Medindo a forma e o tamanho das partículas de lodo ativado imobilizada em ágar com um Pipeline de Software de código aberto

Resumo

O tamanho e forma das partículas em lamas activadas são parâmetros importantes que são medidos através de diferentes métodos. Imprecisões decorrem de amostragem não-representativo, imagens de qualidade inferior e parâmetros de análise subjetiva. Para minimizar esses erros e facilitar a medição, apresentamos um protocolo especificando cada passo, incluindo um pipeline de software de código aberto.

Resumo

Biorreatores experimentais, tais como aqueles tratamento de águas residuais, contêm partículas cujo tamanho e forma são parâmetros importantes. Por exemplo, o tamanho e a forma de flocos de lodo ativado podem indicar as condições para a microescala e também diretamente afetar bem como o lodo se instala um clarificador.

Forma e tamanho de partícula são as duas medições enganadoramente 'simples'. Muitas questões sutis, muitas vezes sem resposta nos protocolos informais, podem surgir quando a amostragem de imagem e análise de partículas. Métodos de amostragem podem ser tendencioso ou não fornecem energia suficiente estatística. As amostras se podem ser mal conservadas ou sofrem alteração durante a imobilização. As imagens podem não ser de qualidade suficiente; sobreposição de partículas, profundidade de campo, nível de ampliação e vários ruído pode tudo produzir maus resultados. Análise mal especificado pode apresentar viés, como que produzido por limiarização de imagem manual e segmentação.

Acessibilidade e throughput são desejáveis ao lado de reprodutibilidade. Um método acessível, alta taxa de transferência pode permitir mais frequente medição de partículas, produzindo muitas imagens contendo milhares de partículas. Um método que utiliza reagentes de baixo custo, um microscópio comum de dissecação e software de análise de código aberto disponível gratuitamente permite resultados experimentais repetíveis, acessíveis, reprodutíveis e parcialmente automatizada. Além disso, o produto de tal método pode ser bem formatada, bem definidos e facilmente compreendida pelo software de análise de dados, facilitando as análises em laboratório e dados de compartilhamento entre laboratórios.

Apresentamos um protocolo em que detalha os passos necessários para produzir um produto desse tipo, incluindo: amostragem, preparação e imobilização em ágar, aquisição de imagem digital, análise de imagem digital e exemplos de geração de experiência específica figura da amostra a resultados da análise. Nós também incluímos um pipeline de análise de dados de código aberto para suportar este protocolo.

Introdução

A finalidade desse método é fornecer um método bem definido, repetível e parcialmente automatizada para determinar as distribuições de tamanho e forma das partículas em biorreatores, particularmente aqueles que contêm flocos de lodo ativado e grânulos aeróbio^{1 , 2}. a lógica por trás deste método melhorar a acessibilidade, a simplicidade, a taxa de transferência e, repetibilidade dos nossos actuais protocolos in-house^3,4, facilitar a medição de partículas para os outros e facilitar a partilha e comparação de dados.

Existem duas grandes categorias de análise de medição de partículas - direto de imagem e inferencial métodos usando tais qualidades como espalhamento de luz⁵. Embora métodos inferencial podem ser automatizados e têm grande rendimento, o equipamento é caro. Além disso, enquanto métodos inferencial podem determinar com precisão o tamanho equivalente de uma partícula⁶, eles não fornecem informações de forma detalhada⁷.

Devido à necessidade de dados da forma, baseamos nosso método de direta de imagens. Embora existam alguns métodos da imagem latente de alta produtividade, solicitaram-se tradicionalmente caro hardware comercial ou soluções personalizadas construídas^8,9. Nosso método foi desenvolvido para empregar comum, acessível de hardware e software que, embora sofrendo uma redução na taxa de transferência, produz imagens de partículas muito mais do que o mínimo necessário para muitas análises¹⁰.

Protocolos existentes não podem especificar importante amostragem e etapas de aquisição de imagem. Outros protocolos podem especificar etapas manuais que introduzir viés subjetivo (como ad-hoc limiarização¹¹). Um método bem definido que especifica a amostragem, imobilização e imagem etapas de aquisição, combinadas com o software de análise livremente disponível irá melhorar tanto a análise de imagem dentro de laboratório e comparações entre laboratórios. Dos principais objetivos do presente protocolo é fornecer um fluxo de trabalho e ferramentas que devem conduzir a resultados reprodutíveis de laboratórios diferentes para a mesma amostra.

Além de normalizar o processo de análise de imagem, os dados produzidos por este gasoduto são gravados em um arquivo bem definidas e bem formatada¹² adequado para uso por populares dados análise pacotes^13,14, facilitando a experiência análises específicas (tais como geração de figura personalizada) e dados facilitando compartilhamento entre laboratórios.

Este protocolo é especialmente sugerido para pesquisadores que necessitam de dados de forma de partícula, não têm acesso aos métodos inferencial, não pretendo desenvolver seu próprio pipeline de análise de imagem e gostaria de compartilhar seus dados facilmente com outros

Protocolo

1. coletar amostras para análise de partículas

1. Determinar o volume de amostra de reatores específicos que irá produzir partículas suficientes para análise estatística¹⁰ (> 500), evitando a sobreposição de partícula.
   1. Suponha que um intervalo de 0,5 a 2 mL por amostra do licor misto é suficiente para as amostras de lodo ativado com sólidos um licor misto suspenso (saudades) entre 250 e 5.000 mg/L.
   2. Caso contrário, prepare-se três placas de ágar de teste usando 0.5, 2 e 5 mL de amostra (etapas 1.2 através de 2.7).
   3. Visualmente, estimar quais (se houver) volumes de amostra melhores atendem aos critérios listados no passo 1.1.
   4. Se partículas sobrepõem-se, ainda, para a amostra de 0,5 mL, repita as etapas 1.1.2 e 1.1.3 com três amostras de 0,5 mL, diluídas com um adicional de 0,5, 1 e 2 mL de tampão fosfato solução salina para determinar o grau ao qual uma amostra de 0,5 mL deve ser diluída antes passo 2.1.
      Nota: Passos 1.1 − 1.1.4 só precisa ser executada uma vez por experiência, ou se o reator Sumário mudança tal que medições posteriores já não atendem aos critérios listados no passo 1.1.
2. Adquira uma amostra representativa de uma porção bem misturada do reator por agarrando ~ 40 mL em um béquer ou tubo de centrífuga de 50 mL, misturando delicadamente e imediatamente, despejando o volume de determinada amostra do agarrar bem misturado em um tubo de centrífuga de 15 mL. Dilua a amostra, é necessária, conforme determinado pelo passo 1.1.4.
   Nota: O protocolo pode ser pausado aqui e a amostra pode ser armazenada sob refrigeração (4 ° C) por até 48 horas. Não congele a amostra.
   Precaução: mídia comum de preservação (por exemplo, formaldeído/formamida) não é adequadas. A grande área de superfície da placa, em combinação com recipiente aberto, o calor da fonte de luz e potencialmente mal ventiladas microscopia instalação produzir desnecessariamente perigosas condições de pouco ganho em qualidade de imagem.

2. preparar placas de ágar de partículas manchadas, imobilizadas

1. Adicionar 5 µ l de azul de metileno 1% (p/v) para cada amostra, em seguida, tampe e inverta suavemente ao menos 3 vezes para misturar. Permitir que amostras a mancha pelo menos 5 mas não mais que 30 minutos à temperatura ambiente.
2. Prepare-se cerca de 10 mL por amostra do ágar de 7,5% (p/v) em água desionizada.
   Nota: Ágar pode ser produzido antes do tempo e armazenado indefinidamente se esterilizados. Agarose pode ser substituído, mas não melhora substancialmente imagens.
3. Derreter o ágar usando um microondas ou água de banho e deixar arrefecer ligeiramente antes de usar. Certifique-se o ágar é completamente derretido e derrama-se facilmente. Glóbulos de sólidos do ágar mancharão diferente, produzindo imagens de má qualidade.
4. Transferi o suficiente ágar derretido de 7,5% (p/v) para o tubo de centrifugação para trazer o volume total do tubo para entre 6,5 e 9 mL.
5. Tubos de centrífuga de recapitular e inverta suavemente pelo menos 3 vezes para misturar.
6. Ao apontar a tampa longe de si mesmo ou de um capuz, abra a tampa. Despeje o conteúdo do tubo em uma placa de Petri de plástico de 100mm enquanto balançando suavemente o prato para obter um revestimento completo, liso e uma visualmente uniforme distribuição de partículas.
   Atenção: O calor do agar pode produzir uma ligeira sobrepressão no tubo. Isso muitas vezes produz um ruído audível e tem o potencial para expelir pequenas gotículas de ágar quente.
7. Permitir que as placas esfriar em temperatura ambiente pelo menos 5 minutos, até o ágar solidifies.
   Nota: O protocolo pode ser uma pausa aqui. Loja chapeada invertido e selado (por exemplo, em um saco plástico da selagem ou com a película de parafina) para até 48 horas sob refrigeração (4 ° C).

3. adquirir imagens de partículas usando uma câmera digital e microscópio estereoscópico

1. Coloque a placa de descoberta de face para cima no palco de um estereomicroscópio microscópio capaz de 10x para ampliação de 20 x. Ilumine a amostra de baixo com luz difusa, mesmo utilizando equipamentos como um carrinho de Iluminador LED ou luz de placa.
2. Abra o software de captura de imagem, verifique o caminho de luz do microscópio é definido como fotoe clique sobre a câmera apropriada na lista de câmera.
3. Ajuste o microscópio para que múltiplas partículas aparecem no software no plano focal, com bordas bem definidas, grandes. Use uma ampliação de 10-20 x para medir partículas mantendo um plano relativamente profundo focal.
   1. Temporariamente, retire a placa de ágar e colocar o micrômetro no palco. Ajuste o foco fino até as graduações no micrômetro aparecem fortemente concentradas no software de captura de imagem.
   2. Se não previamente calibrado, grave o pixel à relação micro para a ampliação atual.
      1. Definir o zoom para 100% clicando Zoom > tamanho real e selecione Opções > calibrar então alinhar a barra vermelha calibração na viewport principal ao longo do eixo do micrômetro, com as barras verticais centrados sobre as graduações de 0 e 200 µm. Na caixa de diálogo de calibrar , indicar o atual nível de ampliação e comprimento real de 200 µm.
   3. Se já calibrado selecione ampliação na barra de menus, e selecionar a ampliação atual nível e confirma a calibração.
      1. Selecione medições > linha > arbitrário linha. Clique sobre a interseção entre a graduação 0 e o longo eixo do micrômetro. Clique novamente no cruzamento em 200 e o longo eixo. A correta calibração deve exibir aproximadamente 200 µm. apagar a linha clicando sobre ele, pressionando delete, e pressionando Sim na caixa de confirmação.
         Nota: As instruções dadas para selecionar a câmera e a calibração são específicas para o software usado para este hardware. Funções similares devem estar disponíveis em outro software de imagem. O objetivo é determinar o pixel à relação de mícron da imagem para a medição de tamanho de partícula precisos.
4. Substitua a placa de ágar e ajustar o foco fino para alcançar o máximo de detalhe no software da imagem latente.
5. Ajuste o software de imagem para que a máxima qualidade de imagem é alcançada.
   1. Aumente a profundidade de bits para o valor máximo permitido, selecionando o botão de opção no painel de Profundidade de bits da barra lateral da câmera . Ajustar o software para adquirir imagens em tons de cinza selecionando o botão de opção apropriado no painel Cor/cinza da barra lateral da câmera .
   2. Recolher todos os painéis lateral aberto entre a exposição e histograma. Reduzir o ganho de 1.0 e aumentar a exposição até uma imagem clara aparece na viewport e até o histograma aparece como uma distribuição que não é cortada por ambas as extremidades da caixa histograma.
   3. Ajuste o histograma para evitar a sobre e sub-exposição. No painel Histograma da barra lateral de câmera, deslize o limite esquerdo do histograma para fora os valores mais baixos e o limite certo para fora os valores mais altos.
6. Salve a imagem como um TIFF não comprimido, incluindo informações de ampliação nos metadados de imagem, usando o arquivo > salvar como caixa de diálogo, selecionar o formato TIFF e garantindo que a caixa salvar informações de calibração é verificado.
   Nota: Salvar metadados de imagem, incluindo calibração espacial, pode variar entre programas de aquisição. FIJI¹⁵, o software subjacente usado pelo pipeline, compreende as variantes mais comuns. As informações importantes para gravar é o pixel de altura, largura e unidade (s) associado.
7. Usando qualquer uma fase móvel ou mover manualmente a placa em si, selecione uma outra área, que não sobreposição de imagens anteriores, seguindo um caminho que alterna entre a esquerda para a direita e da direita para a esquerda como um se move para baixo a placa; também conhecido como um 'máquina de cortar relva padrão de pesquisa'. Repita a etapa 3.6 até imagens suficientes são produzidas para capturar pelo menos 500 partículas estimadas visualmente, mais são melhores.
   Nota: Padrões alternativas (por exemplo., circular, aleatório) são aceitáveis, mas devem ser relatados. Aquisição de múltiplas imagens sobrepostas para combinação em um mosaico digital produz costura através de um tamanho de arquivo resultante que dificulta grandemente a jusante processamento e artefatos de costura pode ser introduzido e não é recomendado atualmente.
8. Manter placas até depois da análise de imagem para a imagem latente potencial de acompanhamento. Após a imagem final, descarte como adequado para os resíduos biológicos.

4. medir e analisar silhuetas de partícula

1. Instalar os pacotes de software de análise de imagem necessária
   1. Instalar o FIJI (uma versão melhorada do ImageJ v1.52e do National Institutes of Health seguindo as instruções em: https://imagej.net/Fiji/Downloads
   2. Instalar o git, se não estiver presente, seguindo as instruções em: https://git-scm.com/downloads
   3. Adquira o código de análise de partículas de clonando o git Repositório¹⁶.
      1. Na linha de comando, recupere a versão mais recente do código digitando:
         git clone https://github.com/joeweaver/SParMorIA-Sludge-Particle-Morphological-Image-Analysis.git
         1. Instale o seguinte código de análise as instruções no arquivo de texto de README.md encontradas no diretório de nível superior do repositório clonado.
            Nota: Utilizando o git é preferido, como ele será automaticamente recuperar a versão mais recente do código. Se o git não está disponível, também é possível baixar o código como um arquivo zip na página do lançamento em: https://github.com/joeweaver/SParMorIA-Sludge-Particle-Morphological-Image-Analysis/releases
   4. Edite um arquivo de texto que lista os diretórios a serem processados, junto com parâmetros opcionais. Consulte o subdiretório de exemplos e análise para obter uma lista de parâmetros e exemplos.
2. Execute a análise na linha de comando digitando:
   < FIJI-PATH > \ImageJ-win64.exe - console - macro < paramsfile > SParMorIA-SludgeParticle_Morphological_Image_Analysis
   onde < FIJI-caminho > é o diretório em que se encontra ImageJ-win64.exe e < paramsfile > a localização do arquivo de texto descrevendo a instalação de análise
   Nota: O nome do executável pode variar, dependendo de qual sistema operacional FIJI está instalado. Dependendo do número e tamanho das imagens, a análise pode demorar alguns minutos a horas e será executado automaticamente.
3. Executar uma verificação de controle de qualidade
   1. Examine os arquivos de controle de qualidade, localizados no subdiretório do diretório de saída especificado de sobreposição. Observe imagens com espúrias, não atendidas e mal partículas capturadas, todo aparentes como contornos sombreados que não correspondem ao fundo. Consulte a Figura 3 para obter exemplos de tais. Os dados de partícula estão agora prontos para geração de figura de análise do experimento específico.
4. Rejeite toda placas ou partículas individuais, especificando o código de análise o notáveis arquivos e/ou partícula IDs para ser ignorado. Consulte exemplos/censura no repositório de código relevante R e Python.
5. Gere a experiência de figuras específicas usando os resultados de análise de imagem para cada imagem são armazenadas em um arquivo de texto separado vírgula arrumado¹² no subdiretório do diretório de saída especificado de resultados. Consulte os exemplos/figuras/R e exemplos/figuras/Python subdiretórios para obter exemplos de como ler os arquivos de resultados.

Resultados

Arquivos gerados
O processo ilustrado na Figura 1 produzirá dois arquivos por imagem analisados. O primeiro arquivo é uma vírgula separados arquivo de texto CSV (valores) onde cada linha corresponde a uma partícula individual e as colunas descrevem várias métricas de partículas, tais como área, circularidade e solidez e definidos no manual o ImageJ.¹⁷. Arquivos CSV de exemplo estão incluídos como informaç...

Discussão

Embora o sistema de análise de imagem é bastante robusto e QC medidas para assegurar imagens pobres são removidas, devida atenção a questões específicas na amostragem, preparação de chapa e aquisição de imagens pode melhorar tanto a precisão dos dados e a proporção de imagens passando QC.

Concentração de amostragem
Supondo que tomou-se uma amostra representativa, o passo mais importante é assegurar a partículas suficientes para análise eficiente e represe...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% Bleach solution	Chlorox	31009	For workspace disinfection.
15 mL centrifuge tube with cap	Corning	430790	Per sample.
50 mL Erlenmeyer flask	Corning	4980-50	Other vessels are suitable so long as they can contain > 40 mL of sample and allow mixing
500 mL Kimax Bottle	Kimble-Chase	14395-50	Or otherwise sufficient for agar handling
Agar	BD	214010	Solid, to prepare 7.5% gel. 7 mL per sample.
Data analysis software	N/A	N/A	R or Python are suggested
Deionized water	N/A	N/A	Sufficient to prepare stain and agar. If unavailable, tap should be fine.
Desktop computer	N/A	N/A	Image analysis is not CPU intensive, any 'ordinary' desktop computer circa 2017 should be sufficient.
External hard drive	Seagate	STEB5000100	Not fully required, but extremely useful given the number an size of images. 2 or more TB of storage suggested.
FIJI	NIH	version 1.51d	Version is ImageJ core. Plugins are updated as of writing. Available at: https://imagej.net/Fiji/Downloads
GIT	Open Source	version 2.19.1 or later	Available at: https://git-scm.com/
Image capture software	ToupView	version 3.7.5177	Any compatible with camera, may come with camera. Should allow saving TIFF images with spatial calibration data.
Mechanical (X/Y) Stage	OMAX	A512	Not fully required, but greatly aids image acquisition.
Methylene blue	Fisher	M291-100	Solid, to prepare 1% w/v solution. 5 uL solution per sample.
Microscope camera	OMAX	A35140U	Any digitial camera compatible with microscope. Resolution providing at least 5 um per pixel at 10x magnification and a dynamic range of at least 8 bits per pixel per color channel is suggested.
Optical Stage Micrometer	OMAX	A36CALM1	Or otherwise sufficient for spatial calibration.
Petri dish, 100 mm	Fisher	FB0875712	1 per sample.
PPE	N/A	N/A	Standard lab coat, gloves, and eyewear.
Sparmoria macro	NCSU	version 0.2.1	Available at github repository : https://github.com/joeweaver/SParMorIA-Sludge-Particle-Morphological-Image-Analysis
Stereo/dissecting microscope	Nikon	SMZ-2T	Should provide 10 to 20x magnficiation and allow digital photos either with a buit-in camera or profide a mounting point for a CCD.