JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור culturing microbiota את הבטן של המעי הגס במבחנה, באמצעות סדרה של ריאקטורים שמדמות את התנאים הפיזיולוגיים של דרכי עיכול.

Abstract

Microbiota הבטן האנושית תפקיד חיוני בריאות האדם והן המחלה. למדתי את microbiota בטן באמצעות מודל ויוו , קשה בשל טבעה מורכבים, שיוך בתרבית של רכיבים מגוונים. המטרה של פרוטוקול זה היא תרבות של microbiota בטן במבחנה, המאפשר חקר הדינמיקה microbiota בטן, מבלי לשקול את התרומה של הסביבה שבה התרחשה יונקים. שימוש במבחנה טכנולוגיה culturing, התנאים הפיזיולוגיים של דרכי עיכול מדומה, כולל פרמטרים כגון pH, טמפרטורה, anaerobiosis, זמן העברה. פני המעי הגס מדומה על ידי הוספת מצופים mucin נשאים, יצירת שלב הרירית והוספת ממד נוסף. Microbiota הבטן הוא הציג על ידי מזריקים עם החומר צואה אנושית. על חיסון עם תערובת מורכבת זו של חיידקים, חיידקים מסוימים הם מועשרים את שונה האורך (בסדר עולה, רוחבי, יורד נקודתיים) סביבות (luminal והרירית) חציה של המודל במבחנה. זה חיוני לאפשר למערכת כדי להגיע למצב יציב, שבו הקהילה לבין מטבוליטים המיוצר נותרים יציבים. תוצאות הניסוי בכתב היד מדגימים איך הקהילה microbiota בטן חוסנו מתפתח בתוך קהילה יציבה לאורך זמן. ברגע מצב יציב מושגת, המערכת ניתן לנתח אינטראקציות חיידקי ופונקציות הקהילה או כדי לבדוק את ההשפעות של תוספים על microbiota הבטן, כגון מזון, רכיבי מזון או תרופות.

Introduction

Microbiota תחושת הבטן היא קהילה של מיקרו-אורגניזמים השוכנים מערכת העיכול (עוף).  קהילה זו מגיע הריכוז המרבי במעי הגס, אשר מוערך להחזיק 10 חיידקים-1014 13, 500-1, 000 זנים, שחיים סימביוזה עם המעי הגס וחשש1,2. הרכב ואת הפונקציונליות של microbiota בטן שינוי במרחב לאורך הטמבל, ויוצרים אזור ספציפי הקהילות, עם המגוון ביותר נמצאו יש2,3,4,5. עבור כל אזור אנטומי, קהילות נפרדות מיקרוביאלי לשכון לומן, על שורות mucosal6. הקהילה לומן יש גישה ישירה יותר חומרים מזינים כאשר מצעים עוברים תא luminal7. למרות זאת, מתגוררים חיידקים מסוימים מעדיפים בשכבת ריר, ניצול mucin המיוצר על ידי תאי המעי הגס כמו5,81,מקור אנרגיה. ההבדל microenvironments בין השלבים luminal של הרירית גורמת לפיתוח קהילות מסוימות שלב התבדרות. . יחד, קהילות אלה מספקות פונקציות מטבוליות, כגון חילוף החומרים התזונתיים ואת הייצור של ויטמינים, ופונקציות חיסוניות, כגון מניעת הקולוניזציה של פתוגנים האנושי1,3, 9. microbiota הבטן גם פועלת באופן פונקציונלי ב נטיה עם תאי המעי הגס האנושי3.

כחלק חשוב של הטמבל אנושי, זה לא מפתיע כי microbiota הבטן ידועה לתרום שני מארח מחלה ובריאות מצב3,9,10,11,12. שינוי באוכלוסיית חיידקים במעיים שויכה מחלות אנושיות מרובות, כולל הפרעות לגית כמו מחלות מעי העיכול (מחלת המעי הדלקתי), תסמונת המעי המעי (IBS), אך גם מחלות אחרות כגון השמנת יתר, מחלות הדם אוטיזם 3 , 9 , 10 , 11 , 12. מטבוליטים המופק microbiota הבטן יש השפעה גלובלית, להגיע במקומות מרוחקים12,הבטן13. לדוגמה, הציר בטן-מוח מזוהה עם הפרעות נפשיות כמו חרדה ודיכאון14. לכן, לומד microbiota על הבטן חשובה שדות מרובים של מחקר, החלים על מחלות רבות, אפילו אלה קשורה לא לעיתים קרובות עם הטמבל.

אמנם זה נרחב הוא הודה כי לימוד microbiota את הבטן חשוב, היא מאמץ מורכב. מודלים בעלי חיים מרובים זמינים, של חיות קטנות כמו דג זברה, חולדות ועכברים, גדולים כמו קופים וחזירים15-19. עם זאת, היישום של החיות האלה במונחים microbiota בטן האדם הוא לא פשוטה, שכן החיות האלה יש ייחודי חיידקי קהילה אשר התפתח בהתבסס על הסביבה ותזונה, הם נבדלים מבחינה אנטומית בני20 , 21. השימוש של ניסויים מסיר את השאלה של רלוונטיות אך מציג קבוצה נוספת של אתגרים. מחקרים בבני אדם יקר, זמן רב, והם מבחינה אתית מאולצות11. יתר על כן, גורמים מבלבלים להשפיע microbiota את הבטן מחקרים בבני אדם, כולל גיל או שלב התפתחותי, הסביבה, תזונה, תרופות של גורמים גנטיים2,4,22.  ישנם גם הגבלות על מה יכול להיבדק אצל בני אדם, ועל איזה סוג של דגימות ניתן לקצור במה פי4.

חיסרון קריטי אחד של באמצעות מערכת ויוו ללמוד את microbiota הבטן היא הנוכחות של רכיבים יונקים. בטן microbiota של תאים אנושיים לתקשר אחד עם השני, ויוו הגדרת, זה בלתי אפשרי להבדיל בין השניים. מטבוליטים המיוצר על ידי microbiota הבטן נלקחים על ידי תאי המעי הגס, כך מדידות אין אפשרות לחשב בדייקנות. לכן, בכל מחקר מכניסטית חייב להיות מוגבל ל- מדדים מובילים11. חיסרון גדול נוסף ללימודי אין ויוו הוא חוסר היכולת הקציר דגימות מאזורים שונים של הטמבל longitudinally23. זה אינו מאפשר ההערכה של שינויים עלולה להתרחש microenvironments של המעי הגס לאורך זמן12.  אין ויוו מחקרים רבים, כולל מחקרים בבני אדם, מסתמכים על ניתוח של דגימות צואה כדי לזהות שינויים בטן microbiota12. אמנם זה אינפורמטיבי, הוא אינו מספק נתונים על microbiota הבטן מעבר הטמבל, אינו מבדיל בין7,86,5,luminal ובקהילות הרירית.

עבור microbiota הבטן, היישום של שיטת במבחנה נדרש ללמוד את הדינמיקה של הקהילה חיידקי, ללא התערבות של הרכיבים יונקים. באמצעות שיטת במבחנה מאפשר עבור הפקד חזק של תנאים סביבתיים10, בדיקה של פרמטרים מרובים בו זמנית, את היכולת לטעום longitudinally, בנפחים גדולים11. מאז שיטת הפריה מנצל מכנית, לא מארח, אין שיקולים נדרשים עבור גיל, הסביבה, דיאטה או הרקע הגנטי. מערכות אלה ניתן להשתמש כדי לבדוק גם בטן שלמה microbiota לקהילה, נבחרו רק אורגניזמים, או אפילו יחיד זנים. חשוב לציין, התוצאות במבחנה לשחזור, עדיין שומרים על רמה של גיוון להשוות מחקרים ויוו11,22.

בהתאם את ההשערה המדובר את התוצאות הרצויות, אני לימודיחוץ גופית n יכול להתבצע במספר דרכים.  הם יכולים לנצל שיטות פשוטות, כגון המקננת דגימות עם צואה homogenate24 או ביצוע אצווה אחת התרבויות במשך 24-48 שעות25ומערכות כלי יחיד. הם יכולים גם להתבצע באמצעות כלי יחיד מערכות ושיטות מורכבים יותר, כגון באמצעות מערכת chemostat לייצר קהילה מיקרוביאלית של הבטן יציבה11. עם זאת, השימוש של כור יחיד יכול יתר לפשט microbiota12 מאחר והוא רק מייצג מקטע אחד של המעי הגס, אף-על-פי המעי הגס מורכב של האזורים עולה, רוחבי, יורד.

על מנת ללמוד את הקהילה microbiota בטן שמתפתח באזורים שונים של המעי הגס (בסדר עולה, רוחבי, יורד האזורים), יכול להיות מועסק מערכת מורכבת, רב שלבית. במערכות אלו, הוגדרו מספר כלי כדי לחקות את האזורים השונים של המעי הגס, כך microbiota הבטן של האזורים עולה, רוחבי, יורד מעובדות באופן עצמאי. כלים אלה מחוברים, באמצעות משאבות לזוז סובסטרטים ברצף, מסדר עולה כדי רוחבי לאזורים המעי הגס היורד, מחקה את הזרימה של חומרים מזינים דרך הטמבל.

מטרת מחקר זה היתה כדי להדגים כיצד מערכת תרבות במבחנה 5 שלבים (ראה טבלה של חומרים) ניתן להשתמש כדי לטפח את הקהילה microbiota בטן, וכדי להדגים הקהילה dynamics מבחינת יציבות הרכב. במערכת זו, לכלי אחד מייצג את הבטן, אחד מייצג את המעי הדק. המעי הגס מחולק לשלושה אזורים (בסדר עולה, רוחבי, יורד), לכלי אחד המייצג את כל אזור26. הגדרת הניסוי הזה, שתי מערכות מלאה היו לפעול במקביל, עם יחידה 1 המכיל mucin נשאים כדי מייצג את השטח הרירית, יחידה 2 המכיל אין נושאות mucin. הקהילות שהתפתח בשלבים luminal, הרירית של כל אזור הושוו אחד לשני, וכדי את inoculum צואה לאורך זמן באמצעות מטוסי אף-16 rRNA ג'ין רצף וניתוח SCFA. התוצאות שהוצגו מדגימים את הסוג של הקהילה, הן מבחינת קומפוזיציה ופונקציונליות, אשר ניתן להפיק במבחנה מערכת מסוג זה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. תכשירים וחומרים

הערה: המדיום מוגדר נרכש כאבקה (ראה טבלה של חומרים). ההרכב של המדיום המוגדרים ב- g/L הוא הדברים הבאים: Arabinogalactan (1.2), פקטין (2.0), Xylan (0.5), גלוקוז (0.4), תמצית שמרים (3.0), מיוחד peptone (1.0), Mucin (2.0), L-ציסטאין-HCl (0.2).

  1. להכין המדיום מוגדר
    1. למלא בקבוקון 4 L 2 ל' מים מזוקקים, יונים כפול.
    2. להוסיף 29.2 גר' אבקה מוגדר בינוני למים ולערבב יחידה שלמה הומוגני.
    3. להוסיף על פגים, בורג רופף על המכסה.
    4. אוטוקלב ב 121 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
    5. לאחר קירור לאחסן המדיום מוגדר מוכן במקרר ב 4 ° C עם עצבנות מתמדת (פגים).
  2. הכינו מיץ הלבלב
    1. אוטוקלב הוסיף 2 ל' מים מזוקקים, יונים מגרגרי 5L עם בר קדירות, ב 121 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
    2. לאחר autoclaving, מאפשרים למים להתקרר לטמפרטורת החדר.
    3. להוסיף 12.5 גרם NaHCO3, מרה 6 g ו- 0.9 g pancreatin. מניחים על פגים לערבב.
      הערה: צריך להיות מוכן טרי כל 2-3 ימים, בקירור עם עצבנות אחרי זה גרם מיץ הלבלב.
  3. מאגר פוספט
    1. המקום בקבוקון 1 ליטר המכיל בר פגים פגים. להוסיף חצי ליטר של מים מזוקקים, יונים והפעל עצבנות.
    2. לאחר מכן, הוסף 6.8 ג' ח'2PO4, 8.8 g K2HPO4ו- 0.1 גר' נתרן thioglycolate. בנוסף עם מים כדי נפח סופי של 1 ל'
    3. לאחר הרכיבים יש התפרקה לחלוטין, להתאים את רמת ה-pH אל 7.0 באמצעות NaOH.
    4. שופכים את המאגר לתוך קיבול 2 ל' עם פקקי בורג מכסה אוטוקלב ב 121 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות ודא שדפק המכסה על רופף ולא שהחלונות סגורים.
    5. לאחר הסרת החיטוי, לאפשר הפתרון לקרר את טמפרטורת החדר. אחסן את המאגר בטמפרטורת החדר עד 2 שבועות.
  4. להכין Mucin אגר נשאים
    1. אוטוקלב mucin פלסטיק נשאים (ראה טבלה של חומרים), מלקחיים, רשת פלסטיק (הצורה צינורי) ו zip קשרים ב 131 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
    2. אוטוקלב 300 מ של זוגיות מזוקקים, מיונן מים ב 131 ° C במשך 30 דקות החנות בטמפרטורת החדר עד השימוש.
    3. אבטחה ארון עם הזרם שכבתית, למלא עקר פטרי עם נשאים mucin פלסטיק באמצעות מלקחיים סטרילי.
      הערה: Mucin המובילים הם חוגים פלסטיק חלול מלאים mucin אגר. מילא פעם אחת, ניתן למקם את המכסה למעלה, אלה ניתן להגדיר הצידה.
    4. כדי להכין mucin אגר, להוסיף דור 3 של חיידקי אגר, 15 גר' mucin חזירי 300 מ ל מים בלוק.
    5. בשכונה fume, להרתיח פתרון זה, לאחר מכן להסיר את מקור החום, להתקרר כי מינימלית 1 חוזר על רתיחה וקירור בסך 3 פעמים.
    6. לאחר כלי זכוכית המכיל את הפתרון אגר mucin גזעיות מספיק. כדי לגעת, להעביר זה אבטחה ארון עם זרימה שכבתית.
    7. באבטחה ארון עם הזרם שכבתית, שופכים את אגר mucin נוזלי לחברות התעופה mucin פלסטיק הונחו בצלוחית הפטרי. ודא כי כל נשאי מלאים לחלוטין mucin אגר.
    8. מקם את המכסה על הפטרי ולאפשר לה להתקרר תחת זרימה שכבתית.
    9. להרכיב את נושאות mucin, לקחת את הפלסטיק הרשת בלוק והכנס נושאות mucin המכיל את mucin הקרושה אגר מ הפטרי באמצעות מלקחיים סטרילי.
    10. להשתמש קשרים zip כדי לסגור את הקצוות של רשת השינוי. בדרך זו הפונקציות נטו להכיל נושאות mucin מלא mucin אגר. לאחסן ב 4 ° C עד השימוש.

2. קבע, חיסון, וריצה של המערכת

  1. הקמה של מערכת culturing
    הערה:     סימולטור התאום של המערכת האקולוגית מיקרוביאלית מעיים אנושיים נעשה שימוש במחקר זה.
    1. מקום 10 ריאקטורים המכיל קדירות סורגים על חימום/קירור והפעל עצבנות.
      הערה: כל יחידה יכלול 5 ריאקטורים, אז 2 יחידות ידרוש ריאקטורים 10.
    2. להתחבר ריאקטורים 5 זו לזו באמצעות סיליקון אבובים ברצף בדרך של המשאבה ממברנות (איור 1). להשתמש המשאבות רוחבי התכנים נוזלים מן ביוריאקטור אחד למשנהו.
    3. תווית של ריאקטורים ברצף הבא: הקיבה, המעי הדק, המעי היורד, המעי הגס, יורד המעי הגס כדי לייצג את סדר מערכת העיכול.
      הערה: ריאקטורים יכולים להיות זהים, או ריאקטורים הקיבה והמעי הדק ניתן קטן יותר להשוות את המעי הגס ריאקטורים מאז הם יחזיקו פחות ווליום. הגדרת ריאקטורים בדרך זו אומר כי באזור המעי הגס עולה מקבל חומרים מזינים מן המעי הדק, המעי הגס באזור מקבל חומרים מזינים מאזור המעי הגס עולה, אזור המעי הגס היורד מקבל חומרים מזינים אזור רוחבי. בדרך זו, המערכת מחקה את התנועה רציפים של חומרים מזינים דרך מערכת העיכול.
    4. המקום המדיום מוגדרים, מיץ הלבלב במקרר ב 4 ° C עם עצבנות מתמדת באמצעות חימום/קירור. באמצעות סיליקון אבובים, להתחבר המדיום מוגדר ביוריאקטור הקיבה באמצעות משאבה סחרור וחבר את מיץ הלבלב אל המעי הדק באמצעות משאבה סחרור.
    5. להוסיף שהשרף מתהווה לסוכן שקית ניקוז שתן. להתחבר שק ניקוז שתן באמצעות משאבת סחרור המעי הגס. תשליך הקרושה כפסולת ביולוגית במהלך הניסוי.
    6. באמצעות סיליקון אבובים, חבר את הז'קט המים של כל ספינה וספינה הסדר ולאחר להתחבר בכל קצה האמבטיה במחזור המים. למלא את האמבט במים במחזור עם מים מזוקקים (סכום זה משתנה בהתאם לסוג במחזור המים הרותחים בשימוש), מוגדר כ- 37 מעלות צלזיוס.
    7. באמצעות סיליקון אבובים, להתחבר החומצה והבסיס המכסה של כל ספינה וספינה בדרך של משאבות סחרור. הריכוזים המומלצים הם 0.5 M HCl 0.5 M NaOH.
    8. הכנס את ה-pH הגששים כל לכלי דרך ליציאה ייעודית המכסה. יציאה זו נועדה להחזיק את המכשיר pH בורג לתוך המכסה (איור 1). הגדר את ה-pH לכל אזור כדלקמן: בבטן, pH = 2; המעי הדק, pH = 6.7-6.9; הגס עולה, pH = 5.6-5.9; המעי הגס, pH = 6.15-6.4; המעי הגס, pH = 6.6-6.9.
      הערה: בשלב הראשוני, הקהילה להבדיל בהתבסס על ההבדל בערכי pH באזור. עם זאת, ברגע מחזורי האכלה מתחיל, הקהילות נוסף שתתבגרי המבוסס על הבדלי קלט התזונתי.
    9. מחברים קו חנקן באמצעות סיליקון אבובים על המכסה של כל ספינה וספינה באמצעות ליציאה ייעודית. הקו חנקן צריך לזרום ברצף הבא: הקיבה, המעי הדק, המעי היורד, המעי הגס, יורד המעי הגס. להבטיח שלכל יחידה יש משלו סומק כדי למנוע זיהום לחצות.
      הערה: חנקן משמש חמצן שהוסר מהמערכת ושומר anaerobiosis במהלך הניסוי.
    10. הכנס צינור מתכת מדגם דרך המכסה של כל ביוריאקטור באמצעות ליציאה ייעודית. צינורית המתכת מתפשט. למטה לתוך ביוריאקטור והוא משמש כדי לאסוף דגימות הנוזל.
    11. הוסף פיסת סיליקון אבובים קטן לקצה העליון של הצינור מדגם וחבר מנעול סכינים סטריליים כדי לאפשר השימוש מזרק במהלך הדגימה.
  2. חיסון של המערכת
    1. למלא את האזורים קולון עם המדיום מוגדרים באמצעות אמצעי האחסון הבאים: 500 מ"ל במעי הגס עולה 800 מ ל המעי הגס, 600 מ ל המעי הגס.
    2. הוסף mucin אגר נושאות לאזורים נקודתיים, בסכום ביחס לנפח של הכור. עבור ניסוי זה, שימשו נושאות 60 לכל כור.
    3. הסר כל מדיום מוגדר עודף באמצעות הצינור מדגם ומזרק מאז הוספת נושאות מעלה את רמת נוזלים ביוריאקטור.
    4. הפעל את הגששים pH כדי להתאים את ה-pH של כל בכור באמצעות המחשב.
    5. הפעל את הסומק חנקן כעשרים דקות.
      הערה: Homogenate צואה המשמש עבור חיסון נרכש כמו צואה 10% הומוגני בפתרון גליצרול 10% (ראה טבלה של חומרים). דגימת צואה נבחר באופן אקראי מתוך מאגר של תורמים עם הקריטריונים הבאים: אמריקאי לצרוך דיאטה מערבית טיפוסית (לא טבעוני או צמחוני), בגילאי 21-45, אנטיביוטיקה ללא תשלום במשך שנה אחת לפחות, עם אינדקס מסת הגוף הממוצע (18.5-24.9) . עבור פרוטוקול זה, נעשה שימוש רק תורם יחיד. אולם, זה יכול להשתנות עקב תכנון ניסויים.
    6. לפני חיסון להפשיר את homogenate צואה בעקבות הנחיות היצרן.
    7. לחסן כל בכור קולון על-ידי הוספת homogenate צואה על סכום שווה ערך ל- 5% של אמצעי האחסון הכור דרך הנמל לדוגמה, באמצעות מזרק 60 מ ל (25 mL עבור הגס עולה, 40 מ"ל של המעי הגס, 30 מ של המעי הגס).
    8. לגדול תרבויות ריאקטורים בין לילה עם pH שליטה.
    9. לאחר הגידול לילה, לקצור דגימות מהנוזל luminal של כל אזור המעי הגס כמפורט להלן בסעיף 3. לאחר השלמת דגימה, הפעל את התוכנית למחשב כדי להתחיל להאכיל.
  3. יומי האכלה מחזורים
    הערה:     מחזורי ההאכלה היומית הם המחשב אוטומטית.
    1. שלוש פעמים ביום, משאבה 140 מ של המדיום מוגדרים לתוך ביוריאקטור הקיבה והתירו את תקופת דגירה של 1 h.
    2. לאחר דגירה 1 h, לשאוב את תוכן הקיבה אל המעי הדק. במקביל, משאבה 60 מ של מיץ הלבלב לתוך המעי.
    3. במעי הדק, להפעיל התאמת חומציות pH 6.7-6.9, ולאפשר את התערובת עד תקופת דגירה של 90 דקות. במהלך הדגירה, הפעל את הסומק חנקן עבור כל מערכת עבור סכום כולל של 10 דקות כל אחד.
    4. לאחר 90 דקות הדגירה, להפעיל את המשאבות של המעי הגס עולה, עולה המעי הגס של המעי הגס, את המעי הגס המעי הגס, המעי הגס היורד אל הפסולת בו זמנית.
  4. ציר הזמן ניסיוני
    הערה:     במבחנה מערכת המשמשת כאן מופעל באופן רציף במשך 8 שבועות בקירוב אורך. מתחת ציר ניסיוני המומלצת, עם זאת, זה יכול להיות שונה בהתאם לדרישות מטרת הניסוי.
    1. להגדיר את המערכת בשלבים הבאים ברשימה בשלב 2.1.
    2. קציר דגימות לילה צמיחה בעקבות לפרוטוקול להלן. מתחילים את מחזורי יומי, האכלה שלוש פעמים ביום בעקבות בפרוטוקול לעיל.
    3. הפעל את הניסוי עבור סכום כולל של 2 שבועות כדי לאפשר לחיידקים לייצב.
      הערה: הפעלת המערכת אומר כי ה-pH נשמר, המחזורים ההאכלה היומית לאחר מכן שלוש פעמים ביום, נושאות הרירית מוחלפים 2 - 3 פעמים כל שבוע.
    4. לאחר ייצוב, להפעיל את הניסוי 2 שבועות תקופת שליטה.
    5. לאחר תקופת שליטה, להשתמש במערכת כדי לבדוק מרכיבים שונים או משתנים, המכונה תקופת הטיפול.
    6. לאחר תקופת הטיפול, להפסיק להוסיף ברכיבים או משתנים ולחזור התנאים לקדמותם. זה נחשב לתקופה שטיפת והוא משמש כדי לקבוע אם השינויים לקהילה קבוע.

3. איסוף דגימות מן המערכת

הערה: במהלך הניסוי, דגימות ובביצים השלב luminal או הרירית בכל אזור בכל עת, בעקבות להלן הנחיות.

  1. קציר דוגמאות luminal
    1. הקציר luminal דגימות הנוזל דרך היציאה מדגם המרחיבה לאמצע הנוזל תרבות. התחל על-ידי ניקוי המנעול סכינים סטריליים ביציאה מדגם עם 70% אתנול או משטח אלכוהול קטנה, אפשר להתייבש.
    2. להבטיח כי כל האוויר יוסר מזרק 30 מ ל וחבר אותו ליציאת ה-לדוגמה. לצייר 3 - 5 פעמים למעלה ולמטה כדי להבטיח לערבב רכיבי כלי השיט. לאחר מכן, צייר סך של 30 מ של תרבות.
    3. Aliquot הדגימות luminal כמו הצורך לתוך צינורות סטרילי בז, חנות על קרח. לאחר דגימה השלמת העברת את זה מקפיא-80 ° C.
    4. לניתוח SCFA, 15 מ"ל של המדגם luminal מסובב ב 4 ° C, x 5,000 g עבור 10 דקות. תגובת שיקוע הוא מזרק מסונן באמצעות מסנן 0.2 μM PES. לאחסן את תגובת שיקוע המסוננות ב-80 מעלות צלזיוס.
      1. ניתוח הדנ א, ספין 1 מ"ל של נוזל luminal ב 4 ° C, x 5,000 g עבור 10 דקות לבטל את תגובת שיקוע ולאחסן בגדר ב-80 מעלות צלזיוס.
      2. כגיבוי, חנות 10 מ של נוזל luminal ב-80 מעלות צלזיוס עבור רוב הניסויים.
  2. קציר דגימות הרירית
    הערה:     שינוי הרירית נושאות כל 2-3 ימים.
    1. הסר, להוציא נושאות mucin מוכן מהמקרר.
    2. הפעל את הסומק חנקן ולאחר לפתוח את המכסה הכור במהירות. להסיר 50% נשאים mucin ולהוסיף חדשים.
    3. לסגור את המכסה במהירות ולשמור את החנקן סומק על עוד כעשרים דקות.
    4. להפקת DNA, aliquot 0.25-0.5 גר' אגר לתוך צינור 2 מ"ל מאוחסנת ב- 80 ° C עד שהוא נדרש.

4. DNA החילוץ, רצף, וניתוח

הערה: ה-DNA מופק באמצעות שיטת מיצוי CTAB DNA עם המגון הפיזי הוד fume29. לאחר החילוץ, ספקטרופוטומטרים משמש כדי לכמת את כמות ה-DNA בכל מדגם.

  1. הכנת מאגר CTAB
    1. להמיס 4.2 g K-2-HPO-4 של 4.09 g NaCl ב- 200 מ ל מים מזוקקים, יונים, אז אוטוקלב ב 121 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
    2. אפשר לתמיסה להתקרר לטמפרטורת החדר.
    3. להוסיף 10 גרם של Hexadecyltrimethylammonium ברומיד (CTAB) ומחממים עד 60 ° צלזיוס עם עצבנות.
    4. אחרי כל CTAB מחוסלת, הסר את הפתרון של חום וקריר לטמפרטורת החדר.
  2. להכין פתרון פג-6000 ש ח
    1. ממיסים 300 גרם של פוליאתילן גליקול 6,000 ו 93.5 g NaCl ב- 1 ליטר של מים מזוקקים, יונים.
    2. לאחר כל החלקיקים הם מומס, החיטוי הפתרון ב 121 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
    3. לאחר autoclaving, מגניב הפתרון לטמפרטורת החדר לפני השימוש.
  3. לבצע הפקת דנ א
    1. להוסיף 500 μL CTAB מאגר μL 500 של פנול-כלורופורם-Isoamyl אלכוהול 2 mL מדגם צינור ו מערבולת כדי homogenize.
    2. להעביר את כל התוכן של הצינור מדגם 0.1 מ"מ הפיזי homogenizing צינור (ראה טבלה של חומרים).
    3. Homogenize צינורות 20 s ב הגבוה ביותר הגדרת שתי פעמים, עם הפסקה s 20 שביניהן, באמצעות מהמגן פיזית (ראה טבלה של חומרים).
    4. Centrifuge הצינורות homogenized ב x 3000 g במשך 5 דקות.
    5. להעביר μL 300 של תגובת שיקוע צינור נקי, 1.7 מ"ל ולהוסיף 500 μL CTAB מאגר הצינור המקורי.
    6. Homogenize הצינור הזה שוב באמצעות השיטות 4.3.2-4.3.3 צעדים, צנטריפוגה ב x 3000 g למשך 5 דקות.
    7. לאחר צנטריפוגה, להעביר עוד 300 μL של תגובת שיקוע הצינור החדש אשר כעת מכיל 600 μL.
    8. להוסיף סך של 600 μL כלורופורם-Isoamyl אלכוהול הצינור המכיל 600 μL של תגובת שיקוע.
    9. היפוך הצינורות כדי לערבב ולאחר מכן צנטריפוגה בקצרה. העברת μL 500 השלב העליון צינור נקי mL 1.7. ודא רק לקחת את השלב העליון.
    10. לאחר מכן, להוסיף 1000 μL של פג-6000 פתרון, היפוך הצינורות כדי לערבב ולאחר מכן דגירה בטמפרטורת החדר במשך שעתיים.
    11. לאחר דגירה, centrifuge הצינורות ב 18,200 x g, 4 מעלות צלזיוס, למשך 10 דקות.
    12. למחוק את תגובת שיקוע ולנקות את גלולה עם אתנול 70% קר קרח.
    13. Centrifuge צינורות שוב ב 18,200 x g, 4 מעלות צלזיוס, במשך 10 דקות לבטל את תגובת שיקוע ולאפשר בגדר יבש בארון אבטחה מתחת זרימה שכבתית.
    14. לאחר בגדר יבש, להוסיף μL 75 RNAse חינם, DNAse חינם, במים סטריליים כל שפופרת.
    15. לכמת את הדנ א resuspended על ידי ספקטרופוטומטרים ולאחר מכן לשלוח אותה עבור מטוסי אף-16 rRNA ג'ין רצף.

5. קצרות שרשרת חומצת שומן (SCFA) זיהוי וניתוח

  1. להפשיר את הדגימות קפוא ב 40 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות ולחלץ חומצות שומן קצרות שרשרת באמצעות דיאתיל אתר ביחס 2:1 (v: v).
  2. להעביר את שלב אורגני כדי GC/MS (ראה טבלה של חומרים) מצוידים עם עמודה, 30 מ', 0.25 מ"מ מזהה, 0.25 מיקרומטר, (ראה טבלה של חומרים) שבו מוזרק 10 µL.
  3. להגדיר טמפרטורה יציאת הזרקה, עמודה הראשונית טמפרטורה 260 ° C ו- 125 º C בהתאמה. החזק את הטמפרטורה ההתחלתית עבור 1 דקות ולאחר מכן הגדל את זה עד 250 מעלות צלזיוס, מעל 11.5 דקות עם קצב זרימה עמודה של 1 מ"ל לדקה.
    הערה: הטמפרטורה MS עבור המקור יון הוא 220° C 250° C עבור הממשק.
  4. לכמת את כמות כל SCFA באמצעות עקומות רגיל ו- 2-methylhexanoic חומצה כמו תקן פנימי.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

הפרוטוקול הנ ל מתאר את הגדר, חיסון, ריצה של 5 שלבים מערכת במבחנה ללמוד את microbiota הבטן של המעי הגס. כדי ליצור את הנתונים שיובאו להלן, בעקבות הפקת דנ א, מטוסי אף-16 rRNA סמן גנטי רצפי DNA של האזור V1V2 בוצעה באמצעות התפוקה גבוהה רצף (כגון, MiSeq אילומינה פלטפורמה) על ידי המרכז Microbiome ב?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

מערכות culturing in vitro פותחו כדי ללמוד את microbiota הבטן של המעי הגס. הם משתמשים שההדרכה נועד לדמות את התנאים הפיזיולוגיים של דרכי עיכול, לקדם את הצמיחה של קהילה מיקרוביאלית מעיים בוגרת לכל אזור של המעי הגס33. בעוד המושג לוגי ומובן, הניהול בפועל של מערכות culturing in vitro ללמוד את microbiota הבטן דו...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

המחברים יש אין אינטרסים כלכליים מתחרים. איזכור שמות מסחריים או מוצרים מסחריים בפרסום זה אך ורק לצורך אספקת מידע ספציפי, לא משתמע המלצה או אישור על ידי מחלקת החקלאות של ארצות הברית. משרד החקלאות הוא הזדמנות שווה ספק המעסיק.

Acknowledgements

מיס אודרי תומאס-Gahring הוא הודה לה GC/MS לפעול. כן נרצה להודות מאסימו Marzorati לעריכת כתב היד.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
TWINSHIMEProdigestNA
Defined medium (Adult M-SHIME growth medium with starch)ProdigestNA
Masterflex tubingcole ParmerNA
Urine Drainage bagBardNA
LabsorbSigma-AldrichNA
Fecal sampleOpenbiomeNA
SyringesBecton DicksonNA
Defined mediumProdigestNA
Oxgall BileBecton DicksonNA
PancreatinSigma-AldrichNA
Glass wareAce GlassNA
Porcine mucinSigma-AldrichNA
Bacteriological agarSigma-AldrichNA
Sterilization pouchesVWRNA
BeadBugBenchmark ScientificNA
Triple-Pure High Impact Zirconium 0.1 mm Bead beater tubeBenchmark ScientificNA
RNAse free, DNAse free, sterile waterRocheNA
Shimadzu QP2010 Ultra GC/MSShimadzuNA
Stabilwax-DA column, 30 m, 0.25 mm ID, 0.25 µmRestekNA
plastic mucin carriersProdigestNA

References

  1. Johansson, M., Larsson, J., Hansson, G. The two mucus layers of colon are organized by the MUC2 mucin, whereas the outer layer is a legislator of host-microbial interactions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (1), 4659-4665 (2011).
  2. Xu, J., Gordon, J. Honor thy symbionts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (18), 10452-10459 (2003).
  3. Jandhyala, S., Talukdar, R., Subramanyam, C., Vuyyuru, H., Sasikala, M., Reddy, D. Role of the normal gut microbiota. World Journal of Gastroenterology. 21 (29), 8787-8803 (2015).
  4. Macfarlane, G., Macfarlane, S. Models for intestinal fermentation: association between food components, delivery systems, bioavailability and functional interactions in the gut. Current Opinion in Biotechnology. 18 (2), (2007).
  5. McDonald, J., et al. Simulating distal gut mucosal and luminal communities using packed-column biofilm reactors and an in vitro chemostat model. Journal of Microbiological Methods. 108, 36-44 (2015).
  6. Van den Abbeele, P., et al. Arabinoxylans, inulin and Lactobacillus reuteri 1063 repress the adherent-invasive Escherichia coli from mucus in a mucosa-comprising gut model. NPJ Biofilms and Microbiomes. 27 (2), 16016(2016).
  7. Van den Abbeele, P., Van de Wiele, T., Verstraete, W., Possemiers, S. The host selects mucosal and luminal associations of coevolved gut microorganisms: a novel concept. FEMS Microbiology Reviews. 35 (4), 681-704 (2011).
  8. Van den Abbeele, P., et al. Incorporating a mucosal environment in a dynamic gut model results in a more representative colonization by lactobacilli. Microbial Biotechnology. 5 (1), 106-115 (2012).
  9. Kinross, J., Darzi, A., Nicholson, J. Gut microbiome-host interactions in health and disease. Genome Medicine. 3 (3), 14(2011).
  10. Wissenbach, D., et al. Optimization of metabolomics of defined in vitro gut microbial ecosystems. International Journal of Medical Microbiology. 306 (5), 280-289 (2016).
  11. McDonald, J., et al. Evaluation of microbial community reproducibility, stability and composition in a human distal gut chemostat model. Journal of Microbiological Methods. 95 (2), 167-174 (2013).
  12. Venema, K., van den Abbeele, P. Experimental models of the gut microbiome. Best Practice and Research. Clinical Gastroenterology. 27 (1), 115-126 (2013).
  13. Krishnan, S., Alden, N., Lee, K. Pathways and functions of gut microbiota metabolism impacting host physiology. Current Opinion in Biotechnology. 36, 137-145 (2015).
  14. Lach, G., Schellekens, H., Dinan, T., Cryan, J. Anxiety, Depression, and the Microbiome: A Role for Gut Peptides. Neurotherapeutics. 15 (1), 36-59 (2018).
  15. Arias-Jayo, N., Alonso-Saez, L., Ramirez-Garcia, A., Pardo, M. Zebrafish Axenic Larvae Colonization with Human Intestinal Microbiota. Zebrafish. 00 (00), (2017).
  16. Zhu, W., Lin, K., Li, K., Deng, X., Li, C. Reshaped fecal gut microbiota composition by the intake of high molecular weight persimmon tannin in normal and high-cholesterol diet-fed rats. Food and Function. 9 (1), 541-551 (2018).
  17. Nguyen, T., Vieira-Silva, S., Liston, A., Raes, J. How informative is the mouse for human gut microbiota research. Disease Model Mechanisms. 8 (1), 1-16 (2015).
  18. Hale, V., et al. Diet Versus Phylogeny: a Comparison of Gut Microbiota in Captive Colobine Monkey Species. Microbial Ecology. 75 (2), 515-527 (2018).
  19. Lu, D., et al. Host contributes to longitudinal diversity of fecal microbiota in swine selected for lean growth. Microbiome. 6 (1), 4(2018).
  20. Payne, A., Zihler, A., Chassard, C., Lacroix, C. Advances and perspectives in in vitro human gut fermentation modeling. Trends in Biotechnology. 30 (1), 17-25 (2012).
  21. Muegge, B., et al. Diet drives convergence in gut microbiome functions across mammalian phylogeny and within humans. Science. 332 (6032), 970-974 (2011).
  22. Santiago-Rodriguez, T., et al. Chemostat culture systems support diverse bacteriophage communities from human feces. Microbiome. 9 (3), 58(2015).
  23. Sousa, T., Paterson, R., Moore, V., Carlsson, A., Abrahamsson, B., Basit, A. The gastrointestinal microbiota as a site for the biotransformation of drugs. International Journal of Pharmaceutics. 363 (1-2), 1-25 (2008).
  24. Pferschy-Wenzig, E., Koskinen, K., Moissl-Eichinger, C., Bauer, R. A Combined LC-MS Metabolomics- and 16S rRNA Sequencing Platform to Assess Interactions between Herbal Medicinal Products and Human Gut Bacteria in Vitro: a Pilot Study on Willow Bark Extract. Frontiers in Pharmacology. 8 (893), (2017).
  25. Cueva, C., et al. In vitro fermentation of grape seed flavan-3-ol fractions by human faecal microbiota: changes in microbial groups and phenolic metabolites. FEMS Microbiology Ecology. 83 (3), 792-805 (2013).
  26. Molly, K., Van de Woestyne, M., Verstraete, W. Development of a 5-step multi-chamber reactor as a simulation of the human intestinal microbial ecosystem. Applied Microbiology and Biotechnology. 39 (2), 254-258 (1993).
  27. Wang, M., et al. Apigenin Impacts the Growth of the Gut Microbiota and Alters the Gene Expression of Enterococcus. Molecules. 22 (8), (2017).
  28. Caporaso, J., et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nature Methods. 7 (5), 335-336 (2010).
  29. Edgar, R. Search and clustering orders of magnitude faster than BLAST. Bioinformatics. 26 (19), 2460-2461 (2010).
  30. Cole, J., et al. Ribosomal Database Project: data and tools for high throughput rRNA analysis. Nucleic Acids Research. 42 (database issue), 633-642 (2014).
  31. McDonald, D., et al. An improved Greengenes taxonomy with explicit ranks for ecological and evolutionary analyses of bacteria and archaea. The ISME Journal. 6 (3), 610-618 (2012).
  32. Liu, L. S., et al. Establishing a mucosal gut microbial community in vitro using an artificial simulator. PLoS ONE. 13 (7), e0197692(2018).
  33. Van de Wiele, T., Van den Abbeele, P., Ossieur, W., Possemiers, S., Marzorati, M. Chapter 27: The Simulator of the Human Intestinal Microbial Ecosystem (SHIME ®). The Impact of Food Bio-Actives on Gut Health. Verhoeckx, K., et al. , Springer Link. (2015).
  34. Van den Abbeele, P., et al. Butyrate-producing Clostridium cluster XIVa species specifically colonize mucins in an in vitro gut model. The ISME Journal. 7 (5), 949-961 (2013).
  35. Possemiers, S., Verthé, K., Uyttendaele, S., Verstraete, W. PCR-DGGE-based quantification of stability of the microbial community in a simulator of the human intestinal microbial ecosystem. FEMS Microbiology Ecology. 49 (3), 495-507 (2004).
  36. Tan, J., McKenzie, C., Potamitis, M., Thorburn, A., Mackay, C., Macia, L. The role of short-chain fatty acids in health and disease. Advances in Immunology. 121, 91-119 (2014).
  37. Yang, J., Kweon, M. The gut microbiota: a key regulator of metabolic diseases. BMB Reports. 49 (10), 536-541 (2016).
  38. Sonnenburg, J., Bäckhed, F. Diet-microbiota interactions as moderators of human metabolism. Nature. 535 (7610), 56-64 (2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

144microbiotaculturing

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved