden Sie in Abbildung 3 . Die Partikeldaten sind nun bereit für Experiment-spezifische Analyse Abbildung Generation.
4. Lehnen Sie entweder ganze Platten oder einzelne Partikel durch die Angabe in den Analysecode bekannten Dateien und/oder Partikel-IDs ignoriert werden. Siehe Beispiele/Zensur in das Repository für entsprechende R und Python-Code.
5. Generieren Sie Experiment konkrete Zahlen über die Bild-Analyse-Ergebnisse für jedes Bild werden in einer ordentlich¹² Komma getrennte Textdatei im Unterverzeichnis "Ergebnisse" von der angegebenen Output-Verzeichnis gespeichert. Beziehen sich auf die Beispiele/Zahlen/R und Beispiele/Zahlen/Python Unterverzeichnisse für Beispiele dafür, wie die Ergebnisdateien zu lesen.

Ergebnisse

Generierte Dateien
Die in Abbildung 1 dargestellten Prozess erzeugt zwei Dateien pro Bild analysiert. Die erste Datei ist ein Komma getrennt Wert (CSV) Text-Datei, wo jede Zeile entspricht einer einzelnen Teilchen und die Spalten zu beschreiben verschiedene Partikel Metriken wie Fläche, Rundheit und Solidität, und ImageJ manuelle¹⁷definiert. Beispiel-CSV-Dateien sind als ergänzende Informationen und Beispiele/Dat...

Diskussion

Obwohl die Bild-Analyse-System ziemlich robust ist und QC Schritte unternommen, um sicherzustellen, dass schlechte Bilder entfernt sind, kann angemessene Aufmerksamkeit auf konkrete Fragestellungen in der Probenahme, Platte Vorbereitung und Bildaufnahme sowohl die Richtigkeit der Daten und der Anteil der verbessern Bilder vorbei QC.

Probenahme-Konzentration
Vorausgesetzt, dass eine repräsentative Probe entnommen worden, ist der wichtigste Schritt um sicherzustellen, dass g...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% Bleach solution	Chlorox	31009	For workspace disinfection.
15 mL centrifuge tube with cap	Corning	430790	Per sample.
50 mL Erlenmeyer flask	Corning	4980-50	Other vessels are suitable so long as they can contain > 40 mL of sample and allow mixing
500 mL Kimax Bottle	Kimble-Chase	14395-50	Or otherwise sufficient for agar handling
Agar	BD	214010	Solid, to prepare 7.5% gel. 7 mL per sample.
Data analysis software	N/A	N/A	R or Python are suggested
Deionized water	N/A	N/A	Sufficient to prepare stain and agar. If unavailable, tap should be fine.
Desktop computer	N/A	N/A	Image analysis is not CPU intensive, any 'ordinary' desktop computer circa 2017 should be sufficient.
External hard drive	Seagate	STEB5000100	Not fully required, but extremely useful given the number an size of images. 2 or more TB of storage suggested.
FIJI	NIH	version 1.51d	Version is ImageJ core. Plugins are updated as of writing. Available at: https://imagej.net/Fiji/Downloads
GIT	Open Source	version 2.19.1 or later	Available at: https://git-scm.com/
Image capture software	ToupView	version 3.7.5177	Any compatible with camera, may come with camera. Should allow saving TIFF images with spatial calibration data.
Mechanical (X/Y) Stage	OMAX	A512	Not fully required, but greatly aids image acquisition.
Methylene blue	Fisher	M291-100	Solid, to prepare 1% w/v solution. 5 uL solution per sample.
Microscope camera	OMAX	A35140U	Any digitial camera compatible with microscope. Resolution providing at least 5 um per pixel at 10x magnification and a dynamic range of at least 8 bits per pixel per color channel is suggested.
Optical Stage Micrometer	OMAX	A36CALM1	Or otherwise sufficient for spatial calibration.
Petri dish, 100 mm	Fisher	FB0875712	1 per sample.
PPE	N/A	N/A	Standard lab coat, gloves, and eyewear.
Sparmoria macro	NCSU	version 0.2.1	Available at github repository : https://github.com/joeweaver/SParMorIA-Sludge-Particle-Morphological-Image-Analysis
Stereo/dissecting microscope	Nikon	SMZ-2T	Should provide 10 to 20x magnficiation and allow digital photos either with a buit-in camera or profide a mounting point for a CCD.