JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

نقدم هنا، على بروتوكول لاستزراع الحجمية الأمعاء القولون في المختبر، باستخدام سلسلة من المفاعلات الحيوية التي تحاكي الظروف الفسيولوجية للقناة المعدية المعوية.

Abstract

الحجمية القناة الهضمية البشرية تلعب دوراً حيويا في صحة الإنسان والمرض. دراسة الحجمية الأمعاء باستخدام نموذج في فيفو ، صعب نظراً لطبيعتها المعقدة، وارتباطه المتنوعة مع مكونات الثدييات. والهدف من هذا البروتوكول هو ثقافة الحجمية القناة الهضمية في المختبر، الذي يسمح لدراسة ديناميات الحجمية القناة الهضمية، دون الحاجة إلى النظر في مساهمة الوسط الثدييات. تستخدم في المختبر استزراع التكنولوجيا، هي محاكاة الظروف الفسيولوجية للقناة المعوية المعدية، بما في ذلك معلمات مثل درجة الحموضة ودرجة الحرارة، أنايروبيوسيس، ووقت العبور. هو محاكاة سطح القولون المعوية عن طريق إضافة حاملات المغلفة الميوسين وخلق مرحلة مخاطية وأضاف بعدا جديداً. هو عرض الحجمية القناة الهضمية بتطعيم بمادة البراز البشري. عند التطعيم مع هذا الخليط المعقد من البكتيريا، الميكروبات محددة هي أثري مختلف الطولية (تصاعدي، نقطتين عرضية وتنازلي) والبيئات (لومينال والأغشية المخاطية) مستعرضاً النموذج في المختبر. من الأهمية بمكان للسماح للنظام للوصول إلى حالة مستقرة، التي تبقى مستقرة على المجتمع ونواتج الأيض المنتجة. وتبين النتائج التجريبية في هذه المخطوطة كيف أن القناة الهضمية الملقحين الحجمية يتطور المجتمع إلى مجتمع مستقر على مر الزمن. متى تحقق حالة ثابتة، يمكن استخدام هذا النظام لتحليل التفاعلات البكتيرية ووظائف المجتمع أو لاختبار آثار أي إضافات على الحجمية القناة الهضمية، مثل الأغذية، والمكونات الغذائية أو المستحضرات الصيدلانية.

Introduction

الحجمية القناة الهضمية هو مجتمع كائنات الحية الدقيقة الموجودة في القناة الهضمية البشرية (GIT).  ويصل هذا المجتمع إلى التركيز الأقصى في القولون، حيث يقدر أن يعقد البكتيريا-1014 1013، 500-1,000 الأنواع، التي تعيش في التعايش مع القولون الوسط1،2. تغيير تكوين ووظائف الحجمية القناة الهضمية مكانياً على طول جيت، تشكيل مجتمعات المنطقة المحددة، مع تنوع معظم وجدت ديستالي2،3،،من45. لكل منطقة التشريحية، تتواجد المجتمعات الميكروبية منفصلة في التجويف و البطانة المخاطية6. أن المجتمع التجويف لديه الوصول المباشر للمواد الغذائية ركائز التحرك من خلال حجرة لومينال7. وعلى الرغم من ذلك، يقيم بعض البكتيريا تفضيلي في طبقة المخاط، الاستفادة من الميوسين التي تنتجها خلايا القولون كمصدر الطاقة1،،من58. الفرق في ميكرونفيرونمينتس بين نتائج المراحل لومينال والأغشية المخاطية في الاختلاف وتنمية المجتمعات مرحلة محددة. معا، هذه المجتمعات وتوفير وظائف التمثيل الغذائي، مثل استقلاب المواد الغذائية وإنتاج الفيتامينات، والوظائف المناعية، مثل منع الاستعمار من مسببات الأمراض البشرية1،3، 9-الحجمية الأمعاء كما تعمل وظيفيا بالاقتران مع خلايا القولون البشرية3.

كجزء هام من بوابة البشرية، فإنه ليس من المستغرب أن يعرف الحجمية القناة الهضمية للمساهمة في كلا المضيف الصحة والمرض حالة3،9،10،،من1112. تحولاً في السكان الميكروبية الأمعاء ارتبطت بأمراض الإنسان متعددة، بما في ذلك الاضطرابات بوابة مثل أمراض الأمعاء الأمعاء (بنك التنمية بين الأمريكتين) ومتلازمة الأمعاء الأمعاء (IBS)، ولكن أيضا الأمراض الأخرى، مثل السمنة وأمراض الدورة الدموية، والتوحد 3 , 9 , 10 , 11 , 12-نواتج الأيض المنتجة من الحجمية القناة الهضمية لها تأثير عالمي، الوصول إلى مواقع بعيدة عن ال12،القناة الهضمية13. على سبيل المثال، محور الأمعاء والدماغ المرتبطة باضطرابات نفسية مثل القلق والاكتئاب14. ولذلك، تدرس الحجمية القناة الهضمية المهم إلى حقول متعددة للبحوث، وينطبق على العديد من الأمراض، حتى تلك التي كثيرا ما لا المقترنة بوابة.

في حين أن من المسلم به على نطاق واسع أن من المهم دراسة الحجمية القناة الهضمية، مسعى معقد. نماذج حيوانية متعددة متاحة، من الحيوانات الصغيرة مثل الزرد والجرذان والفئران، إلى الأكبر حجماً مثل القردة والخنازير15-19. ومع ذلك، تطبيق هذه الحيوانات من حيث الحجمية القناة الهضمية البشرية لا واضحة، منذ هذه الحيوانات لديها مجتمع بكتيرية فريدة من نوعها التي تطورت على أساس البيئة والنظام الغذائي، وهم تشريحيا متميزة من البشر20 , 21-استخدام البشر إزالة مسألة ذات صلة حتى الآن تقدم مجموعة أخرى من التحديات. الدراسات الإنسانية هي مكلفة وتستغرق وقتاً طويلاً، وهي مقيدة أخلاقيا11. وعلاوة على ذلك، تؤثر عوامل التباس الحجمية القناة الهضمية في الدراسات الإنسانية، بما في ذلك العمر أو مرحلة النمو والبيئة والنظام الغذائي، الأدوية والعوامل الوراثية2،،من422.  وهناك أيضا قيود على ما يمكن أن يكون اختبار في البشر، وأي نوع من العينات يمكن أن تحصد ما هي الأوقات4.

أحد العيوب الحرجة لاستخدام نظام في فيفو لدراسة الحجمية القناة الهضمية هو وجود مكونات الثدييات. الحجمية الأمعاء والخلايا البشرية التي تتفاعل مع بعضها البعض، وفي في فيفو الإعداد، من المستحيل التمييز بين الاثنين. وتؤخذ نواتج الأيض التي تنتجها الحجمية القناة الهضمية خلايا القولون، حيث لا يمكن حساب القياسات بدقة. ولذلك، يجب أن يكون أي دراسة ميكانيكية محدودة إلى نقطة النهاية القياسات11. هو عيب رئيسي آخر للدراسات المجراة في عجز عن حصاد العينات من مناطق مختلفة بوابة طوليا23. وهذا لا يسمح بتقييم التغيرات التي قد تحدث في ميكرونفيرونمينتس القولون على مدى الساعة12.  في فيفو دراسات كثيرة، بما في ذلك الدراسات الإنسانية، تعتمد على تحليل عينات البراز للكشف عن التغيرات الحجمية القناة الهضمية12. بينما هذا مفيدة، لا تقدم بيانات عن الحجمية القناة الهضمية عبر بوابة ولا يفرق بين المجتمعات لومينال والأغشية المخاطية5،6،،من78.

الحجمية القناة الهضمية، مطلوب تطبيق أسلوب في المختبر لدراسة ديناميات المجتمع البكتيرية، ودون تدخل من مكونات الثدييات. يسمح استخدام أسلوب في المختبر لمراقبة مشددة من الظروف البيئية10واختبار معلمات متعددة في وقت واحد، والقدرة على أخذ عينات طوليا، وفي أحجام كبيرة11. نظراً لأسلوب في المختبر يستخدم أحد الأجهزة ميكانيكية ولا مضيف، تلزم لا اعتبارات السن، والبيئة، والنظام الغذائي، أو الخلفية الوراثية. هذه النظم يمكن استخدامها لاختبار أما الطائفة الحجمية القناة الهضمية كاملة، فقط تحديد الكائنات، أو السلالات حتى واحد. الأهم من ذلك، النتائج في المختبر استنساخه، وبعد الاحتفاظ بمستوى تنوع مقارنة للدراسات المجراة في11،22.

اعتماداً على فرضية قيد البحث والنتائج المرجوة، وأنا يمكن أن يؤديهاالمختبر ن الدراسات في العديد من الطرق.  وهي تستخدم نظم سفينة واحدة وأساليب بسيطة، مثل حضانة عينات البراز هوموجيناتي24 أو أداء الثقافات دفعة واحدة على مدى 24-48 ح25. أنها يمكن أيضا أن يتم ذلك استخدام نظم سفينة واحدة وأساليب أكثر تعقيداً، مثل استخدام نظام تشيموستات لإنتاج مجتمع الميكروبي القناة الهضمية مستقرة11. ومع ذلك، استخدام مفاعل واحد يمكن الإفراط تبسيط الحجمية12 نظراً لأنه يمثل فقط قسم واحد من القولون، على الرغم من القولون ويتألف من مناطق التصاعدي والتنازلي عرضية.

ومن أجل دراسة المجتمع الحجمية القناة الهضمية التي تتطور في مناطق مختلفة من القولون (المناطق التصاعدي والتنازلي عرضية)، يمكن أن تستخدم نظام معقدة ومتعددة المراحل. في هذه الأنظمة، يتم إعداد سفن متعددة لتقليد في مناطق مختلفة من القولون، حيث تزرع الحجمية القناة الهضمية في منطقتي تصاعدي، وعرضية، وتنازلي بشكل مستقل. وترتبط هذه السفن، باستخدام مضخات لنقل ركائز في التسلسل، من الصعود إلى عرضية إلى منطقتي القولون تنازلي، ومحاكاة تدفق المواد الغذائية من خلال بوابة.

وكان الهدف من هذه الدراسة لإظهار كيف نظام 5-مرحلة ثقافة في المختبر (انظر الجدول للمواد) يمكن استخدامها لتنمية المجتمع الحجمية القناة الهضمية، وتثبت ديناميات المجتمع من حيث الاستقرار وتكوين. في هذا النظام، يمثل سفينة واحدة في المعدة وواحدة تمثل في الأمعاء. القولون ينقسم إلى ثلاث مناطق (تصاعدي، عرضية، تنازلي)، مع سفينة واحدة تمثل كل منطقة26. في هذا الإعداد التجريبية، نظامان كاملة تم تشغيلها في نفس الوقت، ومع الوحدة 1 تحتوي على حاملات الميوسين ليمثل سطح الغشاء المخاطي ووحدة 2 التي تحتوي على لا شركات الميوسين. وقورنت المجتمعات التي وضعت في مراحل لومينال والأغشية المخاطية لكل منطقة إلى بعضها البعض، وأن العدوى البراز على مر الزمن باستخدام التسلسل الجيني الرنا الريباسي 16S وتحليل الهيئة. وتبين النتائج المعروضة نوع المجتمع، سواء من حيث تكوينها ووظيفة، والتي يمكن أن تنتج من هذا النوع من النظام في المختبر.

Protocol

1-المواد والأعمال التحضيرية

ملاحظة: يتم شراء وسيلة محددة كمسحوق (انظر الجدول للمواد). تكوين وسيلة محددة في غرام/لتر هي التالية: أرابينوجالاكتان (1.2)، البكتين (2.0)، زيلان (0.5)، والسكر (0.4)، خلاصة الخميرة (3.0)، ببتون الخاصة (1.0)، الميوسين (2.0)، L-سيستين-HCl (0.2).

  1. تعد الوسيطة المحددة
    1. ملء قارورة ل 4 مع 2 لتر الماء المقطر ومنزوع مزدوجة.
    2. إضافة ز 29.2 من مسحوق متوسطة المعرفة للماء ومزيج تجانس وحدة كاملة.
    3. إضافة محرض مغناطيسية والمسمار فضفاضة على الغطاء.
    4. اﻷوتوكﻻف في 121 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
    5. بعد التبريد، تخزين متوسطة محددة معدّة في ثلاجة عند درجة 4 مئوية مع التحريض المستمر (محرض المغناطيسية).
  2. إعداد عصير البنكرياس
    1. اﻷوتوكﻻف إضافة 2 لتر الماء المقطر، منزوع في سفينة ل 5 مع شريط محرض، في 121 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
    2. بعد التعقيم، السماح للمياه لتبرد بدرجة حرارة الغرفة.
    3. إضافة 12.5 غ ناكو3، 6 ز الصفراء، وبنكرياتين ز 0.9. ضع على محرض المغناطيسي المزيج.
      ملاحظة: ينبغي إعداد جديدة من كل 2-3 أيام عصير البنكرياس والمبردة بالتحريض بعد أن أدلى.
  3. المخزن المؤقت للفوسفات
    1. مكان 1 لتر قارورة تحتوي على شريط مغناطيسي محرض في محرض مغناطيسية. إضافة 0.5 لتر الماء المقطر ومنزوع ودورة على الانفعال.
    2. بعد ذلك إضافة 6.8 ز خ2ص4، ز 8.8 ك2مكتب البراءات الهنغاري4، و thioglycolate الصوديوم 0.1 g. قبالة رأس مع المياه إلى وحدة تخزين نهائي للأم 1
    3. بعد المكونات قد حلت تماما، ضبط درجة الحموضة إلى 7.0 باستخدام هيدروكسيد الصوديوم.
    4. من أجل المخزن المؤقت داخل وعاء 2 لتر مع غطاء سداده ملولبة والاوتوكلاف في 121 درجة مئوية عن 30 دقيقة تكفل أن الغطاء هو مشدود على فضفاضة وعدم إغلاق محكم.
    5. بعد إزالة من اﻷوتوكﻻف، السماح للحل لتبرد بدرجة حرارة الغرفة. تخزين المخزن المؤقت في درجة حرارة الغرفة لمدة تصل إلى أسبوعين.
  4. إعداد شركات أجار الميوسين
    1. اﻷوتوكﻻف الميوسين البلاستيك الناقلين (انظر الجدول للمواد)، الملقط، مش البلاستيك (أنبوبي الشكل)، والعلاقات الرمز البريدي في 131 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
    2. اﻷوتوكﻻف 300 مل المزدوجة المقطر، شطب المتأينة المياه في 131 درجة مئوية للحد الأدنى 30 تخزين في درجة حرارة الغرفة حتى الاستخدام.
    3. في مجلس الوزراء مع تدفق الصفحي السلامة الأحيائية، ملء أطباق بتري معقمة مع الناقلين الميوسين البلاستيك باستخدام الملقط العقيمة.
      ملاحظة: شركات الميوسين هي جوفاء الدوائر البلاستيكية التي تمتلئ أجار الميوسين. مجرد تعبئة، يمكن وضع الغطاء على أعلى، وهذه يمكن أن تكون جانبا.
    4. لإعداد أجار الميوسين، إضافة الجيل الثالث 3g أجار البكتيرية وز 15 من الميوسين الخنزير إلى 300 مل الماء يعقم.
    5. في غطاء دخان، غلى هذا الحل، ثم إزالة من مصدر الحرارة والسماح لتبرد للحد الأدنى 1 تكرار الغليان والتبريد لما مجموعة 3 مرات.
    6. متى السفينة الزجاجية التي تحتوي على الحل أجار الميوسين بارد ما يكفي للمس، نقله إلى مجلس الوزراء مع الاندفاق الصفحي السلامة الأحيائية.
    7. في مجال السلامة الأحيائية مجلس الوزراء مع تدفق الصفحي، صب أجار الميوسين السائلة على الناقلين الميوسين البلاستيكية التي تم وضعها في طبق بتري. التأكد من أن جميع شركات الطيران تمتلئ تماما أجار الميوسين.
    8. ضع الغطاء مرة أخرى على طبق بيتري والسماح لها لتبرد تحت الاندفاق الصفحي.
    9. لتجميع حاملات الميوسين، تأخذ المعاوضة البلاستيك يعقم وإدراج شركات الميوسين تحتوي على أجار الميوسين طدت من طبق بيتري استخدام الملقط المعقم.
    10. استخدام العلاقات الرمز البريدي لإغلاق ينتهي الشبكة. بهذه الطريقة شغل الوظائف الصافية التي تحتوي على الناقلين الميوسين مع أجار الميوسين. تخزين في 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.

2. قم بإعداد، التطعيم، وتشغيل النظام

  1. قم بإعداد نظام تثقيف
    ملاحظة:     واستخدمت "محاكاة التوأم" للنظام "الإيكولوجي للميكروبات المعوية البشرية" لهذه الدراسة.
    1. ضع 10 المفاعلات الحيوية التي تحتوي على أشرطة محرض على النمامون المغناطيسي ودورة على الانفعال.
      ملاحظة: كل وحدة تتألف من 5 المفاعلات الحيوية، حيث سيتطلب 2 وحدات المفاعلات الحيوية 10.
    2. قم بتوصيل 5 المفاعلات الحيوية إلى بعضها البعض باستخدام أنابيب السيليكون في تسلسل عن طريق مضخة تمعجية (الشكل 1). استخدام المضخات لعرضية محتويات السوائل من مفاعل حيوي واحد إلى التالي.
    3. قم بتسمية المفاعلات الحيوية في التسلسل التالي: المعدة، والأمعاء، القولون تصاعدي، القولون عرضية، تنازلي القولون لتمثيل النظام للجهاز الهضمي.
      ملاحظة: يمكن أن جميع المفاعلات الحيوية متطابقة، أو المفاعلات الحيوية المعدة والأمعاء يمكن أن تكون أصغر بالمقارنة مع المفاعلات الحيوية القولون نظراً إلى أنها ستعقد أقل حجم. إقامة المفاعلات الحيوية بهذه الطريقة يعني أن منطقة القولون تصاعدي يتلقى المواد الغذائية من الأمعاء الدقيقة ومنطقة القولون عرضية يتلقى المواد الغذائية من منطقة القولون تصاعدي، ومنطقة القولون تنازلي يتلقى المواد الغذائية من المنطقة عرضية. وبهذه الطريقة، هو محاكاة النظام حركة متتابعة من المواد الغذائية عن طريق الجهاز الهضمي.
    4. ضع متوسطة المعرفة وعصير البنكرياس في ثلاجة عند 4 درجة مئوية مع التحريض المستمر استخدام النمامون المغناطيسي. استخدام أنابيب السيليكون، الاتصال وسيلة محددة مفاعل حيوي المعدة عن طريق مضخة تمعجية والاتصال عصير البنكرياس إلى الأمعاء الدقيقة عن طريق مضخة تمعجية.
    5. إضافة عامل توحيد كيس تصريف بول. قم بتوصيل القولون تنازلي كيس البول الصرف عن طريق مضخة تمعجية. التصرف طدت كالنفايات البيولوجية من خلال التجربة.
    6. استخدام أنابيب سيليكون، توصيل الماء سترة لكل سفينة في النظام، وتتصل نهاية كل حمام المياه المتداولة. ملء حمام المياه المتداولة بماء مقطر (هذا المبلغ سوف تختلف تبعاً للنوع من تعميم حمام المياه المستخدمة) وتعيينها إلى 37 درجة مئوية.
    7. استخدام أنابيب السيليكون، الاتصال الحمض والقاعدة والغطاء لكل سفينة عن طريق المضخات المتمعجة. التركيزات الموصى بها هي 0.5 M HCl و 0.5 M هيدروكسيد الصوديوم.
    8. إدراج المسابير الأس الهيدروجيني لكل سفينة من خلال المنفذ المعين في الغطاء. تم تصميم هذا المنفذ للاحتفاظ بمسبار درجة الحموضة والمسمار في الغطاء (الشكل 1). تعيين الرقم الهيدروجيني لكل منطقة على النحو التالي: المعدة، ودرجة الحموضة = 2؛ الأمعاء، ودرجة الحموضة = 6.7-6.9؛ القولون تصاعدي، درجة الحموضة = 5.6-5.9؛ القولون عرضية، ودرجة الحموضة = 6.15-6.4؛ القولون تنازلي، ودرجة الحموضة = 6.6-6.9.
      ملاحظة: خلال المرحلة الأولى، سوف تفرق المجتمع استناداً إلى الاختلاف في قيم الأس الهيدروجيني في المنطقة. حالما تبدأ دورات التغذية، ومع ذلك، سوف كذلك ناضجة استناداً إلى الاختلافات في مدخلات المغذيات المجتمعات المحلية.
    9. قم بتوصيل خط نيتروجين باستخدام أنابيب السيليكون إلى الغطاء لكل سفينة باستخدام المنفذ المعين. ينبغي أن تتدفق على الخط النيتروجين في التسلسل التالي: المعدة، والأمعاء، القولون تصاعدي، القولون عرضية، تنازلي القولون. تكفل كل وحدة تدفق الخاصة به لتجنب التلوث المتبادل.
      ملاحظة: يستخدم لإزالة الأكسجين من النظام النيتروجين ويحافظ أنايروبيوسيس أثناء التجربة.
    10. إدراج أنبوب عينة معدنية من خلال غطاء كل مفاعل حيوي باستخدام المنفذ المعين. أنبوب معدني يمتد أسفل إلى مفاعل حيوي ويستخدم لجمع عينات من السوائل.
    11. إضافة قطعة صغيرة من أنابيب السيليكون إلى نهاية العلوي من أنبوب عينة وتوصيل قفل اللوير للسماح باستخدام المحاقن أثناء أخذ العينات.
  2. التطعيم للنظام
    1. تعبئة منطقة القولون بوسيلة محددة باستخدام وحدات التخزين التالية: 500 مل في القولون تصاعدي و 800 مل في القولون عرضية 600 مل في القولون تنازلي.
    2. إضافة شركات أجار الميوسين إلى منطقة القولون، بمبلغ يتناسب مع حجم المفاعل. واستخدمت لهذه التجربة، حاملات 60 في المفاعل.
    3. قم بإزالة أي وسيط المعرفة الزائدة استخدام أنبوب عينة وحقنه منذ إضافة الناقلين يرفع مستوى السائل في مفاعل حيوي.
    4. قم بتشغيل المسابير الأس الهيدروجيني لضبط درجة الحموضة في كل مفاعل باستخدام الكمبيوتر.
    5. قم بتشغيل تدفق النيتروجين لمدة 20 دقيقة.
      ملاحظة: هوموجيناتي البراز المستخدمة للتطعيم يتم شراؤها كبراز 10% تجانس في حل والغليسيرول 10% (انظر الجدول للمواد). عينة البراز يتم اختيارها عشوائياً من مجموعة من الجهات المانحة مع المعايير التالية: "أمريكا" تستهلك نظام غذائي غربي نموذجي (لا نباتي أو نباتي)، بين 21-45 سنة عمر، والمضادات الحيوية مجاناً لمدة سنة على الأقل، مع متوسط "مؤشر كتلة الجسم" (18.5-24.9) . ويستخدم هذا البروتوكول، مانح واحد فقط. ومع ذلك، يمكن تغيير هذا بسبب التصميم التجريبي.
    6. قبل التطعيم، ذوبان الجليد هوموجيناتي البراز اتباع إرشادات الشركة المصنعة.
    7. تطعيم كل مفاعل القولون بإضافة هوموجيناتي البراز في مبلغ مساو لنسبة 5% حجم المفاعل عن طريق الميناء عينة، استخدام المحاقن 60 مل (25 مل للقولون تصاعدي، 40 مل للقولون عرضية، 30 مل للقولون تنازلي).
    8. تنمو الثقافات في المفاعلات الحيوية بين عشية وضحاها مع مراقبة درجة الحموضة.
    9. بعد النمو بين عشية وضحاها، حصاد عينات السوائل لومينال من كل منطقة القولون كما هو موضح أدناه في القسم 3. بعد الانتهاء من أخذ العينات، قم بتشغيل البرنامج الحاسوبي للبدء في التغذية.
  3. تغذية دورات يوميا
    ملاحظة:     دورات التغذية اليومية بالحاسوب الآلي.
    1. ضخ 140 مل وسيلة محددة داخل مفاعل حيوي المعدة ثلاث مرات في يوم، ويسمح لاحتضانها ح 1.
    2. بعد حضانة ح 1، ضخ محتويات المعدة في الأمعاء. في الوقت نفسه، ضخ 60 مل عصير البنكرياس إلى الأمعاء الدقيقة.
    3. في الأمعاء الدقيقة، بدوره على تعديل درجة الحموضة إلى pH 6.7-6.9، والسماح لخليط لاحتضان لمدة 90 دقيقة. أثناء الحضانة، بدوره على تدفق النيتروجين لكل نظام لمجموعة من 10 دقيقة.
    4. وبعد تفريخ 90 دقيقة، تشغيل المضخات من الأمعاء الدقيقة إلى القولون تصاعدي، القولون تصاعدي للقولون عرضية، والقولون عرضية للقولون تنازلي، والقولون تنازلي للنفايات في وقت واحد.
  4. الجدول الزمني التجريبي
    ملاحظة:     ويدار النظام في المختبر يستخدم هنا بشكل مستمر لمدة 8 أسابيع تقريبا في الطول. أدناه مخطط زمني تجريبية الموصى بها، ومع ذلك، يمكن تعديل هذه تبعاً للاحتياجات، والهدف من هذه التجربة.
    1. إعداد نظام الخطوات التالية المذكورة في الخطوة 2، 1.
    2. حصاد عينات من النمو بين عشية وضحاها بعد البروتوكول أدناه. تبدأ الدورات يوميا، تغذية ثلاث مرات في يوم بعد البروتوكول أعلاه.
    3. تشغيل التجربة لمدة أسبوعين للسماح للبكتيريا لتحقيق الاستقرار.
      ملاحظة: تشغيل النظام يعني أن الحفاظ على درجة الحموضة ويتم اتباع دورات التغذية يوميا ثلاث مرات في يوم، والناقلين المخاطية تتغير 2-3 مرات كل أسبوع.
    4. بعد التثبيت، قم بتشغيل التجربة لمدة أسبوعين كفترة الرقابة.
    5. بعد انقضاء فترة مراقبة استخدام النظام لاختبار المكونات المختلفة أو المتغيرات، المعروفة بفترة العلاج.
    6. بعد فترة العلاج، التوقف عن إضافة مكونات أو المتغيرات وتعود الأوضاع إلى طبيعتها. هذا يعتبر الفترة من المياه والصرف الصحي، ويستخدم لتحديد ما إذا كان أو لم يكن التغييرات إلى المجتمع الدائم.

3-جمع عينات من النظام

ملاحظة: وخلال التجربة، عينات يمكن حصادها من مرحلة لومينال أو الأغشية المخاطية في أي منطقة في أي وقت، بعد أدناه المبادئ التوجيهية.

  1. جمع عينات لومينال
    1. حصاد لومينال عينات السوائل من خلال منفذ عينة الذي يمتد إلى الوسط السائل بالثقافة. ابدأ بتنظيف قفل اللوير على المنفذ عينة مع الإيثانول 70% أو لوحة صغيرة من الكحول، والسماح لتجف.
    2. التأكد من أن تتم إزالة كافة الهواء من حقنه 30 مل وتوصيله إلى منفذ عينة. رسم صعودا ونزولاً من 3-5 مرات لضمان خلط السليم لمكونات السفينة. بعد ذلك، رسم ما مجموعة 30 مل ثقافة.
    3. قاسمة عينات لومينال كالحاجة إلى أنابيب الصقر العقيمة ومخزن على الجليد. بعد الانتهاء من أخذ العينات نقل هذه ثلاجة-80 درجة مئوية.
    4. لتحليل الهيئة، وهو نسج 15 مل العينة لومينال في 4 درجات مئوية، 5,000 س ز لمدة 10 دقائق. المادة طافية من المحاقن التي تمت تصفيتها باستخدام عامل تصفية 0.2 ميكرومتر الدائرة العامة. تخزين المادة طافية المصفاة في-80 درجة مئوية.
      1. لتحليل الحمض النووي، وتدور 1 مل سائل لومينال في 4 درجات مئوية، 5,000 س ز للحد الأدنى 10 تجاهل المادة طافية وتخزين بيليه في-80 درجة مئوية.
      2. كنسخة احتياطية، تخزين 10 مل سائل لومينال في-80 درجة مئوية لمعظم التجارب.
  2. جمع عينات مخاطية
    ملاحظة:     تغيير حاملات المخاطية كل 2-3 أيام.
    1. إزالة وتبرز الناقلين الميوسين مستعدا من الثلاجة.
    2. بدوره على تدفق النيتروجين وفتح غطاء المفاعل بسرعة. إزالة 50% ناقلات الميوسين وإضافة أخرى جديدة.
    3. إغلاق الغطاء بسرعة والاحتفاظ النيتروجين دافق على لآخر 20 دقيقة.
    4. لاستخراج الحمض النووي، الكوة 0.25-0.5 ز لاجار في أنبوب 2 مل وتخزينها في-80 درجة مئوية إلى حين الحاجة.

4. استخراج الحمض النووي والتسلسل، والتحليل

ملاحظة: يتم استخراج الحمض النووي باستخدام الأسلوب استخراج "الحمض النووي كتاب" مع التجانس الجسدي في غطاء دخان29. وبعد الاستخراج، يستخدم جهاز المطياف الضوئي لقياس كمية الحمض النووي في كل عينة.

  1. إعداد كتاب المخزن المؤقت
    1. حل 4.2 ز ك2هبو4 و 4.09 غ كلوريد الصوديوم في 200 مل من الماء المقطر، ومنزوع، ثم اﻷوتوكﻻف في 121 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
    2. السماح بأن الحل لتبرد بدرجة حرارة الغرفة.
    3. إضافة 10 جرام من بروميد هيكساديسيلتريميثيلامونيوم (كتاب) والحرارة إلى 60 درجة مئوية مع إثارة الشغب.
    4. بعد حل كل كتاب إزالة الحل من الحرارة وبارد بدرجة حرارة الغرفة.
  2. إعداد الحل شماعة-6000
    1. حل 300 غرام من البولي إيثيلين جليكول 6000 و 93.5 ز كلوريد الصوديوم في 1 لتر الماء المقطر ومنزوع.
    2. بعد جميع الجزيئات يتم حله، اﻷوتوكﻻف الحل في 121 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
    3. بعد التعقيم، بارد الحل إلى درجة حرارة الغرفة قبل الاستعمال.
  3. القيام باستخراج الحمض النووي
    1. إضافة 500 ميكروليتر من المخزن المؤقت لكتاب و 500 ميكروليتر من الكحول الفينول-كلوروفورم-إيسواميل أنبوب عينة 2 مل ودوامه مجانسة.
    2. نقل محتويات الأنبوبة العينة بأكملها إلى 0.1 التجانس الجسدي مم أنبوب (انظر الجدول للمواد).
    3. مجانسة أنابيب 20 s بتحديد أعلى مرتين، مع وقفه s 20 بين استخدام الخالطون مادية (انظر الجدول للمواد).
    4. الطرد المركزي أنابيب المتجانس في 3,000 س ز لمدة 5 دقائق.
    5. نقل 300 ميكروليتر من المادة طافية إلى أنبوب 1.7 مل نظيفة، وإضافة 500 ميكروليتر من كتاب المخزن المؤقت إلى الأنبوب الأصلي.
    6. مجانسة هذا الأنبوب مرة أخرى باستخدام الأساليب في خطوات 4.3.2-4.3.3 وأجهزة الطرد المركزي في 3,000 س ز لمدة 5 دقائق.
    7. بعد الطرد المركزي، نقل آخر ميكروليتر 300 من المادة طافية إلى الأنبوب الجديد الذي يتضمن الآن 600 ميكروليتر.
    8. إضافة إجمالي 600 الكحول كلوروفورم-إيسواميل ميكروليتر إلى الأنبوب الذي يحتوي على 600 ميكروليتر من المادة طافية.
    9. عكس هذه الأنابيب المزيج ومن ثم الطرد المركزي بإيجاز. نقل 500 ميكروليتر المرحلة العليا لأنبوب مل 1.7 نظيفة. ضمان إلا أن المرحلة الأعلى.
    10. بعد ذلك، إضافة 1000 ميكروليتر من حل شماعة-6000، عكس الأنابيب المزيج ومن ثم احتضانها في درجة حرارة الغرفة ح 2.
    11. وبعد الحضانة، الطرد المركزي هذه الأنابيب في س 18,200 ز، 4 درجة مئوية، لمدة 10 دقائق.
    12. تجاهل المادة طافية وتنظيف بيليه مع الجليد الباردة إيثانول 70%.
    13. الطرد المركزي هذه الأنابيب مرة أخرى في س 18,200 ز، 4 درجة مئوية، لتجاهل المادة طافية 10 كحد أدنى، وتسمح بيليه لتجف في مجلس الوزراء السلامة الأحيائية تحت الاندفاق الصفحي.
    14. بعد بيليه الجافة، إضافة 75 ميكروليتر رناسي الحرة، الدناز مجاناً، والمياه المعقمة لكل أنبوبة.
    15. قياس الحمض النووي ريسوسبينديد بجهاز المطياف الضوئي وثم إرساله للتسلسل الجيني الرنا الريباسي 16S.

5-قصيرة سلسلة الأحماض الدهنية (الهيئة) الكشف والتحليل

  1. ذوبان الجليد العينات المجمدة عند 40 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة واستخراج الأحماض الدهنية قصيرة السلسلة باستخدام إثيل الاثير في نسبة 2:1 (الخامس: الخامس).
  2. نقل المرحلة العضوية إلى GC/MS (انظر الجدول للمواد) مزودة بعمود، 30 م، 0.25 مم معرف، 0.25 ميكرومتر، (انظر الجدول للمواد) حيث يتم حقن 10 ميليلتر.
  3. تعيين منفذ الحقن وحرارة العمود الأولى إلى 260 درجة مئوية و 125 درجة مئوية على التوالي. عقد درجة الحرارة الأولية لمدة 1 دقيقة، ومن ثم قم بزيادة هذا إلى 250 درجة مئوية، وأكثر من 11.5 دقيقة بمعدل تدفق عمود 1 مل/دقيقة.
    ملاحظة: درجة حرارة MS لمصدر أيون هو 220 درجة مئوية و 250 درجة مئوية للواجهة.
  4. تحديد مقدار كل الهيئة استخدام المنحنيات القياسية وحمض 2-ميثيلهيكسانويك كمعيار داخلي.

النتائج

ويصف البروتوكول أعلاه إعداد، التطعيم، وتشغيل نظام 5-مرحلة في المختبر لدراسة الحجمية الأمعاء القولون. لتوليد البيانات المعروضة أدناه، بعد استخراج الحمض النووي، أجرى 16S الرنا الريباسي ماركر تسلسل الحمض النووي الجينات في منطقة V1V2 باستخدام الإنتاجية العالية التسلسل (مثل...

Discussion

وقد وضعت نظم تثقيف في المختبر لدراسة الحجمية الأمعاء الغليظة. وهم يستخدمون أجهزة مصممة لمحاكاة الظروف الفسيولوجية المعدي المعوي، تعزيز نمو مجتمع الميكروبية القناة الهضمية ناضجة لكل منطقة في القولون33. في حين أن مفهوم منطقية ومفهومة، يتطلب تشغيل الفعلي لنظم تثقيف في المختبر ?...

Disclosures

المؤلفين قد لا تضارب المصالح المالية. الإشارة إلى الأسماء التجارية أو المنتجات التجارية في هذا المنشور هو فقط لغرض توفير معلومات محددة ولا يعني توصية أو تأييد من قبل "وزارة الزراعة في الولايات المتحدة". وزارة الزراعة هو موفر تكافؤ الفرص ورب العمل.

Acknowledgements

السيدة أودري توماس-جارينج المسلم للعمل لها GC/MS. كما نود أن نشكر ماسيمو مارزوراتي لتحرير المخطوطة.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
TWINSHIMEProdigestNA
Defined medium (Adult M-SHIME growth medium with starch)ProdigestNA
Masterflex tubingcole ParmerNA
Urine Drainage bagBardNA
LabsorbSigma-AldrichNA
Fecal sampleOpenbiomeNA
SyringesBecton DicksonNA
Defined mediumProdigestNA
Oxgall BileBecton DicksonNA
PancreatinSigma-AldrichNA
Glass wareAce GlassNA
Porcine mucinSigma-AldrichNA
Bacteriological agarSigma-AldrichNA
Sterilization pouchesVWRNA
BeadBugBenchmark ScientificNA
Triple-Pure High Impact Zirconium 0.1 mm Bead beater tubeBenchmark ScientificNA
RNAse free, DNAse free, sterile waterRocheNA
Shimadzu QP2010 Ultra GC/MSShimadzuNA
Stabilwax-DA column, 30 m, 0.25 mm ID, 0.25 µmRestekNA
plastic mucin carriersProdigestNA

References

  1. Johansson, M., Larsson, J., Hansson, G. The two mucus layers of colon are organized by the MUC2 mucin, whereas the outer layer is a legislator of host-microbial interactions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (1), 4659-4665 (2011).
  2. Xu, J., Gordon, J. Honor thy symbionts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (18), 10452-10459 (2003).
  3. Jandhyala, S., Talukdar, R., Subramanyam, C., Vuyyuru, H., Sasikala, M., Reddy, D. Role of the normal gut microbiota. World Journal of Gastroenterology. 21 (29), 8787-8803 (2015).
  4. Macfarlane, G., Macfarlane, S. Models for intestinal fermentation: association between food components, delivery systems, bioavailability and functional interactions in the gut. Current Opinion in Biotechnology. 18 (2), (2007).
  5. McDonald, J., et al. Simulating distal gut mucosal and luminal communities using packed-column biofilm reactors and an in vitro chemostat model. Journal of Microbiological Methods. 108, 36-44 (2015).
  6. Van den Abbeele, P., et al. Arabinoxylans, inulin and Lactobacillus reuteri 1063 repress the adherent-invasive Escherichia coli from mucus in a mucosa-comprising gut model. NPJ Biofilms and Microbiomes. 27 (2), 16016 (2016).
  7. Van den Abbeele, P., Van de Wiele, T., Verstraete, W., Possemiers, S. The host selects mucosal and luminal associations of coevolved gut microorganisms: a novel concept. FEMS Microbiology Reviews. 35 (4), 681-704 (2011).
  8. Van den Abbeele, P., et al. Incorporating a mucosal environment in a dynamic gut model results in a more representative colonization by lactobacilli. Microbial Biotechnology. 5 (1), 106-115 (2012).
  9. Kinross, J., Darzi, A., Nicholson, J. Gut microbiome-host interactions in health and disease. Genome Medicine. 3 (3), 14 (2011).
  10. Wissenbach, D., et al. Optimization of metabolomics of defined in vitro gut microbial ecosystems. International Journal of Medical Microbiology. 306 (5), 280-289 (2016).
  11. McDonald, J., et al. Evaluation of microbial community reproducibility, stability and composition in a human distal gut chemostat model. Journal of Microbiological Methods. 95 (2), 167-174 (2013).
  12. Venema, K., van den Abbeele, P. Experimental models of the gut microbiome. Best Practice and Research. Clinical Gastroenterology. 27 (1), 115-126 (2013).
  13. Krishnan, S., Alden, N., Lee, K. Pathways and functions of gut microbiota metabolism impacting host physiology. Current Opinion in Biotechnology. 36, 137-145 (2015).
  14. Lach, G., Schellekens, H., Dinan, T., Cryan, J. Anxiety, Depression, and the Microbiome: A Role for Gut Peptides. Neurotherapeutics. 15 (1), 36-59 (2018).
  15. Arias-Jayo, N., Alonso-Saez, L., Ramirez-Garcia, A., Pardo, M. Zebrafish Axenic Larvae Colonization with Human Intestinal Microbiota. Zebrafish. 00 (00), (2017).
  16. Zhu, W., Lin, K., Li, K., Deng, X., Li, C. Reshaped fecal gut microbiota composition by the intake of high molecular weight persimmon tannin in normal and high-cholesterol diet-fed rats. Food and Function. 9 (1), 541-551 (2018).
  17. Nguyen, T., Vieira-Silva, S., Liston, A., Raes, J. How informative is the mouse for human gut microbiota research. Disease Model Mechanisms. 8 (1), 1-16 (2015).
  18. Hale, V., et al. Diet Versus Phylogeny: a Comparison of Gut Microbiota in Captive Colobine Monkey Species. Microbial Ecology. 75 (2), 515-527 (2018).
  19. Lu, D., et al. Host contributes to longitudinal diversity of fecal microbiota in swine selected for lean growth. Microbiome. 6 (1), 4 (2018).
  20. Payne, A., Zihler, A., Chassard, C., Lacroix, C. Advances and perspectives in in vitro human gut fermentation modeling. Trends in Biotechnology. 30 (1), 17-25 (2012).
  21. Muegge, B., et al. Diet drives convergence in gut microbiome functions across mammalian phylogeny and within humans. Science. 332 (6032), 970-974 (2011).
  22. Santiago-Rodriguez, T., et al. Chemostat culture systems support diverse bacteriophage communities from human feces. Microbiome. 9 (3), 58 (2015).
  23. Sousa, T., Paterson, R., Moore, V., Carlsson, A., Abrahamsson, B., Basit, A. The gastrointestinal microbiota as a site for the biotransformation of drugs. International Journal of Pharmaceutics. 363 (1-2), 1-25 (2008).
  24. Pferschy-Wenzig, E., Koskinen, K., Moissl-Eichinger, C., Bauer, R. A Combined LC-MS Metabolomics- and 16S rRNA Sequencing Platform to Assess Interactions between Herbal Medicinal Products and Human Gut Bacteria in Vitro: a Pilot Study on Willow Bark Extract. Frontiers in Pharmacology. 8 (893), (2017).
  25. Cueva, C., et al. In vitro fermentation of grape seed flavan-3-ol fractions by human faecal microbiota: changes in microbial groups and phenolic metabolites. FEMS Microbiology Ecology. 83 (3), 792-805 (2013).
  26. Molly, K., Van de Woestyne, M., Verstraete, W. Development of a 5-step multi-chamber reactor as a simulation of the human intestinal microbial ecosystem. Applied Microbiology and Biotechnology. 39 (2), 254-258 (1993).
  27. Wang, M., et al. Apigenin Impacts the Growth of the Gut Microbiota and Alters the Gene Expression of Enterococcus. Molecules. 22 (8), (2017).
  28. Caporaso, J., et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nature Methods. 7 (5), 335-336 (2010).
  29. Edgar, R. Search and clustering orders of magnitude faster than BLAST. Bioinformatics. 26 (19), 2460-2461 (2010).
  30. Cole, J., et al. Ribosomal Database Project: data and tools for high throughput rRNA analysis. Nucleic Acids Research. 42 (database issue), 633-642 (2014).
  31. McDonald, D., et al. An improved Greengenes taxonomy with explicit ranks for ecological and evolutionary analyses of bacteria and archaea. The ISME Journal. 6 (3), 610-618 (2012).
  32. Liu, L. S., et al. Establishing a mucosal gut microbial community in vitro using an artificial simulator. PLoS ONE. 13 (7), e0197692 (2018).
  33. Van de Wiele, T., Van den Abbeele, P., Ossieur, W., Possemiers, S., Marzorati, M., Verhoeckx, K., et al. Chapter 27: The Simulator of the Human Intestinal Microbial Ecosystem (SHIME ®). The Impact of Food Bio-Actives on Gut Health. , (2015).
  34. Van den Abbeele, P., et al. Butyrate-producing Clostridium cluster XIVa species specifically colonize mucins in an in vitro gut model. The ISME Journal. 7 (5), 949-961 (2013).
  35. Possemiers, S., Verthé, K., Uyttendaele, S., Verstraete, W. PCR-DGGE-based quantification of stability of the microbial community in a simulator of the human intestinal microbial ecosystem. FEMS Microbiology Ecology. 49 (3), 495-507 (2004).
  36. Tan, J., McKenzie, C., Potamitis, M., Thorburn, A., Mackay, C., Macia, L. The role of short-chain fatty acids in health and disease. Advances in Immunology. 121, 91-119 (2014).
  37. Yang, J., Kweon, M. The gut microbiota: a key regulator of metabolic diseases. BMB Reports. 49 (10), 536-541 (2016).
  38. Sonnenburg, J., Bäckhed, F. Diet-microbiota interactions as moderators of human metabolism. Nature. 535 (7610), 56-64 (2016).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

144

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved