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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Qui, presentiamo un protocollo per la coltura del microbiota dell'intestino, del colon in vitro, , utilizzando una serie di bioreattori che simulano le condizioni fisiologiche del tratto gastro intestinale.

Abstract

Il microbiota dell'intestino umano svolge un ruolo vitale nella salute umana e la malattia. Studiare il microbiota dell'intestino utilizzando un modello in vivo , è difficile a causa della sua natura complessa e la sua associazione diversificata con componenti dei mammiferi. L'obiettivo del presente protocollo è alla cultura il microbiota dell'intestino in vitro, che consente lo studio delle dinamiche del microbiota intestinale, senza dover considerare il contributo del milieu dei mammiferi. Utilizzando in vitro coltura tecnologia, sono simulate le condizioni fisiologiche del tratto gastro intestinale, inclusi i parametri quali pH, temperatura, anaerobiosi e tempo di transito. La superficie intestinale del colon viene simulata aggiungendo elementi portanti rivestite con mucina, creazione di una fase della mucosa, e aggiungendo ulteriore dimensione. Il microbiota dell'intestino è stato introdotto inoculando con il materiale fecale umano. Al momento dell'inoculazione con questa complessa miscela di batteri, microbi specifici sono arricchiti in diversi longitudinale (ascendente, trasversale e discendente colon) e trasversali (luminal e mucosi) ambienti del modello in vitro. È fondamentale per consentire al sistema di raggiungere uno stato di costante, in cui la Comunità e i metaboliti prodotti rimangono stabili. I risultati sperimentali in questo manoscritto dimostrano come la comunità di microbiota inoculato intestino si sviluppa in una comunità stabile nel tempo. Una volta allo stato stazionario è raggiunto, il sistema può essere utilizzato per analizzare le interazioni batteriche e funzioni della community o per testare gli effetti di eventuali additivi sul microbiota dell'intestino, quali cibo, componenti alimentari o prodotti farmaceutici.

Introduzione

Il microbiota dell'intestino è una comunità di microrganismi che risiedono nel tratto gastrointestinale umano (GIT).  Questa comunità raggiunge la massima concentrazione nel colon, che è stimato per contenere 1013-1014 batteri, da 500-1.000 specie, che vivono in simbiosi con il colon milieu1,2. La composizione e la funzionalità del microbiota cambiare nello spazio lungo il GIT, formando comunità specifiche di regione, con la maggior parte delle diversità trovata distalmente2,3,4,5. Per ogni regione anatomica, separata comunità microbiche risiedono nel lume e il rivestimento mucoso6. La comunità di lumen ha un accesso più diretto alle sostanze nutrienti come substrati spostare attraverso il vano luminal7. Nonostante questo, alcuni batteri risiedono preferenzialmente nello strato di muco, che utilizzano mucina prodotta dalle cellule del colon come un'energia fonte1,5,8. La differenza in microambienti tra i risultati di fasi luminal e delle mucose in divergenza e lo sviluppo di specifiche comunità di fase. Insieme, queste comunità forniscono funzioni metaboliche, come il metabolismo dei nutrienti e la produzione di vitamine e funzioni immunologiche, come prevenire la colonizzazione di agenti patogeni umani1,3, 9. il microbiota dell'intestino funziona anche funzionalmente in coniugazione con le cellule del colon umano3.

Come una parte importante di GIT umana, non è sorprendente che il microbiota dell'intestino è conosciuto per contribuire a entrambi host salute e malattia stato3,9,10,11,12. Un cambiamento nella popolazione microbica dell'intestino è stato associato con le malattie umane multiple, compreso i disordini GIT come malattia intestinale intestinale (IBD) e sindrome intestinale delle viscere (IBS), ma anche altre malattie, come l'obesità, malattie cardiovascolari e autismo 3 , 9 , 10 , 11 , 12. metaboliti prodotti dal microbiota dell'intestino hanno un effetto globale, raggiungendo posizioni lontano il budello12,13. Ad esempio, l'asse cervello-intestino è associata con disturbi mentali come ansia e depressione14. Pertanto, studiando il microbiota dell'intestino è importante a più campi di ricerca ed è applicabile a molte malattie, anche quelli non spesso associato con GIT.

Mentre è ampiamente riconosciuto che è importante studiare il microbiota dell'intestino, è uno sforzo complicato. Più modelli animali sono disponibili, da piccoli animali come zebrafish, ratti e topi, a quelle più grandi come scimmie e maiali15-19. Tuttavia, l'applicazione di questi animali in termini del microbiota dell'intestino umano è non è semplice, poiché questi animali hanno una singolare comunità batterica che si è evoluta basata su ambiente e dieta, e sono anatomicamente distinti da esseri umani20 , 21. l'uso di soggetti umani rimuove la questione della rilevanza ancora introduce un'altra serie di sfide. Gli studi umani sono costosi, che richiede tempo e sono eticamente vincolata11. Inoltre, fattori di confondimento influenzano il microbiota dell'intestino negli studi umani, tra cui età o fase inerente allo sviluppo, ambiente, dieta, farmaci e fattori genetici2,4,22.  Ci sono anche restrizioni su ciò che può essere testato in esseri umani, e quale tipo di campioni può essere raccolto a cosa volte4.

Uno svantaggio critico dell'utilizzo di un sistema in vivo per studiare il microbiota dell'intestino è la presenza di componenti dei mammiferi. Il microbiota dell'intestino e le cellule umane interagiscono uno con l'altro, e in un in vivo l'impostazione, è impossibile distinguere i due. I metaboliti prodotti dal microbiota dell'intestino sono presi dalle cellule del colon, quindi misure non possono essere calcolate con precisione. Pertanto, qualsiasi studio meccanicistico deve limitarsi al punto finale misure11. Un altro grande svantaggio per studi in vivo è l'incapacità di raccogliere campioni provenienti da diverse regioni di GIT longitudinalmente23. Questo non consente per la valutazione dei cambiamenti che possono verificarsi in microambienti del colon nel tempo12.  Molti in vivo studi, compreso gli studi umani, si basano sull'analisi di campioni di feci per rilevare le modifiche al microbiota intestinale12. Mentre questo è informativo, esso non fornisce dati sul microbiota dell'intestino attraverso GIT e non distingue tra le comunità luminal e mucosa5,6,7,8.

Per il microbiota dell'intestino, è necessaria l'applicazione di un metodo in vitro per studiare la dinamica della comunità batterica, senza interferenze da parte dei componenti dei mammiferi. Utilizzando un metodo in vitro permette un controllo stretto di condizioni ambientali10, prova di più parametri simultaneamente e l'abilità di campionare longitudinalmente e in grandi volumi11. Poiché un dispositivo meccanico e non un host utilizza un metodo in vitro, considerazioni non sono necessarie per età, ambiente, dieta o background genetico. Questi sistemi può essere utilizzato per verificare sia la comunità di microbiota dell'intestino intero, solo selezionati organismi, o addirittura singoli ceppi. D'importanza, i risultati in vitro sono riproducibili, ancora mantenere un livello di diversità paragonabile a studi in vivo11,22.

Secondo l'ipotesi in questione e i risultati desiderati, ion vitro studi possono essere eseguiti in diversi modi.  Possono utilizzare sistemi del singolo-vaso e metodi semplici, quali incubando campioni con fecale omogeneato24 o l'esecuzione batch singolo colture nel corso di 24-48 h25. Essi può essere effettuate anche utilizzando sistemi del singolo-vaso e metodi più complessi, come l'utilizzo di un sistema di chemostat per produrre un intestino stabile comunità microbica11. Tuttavia, l'uso di un unico reattore può over-semplificare il microbiota12 poiché rappresenta solo una sezione del colon, anche se il colon è composto da regioni ascendente, trasversale e discendente.

Al fine di studiare la comunità di microbiota dell'intestino che si sviluppa nelle regioni differenti del colon (le regioni ascendente, trasversale e discendente), può essere impiegato un sistema complesso, multi-stadio. In questi sistemi, vasi multipli sono impostati per simulare le differenti regioni del colon, così il microbiota dell'intestino delle regioni ascendente, trasversale e discendente sono coltivati in modo indipendente. Questi vasi sono collegati, utilizzando pompe per spostare substrati in sequenza, dalla crescente a trasversale alle regioni del colon discendente, che imita il flusso delle sostanze nutrienti attraverso GIT.

L'obiettivo di questo studio era di dimostrare come un sistema di coltura in vitro di 5 stadi (Vedi Tabella materiali) può essere utilizzato per coltivare la comunità del microbiota dell'intestino e per dimostrare le dinamiche comunitarie in termini di stabilità e composizione. In questo sistema, una nave rappresenta lo stomaco e uno rappresentano l'intestino tenue. Il colon è diviso in tre regioni (ascendente, trasverso, discendente), con una nave che rappresenta ogni regione26. In questa messa a punto sperimentale, due sistemi completi sono stati eseguiti in parallelo, con l'unità 1 contenente i vettori di mucina a rappresenta la superficie mucosa e l'unità 2 non contenente nessun vettori di mucina. Le comunità che sviluppato nelle fasi di luminal e mucosa di ciascuna regione sono state confrontate a vicenda e per l'inoculo fecale nel tempo utilizzando analisi SCFA e gene del rRNA 16S. I risultati presentati dimostrano il tipo di comunità, sia in termini di composizione e funzionalità, che può essere prodotta da questo tipo di sistema in vitro.

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Protocollo

1. sostanze e preparati

Nota: Il medium definito viene acquistato sotto forma di polvere (Vedi Tabella materiali). La composizione del mezzo definito in g/L è la seguente: arabinogalattano (1.2), pectina (2.0), xilano (0,5), glucosio (0,4), Estratto di lievito (3.0), speciale peptone (1.0), mucina (2.0), L-cisteina-HCl (0,2).

  1. Preparare il medium definito
    1. Riempire una boccetta di 4L con 2 L di acqua distillata, demineralizzata doppia.
    2. Aggiungere 29,2 g di polvere media definita per l'acqua e mescolare unità completa omogeneizzato.
    3. Aggiungere un agitatore magnetico e avvitare il coperchio.
    4. Sterilizzare in autoclave a 121 ° C per 30 min.
    5. Dopo il raffreddamento, è possibile memorizzare il medium definito preparato in frigorifero a 4 ° C con agitazione costante (agitatore magnetico).
  2. Preparare il succo pancreatico
    1. Autoclave 2L di acqua distillata, deionizzata in un recipiente di 5L con un bar di agitatore aggiunto, a 121 ° C per 30 min.
    2. Dopo la sterilizzazione in autoclave, lasciare l'acqua raffreddare a temperatura ambiente.
    3. Aggiungere 12,5 g NaHCO3, 6g bile e pancreatina 0,9 g. Collocare su agitatore magnetico per mescolare.
      Nota: Succo pancreatico dovrebbe essere preparato fresco ogni 2-3 giorni e refrigerato con agitazione dopo che ha fatto.
  3. Tampone fosfato
    1. Posto un pallone da 1 L contenente una barra di agitatore magnetico su un agitatore magnetico. Aggiungere 0,5 L di acqua distillata, demineralizzata e girare in agitazione.
    2. Successivamente, aggiungere 6,8 g KH2PO4, 8,8 g K2HPO4e tioglicolato di sodio 0,1 g. Top fuori con acqua ad un volume finale di 1 L.
    3. Dopo che i componenti sono completamente dissolto, regolare il pH a 7.0 utilizzando NaOH.
    4. Versare il buffer in un vaso 2L con tappo a vite coperchio e sterilizzare in autoclave a 121 ° C per 30 min. Accertarsi che il coperchio viene avvitato su liberamente e non chiuso ermeticamente.
    5. Dopo la rimozione dall'autoclave, lasciare che la soluzione raffreddare alla temperatura ambiente. Conservare il tampone a temperatura ambiente per fino a 2 settimane.
  4. Preparare i vettori di mucina agar
    1. Vettori di mucina plastica autoclave (Vedi Tabella materiali), forcipe, maglia di plastica (forma tubolare) e fascette a 131 ° C per 30 min.
    2. Autoclave 300 mL di doppio distillato, deionizzato acqua a 131 ° C per 30 min. Store a temperatura ambiente fino all'utilizzo.
    3. In una cappa di biosicurezza con il flusso laminare, riempire Petri sterili con i vettori di mucina plastica utilizzando pinze sterili.
      Nota: I vettori di mucina sono cerchi di plastica vuoti che sono riempiti con agar di mucina. Una volta riempito, il coperchio può essere collocato sulla parte superiore e questi può essere accantonati.
    4. Per preparare agar di mucina, aggiungere 3 g di agar batterico e 15 g di mucina suina a 300 mL di acqua in autoclave.
    5. In una cappa, bollire questa soluzione, quindi rimuovere dalla fonte di calore e lasciare per raffreddare per 1 minuto di ripetizione di bollitura e raffreddamento per un totale di 3 volte.
    6. Una volta che il vaso di vetro contenente la soluzione di agar di mucina è abbastanza freddo al tatto, è possibile spostarlo nella cappa di biosicurezza con flusso laminare.
    7. Nella cappa di biosicurezza con il flusso laminare, versare l'agar di mucina liquido sopra i vettori di mucina in plastica che sono stati collocati in di Petri. Garantire che tutti i vettori sono riempiti completamente con agar di mucina.
    8. Riposizionare il coperchio di Petri e lasciarla raffreddare sotto flusso laminare.
    9. Assemblare gli elementi portanti della mucina, prendere la rete di plastica sterilizzati in autoclave e inserire elementi portanti di mucina contenente l'agar solidificato mucina da di Petri utilizzando pinze sterili.
    10. Utilizzare fascette per chiudere l'estremità della maglia. In questo modo le funzioni di rete per contenere i vettori di mucina riempiono di agar di mucina. Conservare a 4 ° C fino all'utilizzo.

2. set up, inoculazione e il funzionamento del sistema

  1. Messa a punto del sistema di coltura
    Nota:     il simulatore di Twin dell'ecosistema microbico intestinale umano è stato utilizzato per questo studio.
    1. Posto 10 bioreattori contenenti barre agitatore su Agitatori magnetici e girare in agitazione.
      Nota: Ogni unità sarà composto da 5 bioreattori, 2 unità richiederà 10 bioreattori.
    2. Collegare 5 bioreattori a vicenda usando tubo in silicone in sequenza tramite la pompa peristaltica (Figura 1). Utilizzare le pompe a traverso il fluido contenuto da un bioreattore a quella successiva.
    3. Etichettare i bioreattori nella seguente sequenza: stomaco, intestino tenue, colon ascendente, colon trasverso, discendente del colon per rappresentare l'ordine del tratto gastrointestinale.
      Nota: I bioreattori possono essere identici, o i bioreattori dello stomaco e dell'intestino tenue possono essere inferiore rispetto ai bioreattori del colon poiché saranno tenere meno volume. Configurazione di bioreattori in questo modo significa che la regione del colon ascendente riceve le sostanze nutrienti dall'intestino tenue, colon trasverso regione riceve le sostanze nutrienti dalla regione del colon ascendente e della regione del colon discendente riceve le sostanze nutrienti dalla regione trasversale. In questo modo, il sistema è che imita il movimento sequenza delle sostanze nutrienti attraverso il tratto gastrointestinale.
    4. Posto il medium definito e succo pancreatico in frigorifero a 4 ° C con agitazione costante utilizzando agitatori magnetici. Utilizzando il tubo in silicone, collegare il medium definito per il bioreattore stomaco tramite una pompa peristaltica e succo pancreatico al piccolo intestino tramite una pompa peristaltica.
    5. Aggiungere agente di solidificazione alla sacca di drenaggio di urina. Collegare il colon discendente per il sacchetto di drenaggio di urina mediante la pompa peristaltica. Smaltire la solidificato come rifiuti biologici durante l'esperimento.
    6. Utilizzando tubi in silicone, collegare la giacca di acqua di ogni nave in ordine e collegare ogni estremità a bagno d'acqua circolante. Riempire la vasca di acqua circolante con acqua distillata (tale importo può variare a seconda del tipo di bagno d'acqua utilizzato in circolazione) e insieme a 37 ° C.
    7. Utilizzando il tubo in silicone, collegare l'acido e la base al coperchio di ogni nave mediante pompe peristaltiche. Le concentrazioni consigliate sono 0,5 M HCl e 0,5 M NaOH.
    8. Inserire le sonde di pH per ogni nave attraverso la porta designata nel coperchio. Questa porta è progettata per contenere la sonda pH e avvitare il coperchio (Figura 1). Impostare il pH per ogni regione come segue: stomaco, pH = 2; Piccolo intestino, pH = 6,7-6,9; Due punti ascendenti, pH = 5,6-5,9; Colon trasverso, pH = 6.15-6.4; Colon discendente, pH = 6.6-6,9.
      Nota: Durante la fase iniziale, la Comunità si differenzierà basata sulla differenza di valori di pH di regione. Tuttavia, una volta che i cicli di alimentazione iniziano, la Comunità ulteriormente matura basata sulle differenze nell'input dei nutrienti.
    9. Collegare una linea di azoto mediante tubo in silicone al coperchio di ogni nave utilizzando la porta designata. La linea di azoto dovrebbe fluire nella seguente sequenza: stomaco, intestino tenue, colon ascendente, colon trasverso, discendente del colon. Garantire che ogni unità ha il proprio colore per evitare la contaminazione incrociata.
      Nota: Azoto è usato per ossigeno rimosso dal sistema e mantiene anaerobiosi durante l'esperimento.
    10. Inserire un tubo di metallo campione attraverso il coperchio di ogni bioreattore utilizzando la porta designata. Tubo di metallo si estende verso il basso nel bioreattore e viene utilizzato per raccogliere campioni di liquido.
    11. Aggiungere un piccolo pezzo di tubo in silicone all'estremità superiore della provetta del campione e collegare un Luer Lock per consentire l'uso di una siringa durante il campionamento.
  2. Inoculazione del sistema
    1. Riempire le regioni del colon con il medium definito utilizzando i seguenti volumi: 500 mL nel colon ascendente, 800 mL nei due punti trasversali e 600 mL nel colon discendente.
    2. Aggiungere mucina agar Carrier per le regioni del colon, in un importo proporzionale al volume del reattore. Per questo esperimento, sono stati utilizzati 60 compagnie al reattore.
    3. Rimuovere ogni eccesso di terreno definito usando la provetta del campione e una siringa poiché l'aggiunta di elementi portanti alza il livello del fluido nel bioreattore.
    4. Accendere le sonde di pH per aggiustare il pH in ogni reattore usando il computer.
    5. Accendere il flush di azoto per 20 min.
      Nota: L'omogeneizzato fecale utilizzato per l'inoculazione è acquistato come feci 10% omogeneizzate in soluzione al 10% glicerolo (Vedi Tabella materiali). Il campione fecale è selezionato casualmente da un pool di donatori con i seguenti criteri: un americano che consumano una dieta occidentale tipica (non vegano o vegetariano), tra 21-45 anni di età, antibiotico gratis per almeno 1 anno, con un indice di massa corporea medio (18,5-24,9) . Per questo protocollo, viene utilizzato solo un singolo donatore. Tuttavia, questo può essere modificato a causa di disegno sperimentale.
    6. Prima dell'inoculazione, scongelare l'omogenato fecale seguendo le linee guida del produttore.
    7. Inoculare ogni reattore colon aggiungendo l'omogenato fecale in un importo pari al 5% del volume reattore attraverso il porto di campione, usando una siringa da 60 mL (25 mL per il colon ascendente, 40 mL per il colon trasverso, 30 mL per il colon discendente).
    8. Crescere le colture in bioreattori pernottamento con controllo del pH.
    9. Dopo la crescita durante la notte, raccogliere campioni del fluido luminale da ogni regione del colon come dettagliato di seguito nella sezione 3. Dopo il campionamento è completato, attivare il programma per computer per avviare l'alimentazione.
  3. Tutti i giorni cicli di alimentazione
    Nota:     i cicli di alimentazione quotidiani sono computer automatizzato.
    1. Tre volte al giorno, pompa 140 mL di medium definito nel bioreattore stomaco e lasciata per incubare per 1 h.
    2. Dopo 1 h di incubazione, pompa il contenuto dello stomaco nell'intestino tenue. Allo stesso tempo, pompa 60 mL di succo pancreatico nell'intestino tenue.
    3. Nell'intestino tenue, attivare la regolazione del pH pH 6,7-6,9 e lasciare che miscela di incubare per 90 minuti. Durante l'incubazione, accendere il flush di azoto per ogni sistema per un totale di 10 minuti ciascuno.
    4. Dopo l'incubazione di 90 min, accendere contemporaneamente le pompe dal piccolo intestino per due punti ascendenti, due punti ascendenti, due punti trasversali, due punti trasversali al colon discendente e colon discendente per i rifiuti.
  4. Timeline sperimentale
    Nota:     la sistema in vitro utilizzato qui è gestito in modo continuo per circa 8 settimane di lunghezza. Di seguito è un diario sperimentale raccomandato, tuttavia, questo può essere modificato a seconda dell'obiettivo dell'esperimento e requisiti.
    1. Impostare il sistema seguenti passaggi elencati al punto 2.1.
    2. Raccogliere campioni da crescita durante la notte seguendo il protocollo sottostante. Iniziare i cicli giornalieri, nutrire tre volte al giorno seguendo il protocollo di cui sopra.
    3. Eseguire l'esperimento per un totale di 2 settimane per permettere ai batteri di stabilizzare.
      Nota: In esecuzione il sistema significa che il pH è mantenuto, i cicli di alimentazione quotidiani sono seguiti tre volte al giorno, e gli elementi portanti della mucosa sono cambiati 2 - 3 volte ogni settimana.
    4. Dopo stabilizzazione, è possibile eseguire l'esperimento per 2 settimane come il periodo di controllo.
    5. Dopo il periodo di controllo, è possibile utilizzare il sistema per testare diversi componenti o variabili, conosciute come il periodo di trattamento.
    6. Dopo il periodo di trattamento, interrompere l'aggiunta di componenti o variabili e le condizioni di tornare alla normalità. Questo è considerato il periodo di interruzione e viene utilizzato per determinare o meno modifiche alla comunità sono permanenti.

3. campioni dal sistema di raccolta

Nota: Durante l'esperimento, i campioni possono essere raccolti dalla fase luminale o mucosa di qualsiasi regione in qualsiasi momento, seguendo le linee guida di seguito.

  1. Raccolta campioni luminal
    1. Raccogliere campioni di liquido luminale attraverso la porta di campione che si estende in mezzo il liquido di coltura. Iniziare pulendo il Luer Lock sul pozzetto del campione con etanolo al 70% o il pad piccolo alcool e lasciare per asciugare.
    2. Assicurarsi che tutta l'aria venga rimosso da una siringa da 30 mL e collegarlo al pozzetto del campione. Disegnare su e giù 3 - 5 volte a garantire la corretta miscelazione dei componenti la nave. Dopo, disegnare un totale di 30 mL di cultura.
    3. Aliquota del luminal campioni come necessari in provette falcon sterile e conservare il ghiaccio. Dopo il campionamento è completato trasferire questi per un congelatore a-80 ° C.
    4. Per l'analisi SCFA, 15 mL del campione luminal è filata a 4 ° C, 5.000 x g per 10 min. Il supernatante è siringa filtrata utilizzando un filtro di 0,2 μM di PES. Conservare il surnatante filtrato a-80 ° C.
      1. Per l'analisi del DNA, spin 1 mL di liquido di luminal a 4 ° C, 5.000 x g per 10 min. eliminare il supernatante e conservare il pellet a-80 ° C.
      2. Come backup, memorizzare 10 mL di fluido luminale a-80 ° C per la maggior parte degli esperimenti.
  2. Raccolta di campioni di mucosa
    Nota:     cambiare i vettori delle mucose, ogni 2-3 giorni.
    1. Rimuovere e mettere in evidenza i vettori di mucina preparato dal frigorifero.
    2. Accendere il flush di azoto e aprire il coperchio del reattore rapidamente. Rimuovere il 50% degli elementi portanti della mucina e aggiungerne di nuove.
    3. Sigillare il coperchio rapidamente e mantenere l'azoto a filo su per un altro 20 min.
    4. Per estrazione del DNA, aliquota 0,25-0,5 g di agar in una provetta da 2 mL e conservati a-80 ° C fino a quando necessario.

4. analisi, sequenziamento e l'estrazione di DNA

Nota: Il DNA è estratto con il metodo di estrazione del DNA CTAB fisico omogeneizzazione in un fume hood29. A seguito dell'estrazione, uno spettrofotometro viene utilizzato per quantificare la quantità di DNA in ciascun campione.

  1. Preparare il tampone CTAB
    1. Sciogliere 4,2 g K2HPO4 e 4,09 g NaCl in 200 mL di acqua deionizzata, distillata, quindi sterilizzare in autoclave a 121 ° C per 30 min.
    2. Lasciare la soluzione raffreddare a temperatura ambiente.
    3. Aggiungere 10 g di esadeciltrimetilammonio bromuro (CTAB) e calore a 60 ° C con agitazione.
    4. Dopo tutto il CTAB è dissolto, è possibile rimuovere la soluzione dal fuoco e lasciare raffreddare a temperatura ambiente.
  2. Preparare la soluzione di PEG-6000
    1. Sciogliere 300 g di polietilenglicole 6.000 e 93.5 g NaCl in 1 L di acqua distillata e deionizzata.
    2. Dopo tutte le particelle sono dissolti, autoclave la soluzione a 121 ° C per 30 min.
    3. Dopo la sterilizzazione in autoclave, raffreddare la soluzione a temperatura ambiente prima dell'uso.
  3. Eseguire l'estrazione del DNA
    1. Aggiungere 500 μL di tampone CTAB e 500 μL di fenolo-cloroformio-alcool isoamilico alla provetta 2 mL e vortice per omogeneizzare.
    2. Trasferire l'intero contenuto della provetta del campione a un 0,1 mm fisico omogeneizzazione del tubo (Vedi Tabella materiali).
    3. Omogeneizzare le provette per 20 s sull'impostazione più alto due volte, con un 20 s di pausa in mezzo, utilizzando un omogeneizzatore fisico (Vedi Tabella materiali).
    4. Centrifugare le provette omogeneizzate a 3.000 x g per 5 minuti.
    5. Trasferire 300 μL del surnatante in una provetta pulita, 1,7 mL e aggiungere 500 μL di tampone CTAB il tubo originale.
    6. Omogeneizzare questo tubo nuovamente utilizzando i metodi in passaggi 4.3.2-4.3.3 e centrifugare a 3.000 x g per 5 min.
    7. Dopo la centrifugazione, trasferire un altro 300 μL del surnatante per il nuovo tubo che ora contiene 600 μL.
    8. Aggiunta di un totale di 600 μL cloroformio-alcool isoamilico nella provetta contenente 600 μL del surnatante.
    9. Invertire le provette per mescolare e poi centrifugare. Trasferire 500 μL della fase superiore in una provetta pulita 1,7 mL. Garantire solo per prendere la fase superiore.
    10. Successivamente, aggiungere 1000 μL di soluzione di Peg-6000, invertire i tubi per mescolare e poi incubare a temperatura ambiente per 2 h.
    11. Dopo l'incubazione, centrifugare le provette a 18.200 x g, 4 ° C, per 10 min.
    12. Scartare il surnatante e pulire il pellet con etanolo 70% freddo di ghiaccio.
    13. Centrifugare le provette nuovamente a 18.200 x g, 4 ° C per 10 min. eliminare il supernatante e lasciar asciugare l'armadietto di biosicurezza sotto flusso laminare il pellet.
    14. Dopo il pellet è asciutto, aggiungere 75 μL di RNAsi liberamente, DNasi gratis, acqua sterile ad ogni provetta.
    15. Quantificare il DNA di sedimento da uno spettrofotometro e quindi inviarlo per gene del rRNA 16S.

5. breve catena dell'acido grasso (SCFA) rilevamento e analisi

  1. Scongelare i campioni congelati a 40° C per 30 min ed Estratto di acidi grassi a catena breve utilizzando etere etilico in un rapporto di 2:1 (v: v).
  2. Trasferire la fase organica a una GC/MS (Vedi Tabella materiali) dotata di una colonna, 30 m, 0,25 mm ID, 0,25 µm, (Vedi Tabella materiali) dove viene iniettato 10 µ l.
  3. Impostare la temperatura di iniezione porta e la colonna iniziale temperatura di 260 ° C e 125 ° C rispettivamente. Tenere la temperatura iniziale per 1 min e quindi aumentare questo a 250 ° C, oltre 11,5 min con un tasso di flusso di colonna di 1 mL/min.
    Nota: La temperatura di MS per la sorgente di ioni è 220° C e 250° C per l'interfaccia.
  4. Quantificare l'importo di ogni SCFA utilizzando curve standard e acido 2-methylhexanoic come standard interno.

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Risultati

Il protocollo di cui sopra descrive la messa a punto, inoculazione e l'esecuzione di un sistema in vitro di 5 stadi per studiare il microbiota intestinale del colon. Per generare i dati presentati di seguito, dopo l'estrazione del DNA, gene del rRNA marcatore del DNA 16S della regione V1V2 è stato effettuato usando il sequenziamento (ad es., MiSeq Illumina piattaforma) dal centro di Microbiome presso l'ospedale pediatrico a resa elevata di Philadelphia27....

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Discussione

Sistemi di coltura in vitro sono stati sviluppati per studiare il microbiota dell'intestino dell'intestino crasso. Essi utilizzano apparati progettati per simulare le condizioni fisiologiche del tratto gastro intestinale, promuovendo la crescita di una comunità microbica intestinale maturo per ogni regione del colon33. Mentre il concetto è logico e comprensibile, l'esecuzione effettiva di sistemi di coltura in vitro per studiare il microbiota dell'intestino richiede precisione e una comprensione...

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Divulgazioni

Gli autori non hanno nessun concorrenti interessi finanziari. Menzione di marchi o prodotti commerciali in questa pubblicazione è solo scopo di fornire informazioni specifiche e non implica raccomandazione o approvazione da parte del dipartimento di agricoltura degli Stati Uniti. USDA è un fornitore di pari opportunità e il datore di lavoro.

Riconoscimenti

Sig. ra Audrey Thomas-Gavioli sono riconosciuto per la GC/MS funziona. Vorremmo anche ringraziare Massimo Marzorati per il manoscritto di editing.

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Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
TWINSHIMEProdigestNA
Defined medium (Adult M-SHIME growth medium with starch)ProdigestNA
Masterflex tubingcole ParmerNA
Urine Drainage bagBardNA
LabsorbSigma-AldrichNA
Fecal sampleOpenbiomeNA
SyringesBecton DicksonNA
Defined mediumProdigestNA
Oxgall BileBecton DicksonNA
PancreatinSigma-AldrichNA
Glass wareAce GlassNA
Porcine mucinSigma-AldrichNA
Bacteriological agarSigma-AldrichNA
Sterilization pouchesVWRNA
BeadBugBenchmark ScientificNA
Triple-Pure High Impact Zirconium 0.1 mm Bead beater tubeBenchmark ScientificNA
RNAse free, DNAse free, sterile waterRocheNA
Shimadzu QP2010 Ultra GC/MSShimadzuNA
Stabilwax-DA column, 30 m, 0.25 mm ID, 0.25 µmRestekNA
plastic mucin carriersProdigestNA

Riferimenti

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