Mesurer la forme et la taille des particules de boues activées immobilisées dans la gélose avec un Pipeline de logiciels Open Source

Résumé

La taille et la forme des particules dans les boues activées sont des paramètres importants qui sont mesurés à l’aide de différentes méthodes. Imprécisions proviennent d’échantillonnage non représentatif, images sous-optimal et paramètres de l’analyse subjective. Pour minimiser ces erreurs et faciliter la mesure, nous présentons un protocole spécifiant toutes les étapes, y compris un pipeline de logiciels open source.

Résumé

Bioréacteurs expérimentaux, tels que ceux traitant des eaux usées, contiennent des particules dont la taille et forme sont des paramètres importants. Par exemple, la taille et la forme des flocs de boues activées peuvent indiquer les conditions à la micro-échelle et affectent également directement comment bien la boue s’installe dans un clarificateur.

Forme et la taille des particules sont les deux mesures de façon trompeuse « simples ». Nombreuses questions subtiles, souvent non adressées dans les protocoles de l’informels, peuvent survenir lors de l’échantillonnage, imagerie et l’analyse des particules. Méthodes d’échantillonnage pourraient être biaisées ou ne fournissent pas assez de puissance statistique. Les exemples eux-mêmes peuvent être mal conservés ou subir une altération au cours de l’immobilisation. Images peuvent ne pas être d’une qualité suffisante ; chevauchement des particules, profondeur de champ, grossissement et divers bruits peut tous fruits et légumes des résultats médiocres. Analyse mal spécifié peut introduire un biais, tel que celui produit par segmentation et seuillage d’image manuel.

Abordabilité et le débit sont souhaitables aux côtés de reproductibilité. Une méthode abordable, haut débit peut permettent de mesurer les particules plus fréquente, produisant beaucoup d’images contenant des milliers de particules. Une méthode qui utilise des réactifs peu coûteux, un microscope à dissection commun et logiciel d’analyse de source ouverte librement disponible permet reproductibles, accessibles, reproductibles et partiellement automatisée des résultats expérimentaux. En outre, le produit d’une telle méthode peut être correctement mise en forme, bien définies et facilement comprise par le logiciel d’analyse de données, les analyses de laboratoire au sein et partage des données entre laboratoires d’accélération.

Nous présentons un protocole qui détaille les étapes nécessaires pour produire un tel produit, y compris : prélèvement, préparation des échantillons et immobilisation dans la gélose, acquisition d’images numériques, analyse d’image numérique et des exemples de génération de la figure de l’expérience spécifique de la résultats de l’analyse. Nous avons également inclus un pipeline d’analyse de données open source pour prendre en charge ce protocole.

Introduction

Le but de cette méthode est de fournir une méthode bien définie, reproductible et partiellement automatisée pour déterminer la taille et la forme des distributions de particules dans des bioréacteurs, particulièrement celles qui contiennent des flocons de boues activées et granules aérobie^{1 , 2}. la raison d’être de cette méthode étaient d’améliorer l’accessibilité, de simplicité, de débit et répétabilité de nos protocoles internes existantes^3,4, faciliter la mesure des particules pour les autres et de faciliter le partage et comparaison des données.

Il existe deux grandes catégories d’analyse de mesure des particules - méthodes déductives et direct d’imagerie utilisant des qualités telles que la diffusion de la lumière⁵. Bien que les méthodes déductives peuvent être automatisées et disposer d’un débit important, l’équipement est coûteux. En outre, alors que les méthodes déductives peuvent déterminer avec précision la taille équivalente d’une particule⁶, ils ne fournissent pas de forme détaillée d’informations⁷.

En raison de la nécessité pour les données de forme, nous avons fondé notre méthode sur imagerie directe. Alors que certaines méthodes d’imagerie haut débit existent, ils ont traditionnellement requis matériel commercial coûteux ou des solutions sur mesure construit^8,9. Notre méthode a été développée pour utiliser une commune et abordable matérielle et logicielle qui, bien que souffrant d’une réduction de débit, produit des images de particules beaucoup plus que le minimum nécessaire pour nombreuses analyses¹⁰.

Les protocoles actuels ne peuvent pas spécifier d’échantillonnage important et image acquisition étapes. Autres protocoles peuvent spécifier des étapes manuelles qui biaisent subjectifs (par exemple ad hoc seuillage¹¹). Une méthode bien définie qui spécifie les étapes d’acquisition d’échantillonnage, immobilisation et image associés au logiciel d’analyse disponible gratuitement améliorera les analyse dans le laboratoire d’images et des comparaisons entre les laboratoires. Des principaux objectifs du présent protocole sont de fournir un flux de travail et des outils qui devraient aboutir à des résultats reproductibles de laboratoires différents pour le même échantillon.

En dehors de la normaliser le processus d’analyse de l’image, les données produites par ce pipeline sont enregistrées dans un fichier bien définis, bien formatée¹² approprié pour l’usage de données populaires analyse paquets^13,14, expérience d’accélération des analyses spécifiques (par exemple de génération personnalisée de la figure) et facilite partage des données entre laboratoires.

Ce protocole est proposé en particulier pour les chercheurs qui ont besoin de données de forme de particules, n’ont pas accès aux méthodes déductives, ne souhaitent pas développer leur propre pipeline de l’analyse d’image et souhaitent partager leurs données facilement avec d’autres

Protocole

1. prélever des échantillons pour l’analyse des particules

1. Déterminer le volume de l’échantillon pour des réacteurs spécifiques permettant de produire des particules suffisantes pour l’analyse statistique¹⁰ (> 500) tout en évitant le chevauchement de la particule.
   1. Supposons qu’une gamme de 0.5 à 2 mL par échantillon de liqueur mixte est suffisante pour les échantillons de boues activées avec un solides de la liqueur mixte suspendu (MTSS) entre 250 et 5 000 mg/L.
   2. Sinon, préparez trois boîtes de gélose de test à l’aide de 0,5, 2 et 5 mL d’échantillon (étapes 1,2 par 2,7).
   3. Visuellement estimer qui (le cas échéant) des volumes d’échantillon meilleurs répondent aux critères énumérés à l’étape 1.1.
   4. Si les particules se chevauchent toujours pour l’échantillon de 0,5 mL, répéter les étapes 1.1.2 et 1.1.3). avec trois échantillons de 0,5 mL dilués avec un ajout de 0,5, 1 et 2 mL de tampon phosphate salin pour déterminer le degré auquel un échantillon de 0,5 mL doit être dilué avant l’étape 2.1.
      NOTE : Mesures 1.1 − 1.1.4 doivent uniquement être exécutée une fois par expérience, ou si le réacteur sommaire changement telles que les mesures ultérieures ne répondent plus aux critères énumérés à l’étape 1.1.
2. Acquérir un échantillon représentatif d’une partie bien mélangé du réacteur en saisissant ~ 40 mL dans un bécher ou un tube de centrifugation de 50 mL, mélangeant doucement et verser immédiatement le volume de l’échantillon déterminé de la pince bien mélangé dans un tube à centrifuger 15 mL. Diluer l’échantillon, au besoin, tel que déterminé par étape 1.1.4.
   Remarque : Le protocole peut être suspendu ici et le filtrat peut être conservé au réfrigérateur (4 ° C) pendant 48 heures. Ne pas congeler l’échantillon.
   Attention: les supports de conservation courants (p. ex., formaldéhyde/formamide) ne conviennent pas. La grande surface de la plaque, en combinaison avec le contenant ouvert, la chaleur de la source lumineuse et potentiellement mal ventilé microscopie d’installation produire inutilement dangereux pour peu de gain en qualité d’image.

2. préparer des boîtes de gélose de particules colorées, immobilisées

1. Ajouter 5 µL de bleu de méthylène 1 % (p/v) pour chaque échantillon, puis boucher et retourner doucement à 3 fois moins pour mélanger. Laisser des échantillons sur la tache au moins 5 mais pas plus de 30 minutes à température ambiante.
2. Préparer environ 10 mL par échantillon d’agar de 7,5 % (p/v) dans l’eau désionisée.
   NOTE : Gélose peut produit avance et conserver indéfiniment si stérilisé. Agarose peut-être être remplacé, mais n’améliore pas considérablement les images.
3. Faire fondre la gélose à l’aide d’un four à micro-ondes ou le bain-marie et laisser refroidir légèrement avant utilisation. Assurer l’agar est complètement fondu et coule facilement. Les globules solides d’agar seront tachera différemment, produisant des images de mauvaise qualité.
4. Transfert suffisamment fondu agar de 7,5 % (p/v) dans le tube à centrifuger de porter le volume total de tube à entre 6,5 et 9 mL.
5. Reboucher les tubes à centrifuger et retourner doucement au moins 3 fois pour mélanger.
6. Tout en pointant le bouchon loin de soi-même ou dans une hotte, ouvrir le bouchon. Versez le contenu de tube dans un plastique de 100 mm boîte de pétri tout en poussant doucement le plat pour réaliser un revêtement complet, lisse et une distribution uniforme visuellement des particules.
   Attention : La chaleur de l’agar peut produire une légère surpression dans le tube. Souvent, cela produit un sifflement audible et a le potentiel d’expulser des petites gouttelettes d’agar chaud.
7. Laisser les plaques refroidir à température ambiante pendant au moins 5 minutes, jusqu'à ce que l’agar se solidifie.
   Remarque : Le protocole peut être suspendu ici. Magasin plaqué inversé et fermés (par exemple, dans un sac plastique étanchéité ou avec le film de paraffine) pendant 48 heures au réfrigérateur (4 ° C).

3. acquérir des images de particules en utilisant un stéréomicroscope et appareil photo numérique

1. Placer le visage découvert plaque vers le haut sur la platine du microscope d’un stéréomicroscope capable de 10 x à 20 x. Éclairer l’échantillon par en dessous avec même, diffuse la lumière à l’aide de matériel comme un support de projecteur LED ou une plaque lumineuse.
2. Ouvrez le logiciel de capture d’image, vérifiez que le trajet optique microscope est défini sur la Photoet cliquez sur la caméra appropriée dans la liste de la caméra.
3. Régler le microscope pour que plusieurs particules apparaissent dans le logiciel dans le plan focal à bords de grands et bien définies. Utiliser un grossissement de x 10-20 pour mesurer les particules tout en conservant un plan relativement profonds focal.
   1. Temporairement supprimer la gélose et placez le micromètre sur la scène. Ajuster la mise au point fine jusqu'à ce que les graduations sur le micromètre apparaissent très ciblées dans le logiciel de capture d’image.
   2. Si n’a pas été calibré, enregistrer le pixel micro ratio pour le grossissement actuel.
      1. Réglez le zoom à 100 % en cliquant sur Zoom > taille réelle et sélectionnez Options > calibrer puis aligner la barre de calibration rouge dans la fenêtre principale le long de l’axe longitudinal du micromètre, avec les barres verticales centrée sur 0 et 200 µm deux graduations. Dans la boîte de dialogue de calibration , entrez le niveau actuel de grossissement et longueur réelle de 200 µm.
   3. Si déjà étalonné select grossissement dans la barre de menu et select le grossissement actuel niveau et confirme l’étalonnage.
      1. Sélectionnez mesures > ligne > arbitraire ligne. Cliquez sur l’intersection de la graduation 0 et l’axe le plus long du micromètre. Cliquez à nouveau sur l’intersection à 200 et le long de l’axe. A bon étalonnage doit afficher environ 200 µm. supprimer la ligne en cliquant sur elle, en appuyant sur SUPPR, puis en appuyant sur Oui dans la boîte de confirmation.
         Remarque : Les instructions données pour la sélection de la caméra et l’étalonnage sont spécifiques au logiciel utilisé pour ce matériel. Des fonctions similaires devraient être disponibles dans d’autres logiciels d’imagerie. L’objectif est de déterminer le pixel ratio micron de l’image pour la mesure de taille de particules précis.
4. Remplacez la gélose et réglez la mise au point fine pour atteindre le maximum de détails dans les logiciels d’imagerie.
5. Adapter le logiciel d’imagerie afin que la qualité d’image maximale est obtenue.
   1. Augmenter le nombre de bits à la valeur maximale autorisée, en sélectionnant la case d’option dans le panneau de la Profondeur de Bit de l’encadré de la caméra . Configurez le logiciel pour acquérir des images en niveaux de gris en sélectionnant la case d’option appropriée dans le panneau Couleur/gris de l’encadré de la caméra .
   2. Effondrement des panneaux de barre latérale ouverte entre l’exposition et l’histogramme. Réduire le gain à 1.0 et augmenter l’exposition jusqu'à ce qu’une image claire apparaît dans la fenêtre d’affichage, et jusqu'à ce que l’histogramme apparaisse comme une distribution qui n’est pas coupée par des extrémités de la boîte de l’histogramme.
   3. Ajuster l’histogramme à éviter sur et sous-exposition. Dans le panneau histogramme de la barre latérale de caméra, faites glisser la limite gauche de l’histogramme à juste à l’extérieur les valeurs les plus faibles et la limite droite juste à l’extérieur les valeurs les plus élevées.
6. Enregistrer l’image sous un TIFF non compressé, y compris les informations de grossissement dans les métadonnées de l’image, en utilisant le fichier > Enregistrer sous la boîte de dialogue, sélectionner le format TIFF et veiller à ce que la case enregistrer les informations de calibrage est vérifiée.
   Remarque : Enregistrer des métadonnées d’image, y compris la calibration spatiale, peut varier entre les programmes d’acquisition. Fidji¹⁵, le logiciel sous-jacent utilisé par le pipeline, comprend des variantes plus courantes. L’information importante à noter est la hauteur en pixels, la largeur et l’établissement associé.
7. Utilisez soit une scène mobile ou déplacer manuellement la plaque elle-même, sélectionner une autre zone, qui ne se chevauche pas les images précédentes, suivant une trajectoire qui alternativement de gauche à droite et de droite à gauche comme l’un se déplace vers le bas de la plaque ; également connu sous le nom « tondeuse à gazon modèle recherche ». Répétez l’étape 3.6 jusqu'à ce que suffisamment images sont produites pour capturer au moins 500 particules estimées visuellement, plus sont meilleurs.
   NOTE : Modèles des solutions de rechange (par exemple., circulaire, au hasard) sont acceptables, mais doit être signalé. Acquisition de plusieurs images qui se chevauchent pour combinaison en une mosaïque via digital produit couture une taille de fichier résultante qui entrave considérablement la transformation en aval et les artefacts de couture peut-être être introduite et n’est pas recommandée.
8. Conserver les plaques qu’après l’analyse d’images pour l’imagerie suivi éventuel. Après l’imagerie final, jeter le cas échéant de déchets biologiques.

4. mesurer et analyser les silhouettes de particules

1. Installer les packages de logiciels d’analyse image requise
   1. Installer des Fidji (une version améliorée de la National Institutes of Health ImageJ v1.52e suivant les instructions au : https://imagej.net/Fiji/Downloads
   2. Installer git, si ce n’est pas déjà présent, en suivant les instructions à : https://git-scm.com/downloads
   3. Obtenir le code d’analyse de particules d’en clonant le git référentiel¹⁶.
      1. Sur la ligne de commande, récupérer la dernière version du code en tapant :
         git clone https://github.com/joeweaver/SParMorIA-Sludge-Particle-Morphological-Image-Analysis.git
         1. Installer le suivant de code analyse les instructions dans le fichier de texte README.md trouvées dans le répertoire racine du référentiel cloné.
            Remarque : Utiliser git est préférable, car il récupère automatiquement la dernière version du code. Si git n’est pas disponible, il est également possible de télécharger le code comme un fichier zip sur la page de publication à : https://github.com/joeweaver/SParMorIA-Sludge-Particle-Morphological-Image-Analysis/releases
   4. Éditer un fichier texte énumérant les répertoires à traiter, ainsi que des paramètres facultatifs. Voir le sous-répertoire exemples/analyse pour obtenir la liste des paramètres et des exemples.
2. Exécutez l’analyse sur la ligne de commande en tapant :
   \ImageJ-win64.exe < Fidji-PATH >--console - macro SParMorIA-SludgeParticle_Morphological_Image_Analysis < paramsfile >
   où < Fidji-path > est le répertoire dans lequel se trouve le ImageJ-win64.exe et < paramsfile > l’emplacement du fichier texte décrivant la configuration de l’analyse
   Remarque : Le nom du fichier exécutable peut-être différer, selon lequel les Fidji de système d’exploitation est installé sur. Selon le nombre et la taille des images, l’analyse peut prendre quelques minutes à heures et s’exécutera automatiquement.
3. Effectuer un contrôle de qualité
   1. Examinez les fichiers de contrôle de qualité situés dans le sous-répertoire de superposition de répertoire de sortie spécifié. Notez les images avec des particules capturées fallacieux, manqués et mal, tout apparents sous forme de contours ombrés qui ne correspondent pas à l’arrière-plan. Reportez-vous à la Figure 3 pour obtenir des exemples d’un tel. Les données sur les particules sont maintenant prêtes pour la production de figure d’analyse de l’expérience spécifique.
4. Rejeter les plaques entières ou des particules individuelles en spécifiant dans le code d’analyse les fichiers indiqués et/ou les particules ID est ignoré. Se reporter aux exemples/censurer dans le référentiel de code correspondant de R et Python.
5. Générer des expérience de chiffres précis à l’aide des résultats de l’analyse d’image pour chaque image sont stockées dans un fichier de texte séparé par des virgules TIDY¹² dans le sous-répertoire résultats du répertoire de sortie spécifié. Voir les exemples/chiffres/R et exemples/chiffres/Python sous-répertoires pour obtenir des exemples de comment lire les fichiers de résultats.

Résultats

Fichiers générés
Le processus illustré dans la Figure 1 produira deux fichiers par image analysée. Le premier fichier est une virgule séparées fichier CSV (valeurs) texte où chaque ligne correspond à une particule individuelle et les colonnes décrivent diverses métriques de particules telles que zone circularité et solidité et définies dans le manuel de ImageJ¹⁷. Exemples de fichiers CSV sont inclus co...

Discussion

Bien que le système de l’analyse d’image est assez robuste et QC mesures sont prises pour s’assurer que les pauvres images sont supprimées, l’attention à des questions spécifiques à l’échantillonnage, la préparation de la plaque et acquisition d’images peut améliorer tant l’exactitude des données et la proportion de images en passant de QC.

Concentration d’échantillonnage
En supposant qu’un échantillon représentatif a été pris, l’étape la ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% Bleach solution	Chlorox	31009	For workspace disinfection.
15 mL centrifuge tube with cap	Corning	430790	Per sample.
50 mL Erlenmeyer flask	Corning	4980-50	Other vessels are suitable so long as they can contain > 40 mL of sample and allow mixing
500 mL Kimax Bottle	Kimble-Chase	14395-50	Or otherwise sufficient for agar handling
Agar	BD	214010	Solid, to prepare 7.5% gel. 7 mL per sample.
Data analysis software	N/A	N/A	R or Python are suggested
Deionized water	N/A	N/A	Sufficient to prepare stain and agar. If unavailable, tap should be fine.
Desktop computer	N/A	N/A	Image analysis is not CPU intensive, any 'ordinary' desktop computer circa 2017 should be sufficient.
External hard drive	Seagate	STEB5000100	Not fully required, but extremely useful given the number an size of images. 2 or more TB of storage suggested.
FIJI	NIH	version 1.51d	Version is ImageJ core. Plugins are updated as of writing. Available at: https://imagej.net/Fiji/Downloads
GIT	Open Source	version 2.19.1 or later	Available at: https://git-scm.com/
Image capture software	ToupView	version 3.7.5177	Any compatible with camera, may come with camera. Should allow saving TIFF images with spatial calibration data.
Mechanical (X/Y) Stage	OMAX	A512	Not fully required, but greatly aids image acquisition.
Methylene blue	Fisher	M291-100	Solid, to prepare 1% w/v solution. 5 uL solution per sample.
Microscope camera	OMAX	A35140U	Any digitial camera compatible with microscope. Resolution providing at least 5 um per pixel at 10x magnification and a dynamic range of at least 8 bits per pixel per color channel is suggested.
Optical Stage Micrometer	OMAX	A36CALM1	Or otherwise sufficient for spatial calibration.
Petri dish, 100 mm	Fisher	FB0875712	1 per sample.
PPE	N/A	N/A	Standard lab coat, gloves, and eyewear.
Sparmoria macro	NCSU	version 0.2.1	Available at github repository : https://github.com/joeweaver/SParMorIA-Sludge-Particle-Morphological-Image-Analysis
Stereo/dissecting microscope	Nikon	SMZ-2T	Should provide 10 to 20x magnficiation and allow digital photos either with a buit-in camera or profide a mounting point for a CCD.