JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь мы представляем собой протокол для культивирования микрофлору кишечника толстой кишки в лабораторных условиях, с помощью серии биореакторов, которые имитируют физиологических состояниях желудочно кишечного тракта.

Аннотация

Микробиота кишечнике человека играет жизненно важную роль в здоровье и болезни. Изучая микрофлору кишечника, с использованием модели в естественных условиях , затруднено из-за ее сложный характер и его различные ассоциации с млекопитающих компонентов. Целью настоящего Протокола является культура микрофлору кишечника в пробирке, который позволяет для изучения динамики микрофлору кишечника, без необходимости учитывать вклад млекопитающих окружение. Использование в vitro культивирования технологии, физиологических состояниях желудочно кишечного тракта моделируются, включая такие параметры, как pH, температуры, anaerobiosis и транзитного времени. Поверхность кишечника толстой кишки моделируется путем добавления муцина покрытием перевозчиков, создании слизистой фазы и добавляя новое измерение. Кишка микробиоты вводится прививки с человеческие фекалии. После прививки с этой сложной смеси бактерий, конкретные микробы обогащаются в различных продольной (по возрастанию, поперечной, так и по убыванию двоеточия) и поперечные (люминал и слизистых оболочек) средах в пробирке модели. Важно, чтобы система для достижения устойчивого состояния, в котором общины и метаболитов производства остаются стабильными. Результаты экспериментов в этой рукописи продемонстрировать, каким образом привитых кишка микробиоты сообщество превращается в стабильное сообщество со временем. После того, как устойчивое состояние достигается, система может использоваться для анализа бактериальных взаимодействий и функциям сообщества или проверить последствия каких-либо добавок на микрофлору кишечника, таких как продукты питания, пищевые компоненты или фармацевтических препаратов.

Введение

Кишка микробиоты представляет собой сообщество микро организмов, которые проживают в человека желудочно-кишечного тракта (ЖКТ).  Это сообщество достигает максимальной концентрации в толстой кишке, который оценивается провести 1013-1014 бактерий, от 500-1000 видов, которые живут в симбиозе с толстой обстановке1,2. Состав и функциональные возможности кишка микробиоты изменить пространственно вдоль GIT, образуя конкретные общины региона, с наиболее разнообразия нашли дистально2,3,4,5. Для каждого анатомического региона отдельных микробных сообществ находятся в просвете и на слизистую6. Люмен сообщество имеет более прямой доступ к питательные вещества как субстраты двигаться через Люминал отсека7. Несмотря на это некоторые бактерии находятся преимущественно в слой слизи, используя муцина, производятся клетками кишечника как источник энергии в1,5,8. Разница в микросреды между фазами Люминал и слизистой приводит к дивергенции и развития фазы конкретных общин. Вместе эти общины обеспечивают метаболические функции, такие как обмен питательных веществ и производство витаминов и иммунологической функции, такие как предотвращение колонизации патогенов человека1,3, 9. кишка микробиоты функционально работает также в конъюгации с клетки человека Колон3.

Как важной частью человеческого GIT это не удивительно, что кишка микробиоты известен вклад обеих принимающих здоровья и болезни статус3,9,10,11,12. Сдвиг в кишечнике микробной популяции был связан с несколькими заболеваний человека, включая GIT расстройств, таких как заболевания кишечника кишечника (IBD) и синдром кишечника кишечника (IBS), но и других заболеваний, как ожирение, сердечно-сосудистые заболевания и аутизм 3 , 9 , 10 , 11 , 12. метаболитов, образующихся кишка микробиоты иметь глобальный эффект, достигнув места вдали от кишки12,13. Например оси кишки мозг связан с психическими расстройствами как тревога и депрессия14. Таким образом изучая кишка микробиоты имеет важное значение для нескольких областях исследований и применимы для многих заболеваний, даже тех, кто не часто ассоциируется с GIT.

Хотя широко признается, что изучение кишка микробиоты имеет важное значение, это сложной работе. Несколько животных моделей доступны, от мелких животных как данио рерио, крыс и мышей, крупные как обезьян и свиней15-19. Однако применение этих животных с точки зрения человека кишка микробиоты не прост, поскольку эти животные имеют уникальный бактериальных сообщество, которое развивалась по окружающей среде и диеты, и анатомически они отличаются от людей20 , 21. использование человеческих субъектов снимает вопрос о релевантности еще вводит другой набор проблем. Человеческие исследования являются дорого, много времени и этически ограниченного11. Кроме того отягощающих факторов влияют на микрофлору кишечника в человеческих исследований, в том числе возраст или стадии развития, окружающей среды, питание, лекарства и генетические факторы2,4,22.  Существуют также ограничения на то, что может быть проверена в людей, и какой тип образцов могут быть собраны на то, что раз4.

Один из критических недостатков использования системы в естественных условиях для изучения микрофлору кишечника является наличие у млекопитающих компонентов. Кишка микробиоты и человеческие клетки взаимодействуют друг с другом, и в в естественных условиях , невозможно отличить два. Метаболитов, производимые кишка микробиоты принимаются клетки толстой кишки, поэтому измерения не может быть рассчитана с точностью. Таким образом любой механистической исследования должна быть ограничена конечной точки измерения11. Другой основной недостаток в vivo исследований является неспособность собирать образцы из различных регионов GIT продольно23. Это не позволяет для оценки изменений, которые могут произойти в микросреды двоеточие над время12.  Многие в vivo исследования, включая исследования человека, полагаются на анализ фекальных проб для выявления изменений в кишка микробиоты12. Хотя это информативный, он не предоставляет данные на микрофлору кишечника через GIT и не делает различий между общин Люминал и слизистой5,6,,78.

Для кишка микробиоты применение метода в vitro требуется для изучения динамики бактериальной сообщества, без помех от млекопитающих компонентов. С помощью метода в vitro позволяет жесткий контроль условий окружающей среды10, тестирование нескольких параметров одновременно, и возможность попробовать продольно и в больших объемах11. Поскольку метод экстракорпорального использует механические устройства и не принимающих, никакие соображения необходимы для возраста, окружающей среды, диета или генетический фон. Эти системы могут быть использованы для проверки либо весь кишка микробиоты сообщества, только выбранных организмов, или даже отдельных штаммов. Главное, воспроизводимые результаты in vitro, но сохранить уровень разнообразия, сопоставимые с в-vivo исследований11,22.

В зависимости от гипотезы в вопросе и желаемые результаты яn vitro исследования могут выполняться различными способами.  Они могут использовать одно судно систем и простые методы, такие как инкубации пробы с фекальными огневки24 или выполнение единого пакета культур в течение 24-48 ч25. Они могут также быть выполнено с использованием систем одного судна и более сложных методов, например с помощью chemostat системы для производства стабильных кишки микробных11. Однако использование одного реактора могут чрезмерно упростить микробиоты12 так, как он представляет только одну часть толстой кишки, даже несмотря на то, что толстой кишки состоит из регионов по возрастанию, поперечной и по убыванию.

С целью изучения кишка микробиоты сообщество, которое развивается в различных регионах толстой кишки (по возрастанию, поперечная и убыванию регионов), комплекс, многоступенчатой системы могут быть использованы. В этих системах для имитации различных регионах толстой кишки, поэтому кишка микробиоты регионов по возрастанию, поперечная и убыванию выращивают самостоятельно настроены несколько судов. Эти суда связаны, с помощью насосов для перемещения субстратов в последовательности по возрастанию поперечно к нисходящей толстой регионов, подражая поток питательных веществ через GIT.

Целью данного исследования было продемонстрировать, как систему 5-этап в пробирке культуры (см. Таблицу материалы) может использоваться культивировать сообщества микрофлору кишечника, а также продемонстрировать динамики сообщества с точки зрения стабильности и композиции. В этой системе одно судно представляет живот и один представляют тонкой кишки. Толстой кишки состоит из трех регионов (по возрастанию, поперечная, по убыванию), с одним судном, представляющих каждый регион26. В этой экспериментальной установки два полных систем были параллельно, с 1 единицу содержащие муцина перевозчиков представляет слизистой поверхности и УКПГ-2, содержащие не муцина перевозчиков. Общины, которые разработаны на этапах Люминал и слизистых оболочек каждого региона были сопоставлены друг к другу и фекальных посевным материалом со временем с помощью последовательности гена 16S рРНК и SCFA анализ. Представленные результаты свидетельствуют тип сообщества, как с точки зрения состава и функциональность, который может быть получен от данного типа в пробирке системы.

протокол

1. материалы и препараты

Примечание: Определенных среднего приобретается как порошок (см. Таблицу материалы). Состав определенной среды в г/Л является следующее: арабиногалактана (1.2), пектин (2.0), Xylan (0.5), глюкозы (0,4), экстракт дрожжей (3.0), специальных Пептон (1.0), муцина (2.0), L-цистеин HCl (0.2).

  1. Подготовить определенный средний
    1. Заполните колбу 4 Л с 2 Л двойной дистиллированной деионизированной водой.
    2. Добавьте 29.2 g определенных средних порошка в воде и блок полной гомогенизации смеси.
    3. Добавьте магнитную мешалку и слабо винт на крышке.
    4. Автоклаве при температуре 121 ° C за 30 мин.
    5. После охлаждения, храните в холодильнике при температуре 4 ° C с постоянным перемешиванием (Магнитная мешалка) подготовленную определенными среднего.
  2. Подготовить панкреатического сока
    1. Автоклав добавил 2 Л дистиллированной, деионизированной воды в сосуд 5 Л с баром мешалкой, при температуре 121 ° C за 30 мин.
    2. После автоклавирования дайте воде остыть до комнатной температуры.
    3. Добавление 12,5 г NaHCO3, 6г желчи и Панкреатин 0,9 г. Место на магнитной мешалкой для смешивания.
      Примечание: Панкреатический сок следует свеже каждые 2-3 дня и рефрижераторные с перемешиванием после его сделал.
  3. Фосфатного буфера
    1. Место 1 Л флакон, содержащий магнитной мешалкой бар на магнитной мешалкой. Добавить 0,5 Л дистиллированной деионизированной воды и включите агитации.
    2. Далее добавите 6,8 g KH2PO4, 8,8 g K2HPO4и thioglycolate натрия 0,1 г. Топ с водой до окончательного объема 1 л.
    3. После того, как компоненты полностью не растворится, Отрегулируйте пэ-аш до 7.0 с использованием NaOH.
    4. Залейте буфер в 2 Л сосуд с крышкой колпачок и автоклаве при температуре 121 ° C 30 мин обеспечить, что крышку ввернут на слабо и не плотно закрыты.
    5. После удаления из автоклава, Дайте раствору остыть до комнатной температуры. Сохранить буфер при комнатной температуре до 2 недель.
  4. Подготовить муцина агар перевозчиков
    1. Автоклав пластиковые муцина перевозчиков (см. Таблицу материалы), пинцет, Пластиковая сетка (трубчатой формы) и zip связей на 131 ° C за 30 мин.
    2. Автоклав 300 мл двойной дистиллированной, де ионизированной воды в 131 ° C на 30 мин хранить при комнатной температуре до использования.
    3. В кабинет с ламинарным потоком биобезопасности заполните стерильные чашки Петри с перевозчиками пластиковых муцина, используя стерильный пинцет.
      Примечание: Муцина несущие полых пластиковых круги, которые заполнены с агар муцина. После того, как заполнены, крышки могут быть размещены на верхней части и они могут отложите в сторону.
    4. Подготовить муцина агар, добавьте 3 g бактериальных агар и 15 г свиного муцина в 300 мл воды газобетона.
    5. В Зонта кипятите это решение, затем удалить из источника тепла и дайте ему остыть за 1 мин повторить кипения и охлаждения для в общей сложности 3 раза.
    6. После того, как стеклянный сосуд, содержащий муцина агар решение достаточно прохладно, чтобы коснуться, переместите его в кабинет с ламинарным потоком биобезопасности.
    7. В кабинет с ламинарным потоком биобезопасности залейте жидкость муцина агар пластиковых муцина перевозчиков, которые были помещены в чашке Петри. Убедитесь, что все носители полностью заполнены муцина агар.
    8. Установите крышку обратно на Петри блюдо и дайте ему остыть под ламинарного потока.
    9. Соберите муцина перевозчиков, принять газобетона пластиковые сетки и вставки муцина носителей, содержащих агар затвердевших муцина от Петри с помощью стерильный пинцет.
    10. Использование связей zip закрыть концы сетки. Таким образом чистые функции содержат муцина перевозчиков заполнены с агар муцина. Хранить при 4 ° C до использования.

2. Установка, прививки и запуск системы

  1. Настройка системы культивирования
    Примечание:     Twin симулятор кишечного микробного экосистему человека был использован для этого исследования.
    1. Место 10 биореакторов, содержащие мешалкой баров на магнитные мешалки и включите агитации.
      Примечание: Каждое подразделение будет состоять из 5 биореакторов, поэтому 2 единиц потребует 10 биореакторов.
    2. Подключите 5 биореакторов друг с другом с помощью силиконовой трубки в последовательности посредством перистальтического насоса (рис. 1). Используйте насосы для поперечной жидкости содержимое из одной биореакторе на следующий.
    3. Ярлык биореакторов в следующей последовательности: желудок, кишечник, восходящей толстой кишки, поперечно-ободочной кишки, по убыванию толстой кишки представляют порядок, желудочно-кишечного тракта.
      Примечание: Биореакторы могут быть идентичными или желудка и тонкой кишки биореакторов можно меньше по сравнению с толстой биореакторов, так как они будут проводить меньше объем. Создание биореакторов таким образом означает, что регионе восходящей толстой кишки получает питательные вещества из кишечника, поперечно-ободочной кишки регион получает питательные вещества из области восходящей толстой кишки, и нисходящей толстой регион получает питательные вещества из Поперечная региона. Таким образом система является имитируя последовательного движения питательных веществ через желудочно-кишечного тракта.
    4. Место определенные среднего и панкреатический сок в холодильнике при температуре 4 ° C с постоянным перемешиванием, используя магнитные мешалки. С помощью силиконовой трубки, подключите определенной среды в биореакторе желудка через Перистальтический насос а панкреатического сока к тонкой кишки через Перистальтический насос.
    5. Добавление застывающих агента в мочесборник дренажа. Подключите нисходящей ободочной кишки дренаж мочесборник посредством перистальтического насоса. Распоряжаться затвердевших как биологические отходы во время эксперимента.
    6. С помощью Трубы силиконовые, подключите водяной рубашкой каждого судна в порядке, а каждый конец в циркулирующей водой ванну. Заполните циркулирующей воды ванны с дистиллированной воды (эта сумма будет варьироваться в зависимости от типа циркулирующих водяной бане используется) и 37 ° c.
    7. С помощью силиконовой трубки, подключите кислоты и основания к крышке каждого судна путем перистальтических насосов. Рекомендуемая концентрация 0,5 М HCl и 0.5 M NaOH.
    8. В крышку вставьте рН зонды для каждого судна через указанный порт. Данный порт предназначен для хранения рН зонд и винт в крышке (рис. 1). Значение рН для каждого региона следующим: желудок, pH = 2; Тонкой кишки, pH = 6,7-6,9; Восходящей толстой кишки, pH = 5,6-5.9; Поперечно-ободочной кишки, pH = 6,15-6,4; По убыванию толстой кишки, pH = 6.6-6.9.
      Примечание: На начальном этапе сообщество будет дифференцировать основе разница в значениях рН региона. Однако после начала кормления циклов, общины далее Зрелые основе различий в биогенных веществ.
    9. Подключение линии азота с помощью силиконовой трубки на крышке каждого судна, используя назначенный порт. Линия азота должна течь в следующей последовательности: желудок, кишечник, восходящей толстой кишки, поперечно-ободочной кишки, по убыванию толстой кишки. Убедитесь, что каждый блок имеет свой собственный метод flush, чтобы избежать перекрестного загрязнения.
      Примечание: Азот используется для удаленных кислорода из системы и поддерживает anaerobiosis во время эксперимента.
    10. Вставьте металлический образец трубки через крышку каждого биореактора, используя назначенный порт. Металлическая трубка простирается вниз в биореактор и используется для сбора жидкости образцов.
    11. Добавить небольшой кусок силиконовой трубки в верхнем конце трубки образца и подключить люэровского чтобы разрешить использование шприца во время выборки.
  2. Прививка системы
    1. Заполните области толстой кишки с определенной средой, используя следующие тома: 500 мл в восходящей ободочной кишки, 800 мл в поперечно-ободочной кишки и 600 мл в нисходящей ободочной кишки.
    2. Добавьте муцина агар перевозчиков в регионах Колон, в сумме, пропорциональной объему реактора. Для этого эксперимента использовались 60 перевозчиков в реактор.
    3. Удалите любой избыток определенных среднего с использованием образца трубки и шприц с добавлением перевозчиков поднимает уровень жидкости в биореакторе.
    4. Включите рН зонды для регулировки рН в каждый реактор с помощью компьютера.
    5. Включите флеш азота за 20 мин.
      Примечание: Фекальный огневки, используемые для прививки приобретается как 10% фекалии гомогенизации в 10% растворе глицерина (см. Таблицу материалы). Фекальный образец выбирается случайным образом из числа доноров с учетом следующих критериев: американский, потребляя типичной западной диете (не вегетарианец или вегетарианское), между 21-45 лет, антибиотиков бесплатно по крайней мере 1 год, с средний индекс массы тела (18,5-24,9) . Для этого протокола используется только одного донора. Однако это может быть изменена из-за экспериментальный дизайн.
    6. Перед прививкой оттепель фекальных огневки после рекомендации производителя.
    7. Прививать каждый реактор Колон, добавив фекальных огневки в сумму, равную 5% от объема реактора через порт образца, с помощью шприца 60 мл (25 мл для восходящей толстой кишки, 40 мл для поперечно-ободочной кишки, 30 мл для нисходящей ободочной кишки).
    8. Расти культур в биореакторах ночь с контроля рН.
    9. После ночи роста урожай образцы Люминал жидкости из каждого региона толстой кишки, как описано ниже в разделе 3. После завершения отбора проб, включите компьютерной программы, чтобы начать кормление.
  3. Ежедневно, кормления циклов
    Примечание:     ежедневных циклов питания являются автоматизированная компьютер.
    1. Три раза в день, насос 140 мл среды, определенные в биореакторе желудка и разрешено инкубировать 1 час.
    2. После инкубации 1 h насос содержимого желудка в кишечник. В то же время насос 60 мл сока поджелудочной железы в тонкую кишку.
    3. В тонком кишечнике Включите корректировку рН рН 6,7-6,9 и позволяют смесь для инкубации за 90 минут. Во время инкубации включите азота флеш для каждой системы в общей сложности 10 мин.
    4. После инкубации 90 мин включите насосы из тонкой кишки в восходящей ободочной кишки, восходящей толстой поперечно-ободочной кишки, поперечно-ободочной кишки нисходящей ободочной кишки, и нисходящей толстой кишки с отходами, одновременно.
  4. Экспериментальный график
    Примечание:     в пробирке система, используемая здесь эксплуатируется на постоянной основе около 8 недель в длину. Ниже приводится рекомендуемый экспериментальный график, однако, это может быть изменено в зависимости от требований и Цель эксперимента.
    1. Настройка системы, следующие шаги, перечисленные на шаге 2.1.
    2. Сбор образцов от ночи роста после протокол ниже. Начинаются Ежедневные циклы, питание три раза в день после выше протокол.
    3. Запуск эксперимента для в общей сложности 2 недели, чтобы позволить бактерий для стабилизации.
      Примечание: Запуск системы означает, что рН поддерживается, ежедневных циклов питания следуют три раза в день, и слизистой перевозчиков меняются 2 - 3 раза, каждый неделю.
    4. После стабилизации запустите эксперимент на 2 недели в период управления.
    5. После периода управления используете систему для тестирования различных компонентов или переменные, известный как период лечения.
    6. После периода лечения прекратить Добавление компонентов или переменных и вернуться к нормальной жизни условий. Это считается период вымывания и используется для определения ли изменения сообщества являются постоянными.

3. сбор образцов из системы

Примечание: В ходе эксперимента, образцы могут быть собраны от этапа Люминал или слизистых оболочек любого региона в любое время, следуя ниже руководящие принципы.

  1. Заготовка Люминал образцов
    1. Урожай Люминал жидкости образцы через порт образца, который простирается в середине культуры жидкости. Начните с очистки Luer Lock на порт образца с 70% этанол или небольшой спиртом салфеткой и дать высохнуть.
    2. Убедитесь, что весь воздух удаляется из 30 мл шприц и подключите его к порту образец. Использовать вверх и вниз 3 - 5 раз для обеспечения надлежащего смешивания компонентов судна. После привлечь в общей сложности 30 мл культуры.
    3. Алиготе Люминал образцы как необходимости в стерильных Сокол трубы и магазин на льду. После завершения отбора проб передачи их в морозильную камеру-80 ° С.
    4. Для анализа SCFA 15 мл Люминал образца вращается на 4 ° C, 5000 x g за 10 мин. Супернатант является шприц используется фильтр PES 0,2 мкм. Сохранять отфильтрованные супернатант-80 ° c.
      1. Для анализа ДНК, спин 1 мл Люминал жидкости при температуре 4 ° C, 5000 x g 10 мин удалить супернатант и хранить Пелле-80 ° c.
      2. Как резервное копирование Храните 10 мл Люминал жидкости при температуре-80 ° C для большинства экспериментов.
  2. Сбор проб слизистой
    Примечание:     изменения слизистой перевозчиков каждые 2-3 дня.
    1. Удалите и вывести подготовленный муцина перевозчиков из холодильника.
    2. Включите флеш азота и быстро открыть крышку реактора. Удаление 50% муцина перевозчиков и добавлять новые.
    3. Уплотнение крышки быстро и сохранить азота заподлицо на еще 20 мин.
    4. Для экстракции ДНК, аликвота 0,25-0,5 г агара в 2-мл пробирку и температуре-80 ° C до тех пор, пока требуется.

4. ДНК добычи, последовательности и анализ

Примечание: ДНК, извлеченные с помощью метода экстракции ДНК CTAB с физической гомогенизации в вытяжной капюшоном29. После извлечения спектрофотометр используется для количественного определения количество ДНК в каждом образце.

  1. Подготовка CTAB буфера
    1. Растворите 4.2 g K2HPO4 и 4,09 г NaCl в 200 мл дистиллированной деионизированной водой, а затем Обработайте автоклавированием при температуре 121 ° C за 30 мин.
    2. Дайте раствору остыть до комнатной температуры.
    3. Добавьте 10 g Hexadecyltrimethylammonium бромид (CTAB) и тепла до 60 ° C с перемешиванием.
    4. После того, как все CTAB растворяется, удалите решение из тепла и остыть до комнатной температуры.
  2. Готовят раствор ПЭГ-6000
    1. Растворите 300 g полиэтиленгликоль 6000 и 93.5 g NaCl в 1 Л дистиллированной деионизированной водой.
    2. После все частицы растворяются, автоклав раствор при температуре 121 ° C за 30 мин.
    3. После автоклавирования охладите решение к комнатной температуре перед использованием.
  3. Выполнения извлечения дна
    1. Добавьте 500 мкл буфера CTAB и 500 мкл фенол-хлороформ-изоамилового спирта в 2-мл пробирку образца и вихревые для гомогенизации.
    2. Передать все содержимое образца трубки 0,1 мм физической гомогенизации трубки (см. Таблицу материалы).
    3. Гомогенизировать трубы для 20 s на высокий параметр два раза, с 20 s паузы между ними, используя физическое гомогенизатора (см. Таблицу материалы).
    4. Центрифуга гомогенизированные трубы на 3000 x g за 5 минут.
    5. Передачи 300 мкл супернатант в чистой, 1,7 мл трубку и добавьте 500 мкл буфера CTAB оригинальные трубки.
    6. Однородности этой трубки, снова с помощью методов в 4.3.2-4.3.3 шаги и центрифуги на 3000 x g 5 мин.
    7. После центрифугирования передавать новые трубки, которая теперь содержит 600 мкл еще 300 мкл супернатант.
    8. Добавьте в общей сложности 600 мкл хлороформ-изоамилового спирта в пробирку, содержащую 600 мкл супернатант.
    9. Инвертируйте трубы для перемешивают, а затем кратко центрифуги. Передавать чистый 1,7 мл 500 мкл верхнего этапа. Обеспечение только взять Верхний этап.
    10. Далее добавить 1000 мкл раствора ПЭГ-6000, инвертировать трубы для перемешивают, а затем инкубации при комнатной температуре в течение 2 ч.
    11. После инкубации центрифуга трубы на 18200 x g, 4 ° C, 10 мин.
    12. Отменить супернатант и очистить лепешка с льдом, холодный 70% этиловом спирте.
    13. Центрифуга трубы снова на 18200 x g, 4 ° C, за 10 мин удалить супернатант и позволяют гранулы для просушки в кабинете биобезопасности под ламинарного потока.
    14. После того, как гранулы сухого, добавьте 75 мкл РНКазы бесплатно, DNAse бесплатно, стерильную воду к каждой пробке.
    15. Количественно ресуспензированы ДНК, спектрофотометр и затем отправить его за секвенирование гена 16S рРНК.

5. короткие цепочки жирных кислот (SCFA) обнаружения и анализа

  1. Оттепель замороженных образцов при 40° C в течение 30 мин и извлекать короткие цепочки жирных кислот с помощью диэтиловый эфир в соотношении 2:1 (v: v).
  2. Передача органические фазы для ГХ/МС (см. Таблицу материалы) оснащены столбец, 30 м, 0,25 мм ID, 0.25 мкм, (см. Таблицу материалы) где вводят 10 мкл.
  3. Установите впрыск порт температуры и начальный столбец температуры 260 ° C до 125 ° C соответственно. Держите Первоначальная температура за 1 мин, а затем увеличить это до 250 ° C, более 11,5 мин с расходом столбца 1 мл/мин.
    Примечание: Температура MS для источника ионов составляет 220° C до 250° C для интерфейса.
  4. Подсчитать количество каждого SCFA с помощью стандартных кривых и 2-methylhexanoic кислоты в качестве внутреннего стандарта.

Результаты

Вышеупомянутый Протокол описывает набор вверх, прививки и работает 5-этап в пробирке системы для изучения микрофлору кишечника толстой кишки. Для создания данных, представленных ниже, после экстракции ДНК, 16S рРНК маркер гена секвенирования ДНК V1V2 региона была выполне...

Обсуждение

В лабораторных условиях культивирования системы были разработаны для изучения микрофлору кишечника толстой кишки. Они используют аппараты, предназначенные для моделирования физиологических состояниях желудочно кишечного тракта, способствуя росту Зрелые кишечнике микроорганизмов ...

Раскрытие информации

Авторы имеют без финансовых интересов. Упоминание названия торговых или коммерческих продуктов в данной публикации исключительно с целью предоставления конкретной информации и не подразумевает рекомендации или одобрения Департаментом сельского хозяйства США. USDA — равных возможностей поставщика и работодателем.

Благодарности

Г-жа Одри Томас-Gahring признается за ее ГХ/МС. Мы также хотели бы поблагодарить Massimo Marzorati для редактирования рукопись.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
TWINSHIMEProdigestNA
Defined medium (Adult M-SHIME growth medium with starch)ProdigestNA
Masterflex tubingcole ParmerNA
Urine Drainage bagBardNA
LabsorbSigma-AldrichNA
Fecal sampleOpenbiomeNA
SyringesBecton DicksonNA
Defined mediumProdigestNA
Oxgall BileBecton DicksonNA
PancreatinSigma-AldrichNA
Glass wareAce GlassNA
Porcine mucinSigma-AldrichNA
Bacteriological agarSigma-AldrichNA
Sterilization pouchesVWRNA
BeadBugBenchmark ScientificNA
Triple-Pure High Impact Zirconium 0.1 mm Bead beater tubeBenchmark ScientificNA
RNAse free, DNAse free, sterile waterRocheNA
Shimadzu QP2010 Ultra GC/MSShimadzuNA
Stabilwax-DA column, 30 m, 0.25 mm ID, 0.25 µmRestekNA
plastic mucin carriersProdigestNA

Ссылки

  1. Johansson, M., Larsson, J., Hansson, G. The two mucus layers of colon are organized by the MUC2 mucin, whereas the outer layer is a legislator of host-microbial interactions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (1), 4659-4665 (2011).
  2. Xu, J., Gordon, J. Honor thy symbionts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (18), 10452-10459 (2003).
  3. Jandhyala, S., Talukdar, R., Subramanyam, C., Vuyyuru, H., Sasikala, M., Reddy, D. Role of the normal gut microbiota. World Journal of Gastroenterology. 21 (29), 8787-8803 (2015).
  4. Macfarlane, G., Macfarlane, S. Models for intestinal fermentation: association between food components, delivery systems, bioavailability and functional interactions in the gut. Current Opinion in Biotechnology. 18 (2), (2007).
  5. McDonald, J., et al. Simulating distal gut mucosal and luminal communities using packed-column biofilm reactors and an in vitro chemostat model. Journal of Microbiological Methods. 108, 36-44 (2015).
  6. Van den Abbeele, P., et al. Arabinoxylans, inulin and Lactobacillus reuteri 1063 repress the adherent-invasive Escherichia coli from mucus in a mucosa-comprising gut model. NPJ Biofilms and Microbiomes. 27 (2), 16016 (2016).
  7. Van den Abbeele, P., Van de Wiele, T., Verstraete, W., Possemiers, S. The host selects mucosal and luminal associations of coevolved gut microorganisms: a novel concept. FEMS Microbiology Reviews. 35 (4), 681-704 (2011).
  8. Van den Abbeele, P., et al. Incorporating a mucosal environment in a dynamic gut model results in a more representative colonization by lactobacilli. Microbial Biotechnology. 5 (1), 106-115 (2012).
  9. Kinross, J., Darzi, A., Nicholson, J. Gut microbiome-host interactions in health and disease. Genome Medicine. 3 (3), 14 (2011).
  10. Wissenbach, D., et al. Optimization of metabolomics of defined in vitro gut microbial ecosystems. International Journal of Medical Microbiology. 306 (5), 280-289 (2016).
  11. McDonald, J., et al. Evaluation of microbial community reproducibility, stability and composition in a human distal gut chemostat model. Journal of Microbiological Methods. 95 (2), 167-174 (2013).
  12. Venema, K., van den Abbeele, P. Experimental models of the gut microbiome. Best Practice and Research. Clinical Gastroenterology. 27 (1), 115-126 (2013).
  13. Krishnan, S., Alden, N., Lee, K. Pathways and functions of gut microbiota metabolism impacting host physiology. Current Opinion in Biotechnology. 36, 137-145 (2015).
  14. Lach, G., Schellekens, H., Dinan, T., Cryan, J. Anxiety, Depression, and the Microbiome: A Role for Gut Peptides. Neurotherapeutics. 15 (1), 36-59 (2018).
  15. Arias-Jayo, N., Alonso-Saez, L., Ramirez-Garcia, A., Pardo, M. Zebrafish Axenic Larvae Colonization with Human Intestinal Microbiota. Zebrafish. 00 (00), (2017).
  16. Zhu, W., Lin, K., Li, K., Deng, X., Li, C. Reshaped fecal gut microbiota composition by the intake of high molecular weight persimmon tannin in normal and high-cholesterol diet-fed rats. Food and Function. 9 (1), 541-551 (2018).
  17. Nguyen, T., Vieira-Silva, S., Liston, A., Raes, J. How informative is the mouse for human gut microbiota research. Disease Model Mechanisms. 8 (1), 1-16 (2015).
  18. Hale, V., et al. Diet Versus Phylogeny: a Comparison of Gut Microbiota in Captive Colobine Monkey Species. Microbial Ecology. 75 (2), 515-527 (2018).
  19. Lu, D., et al. Host contributes to longitudinal diversity of fecal microbiota in swine selected for lean growth. Microbiome. 6 (1), 4 (2018).
  20. Payne, A., Zihler, A., Chassard, C., Lacroix, C. Advances and perspectives in in vitro human gut fermentation modeling. Trends in Biotechnology. 30 (1), 17-25 (2012).
  21. Muegge, B., et al. Diet drives convergence in gut microbiome functions across mammalian phylogeny and within humans. Science. 332 (6032), 970-974 (2011).
  22. Santiago-Rodriguez, T., et al. Chemostat culture systems support diverse bacteriophage communities from human feces. Microbiome. 9 (3), 58 (2015).
  23. Sousa, T., Paterson, R., Moore, V., Carlsson, A., Abrahamsson, B., Basit, A. The gastrointestinal microbiota as a site for the biotransformation of drugs. International Journal of Pharmaceutics. 363 (1-2), 1-25 (2008).
  24. Pferschy-Wenzig, E., Koskinen, K., Moissl-Eichinger, C., Bauer, R. A Combined LC-MS Metabolomics- and 16S rRNA Sequencing Platform to Assess Interactions between Herbal Medicinal Products and Human Gut Bacteria in Vitro: a Pilot Study on Willow Bark Extract. Frontiers in Pharmacology. 8 (893), (2017).
  25. Cueva, C., et al. In vitro fermentation of grape seed flavan-3-ol fractions by human faecal microbiota: changes in microbial groups and phenolic metabolites. FEMS Microbiology Ecology. 83 (3), 792-805 (2013).
  26. Molly, K., Van de Woestyne, M., Verstraete, W. Development of a 5-step multi-chamber reactor as a simulation of the human intestinal microbial ecosystem. Applied Microbiology and Biotechnology. 39 (2), 254-258 (1993).
  27. Wang, M., et al. Apigenin Impacts the Growth of the Gut Microbiota and Alters the Gene Expression of Enterococcus. Molecules. 22 (8), (2017).
  28. Caporaso, J., et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nature Methods. 7 (5), 335-336 (2010).
  29. Edgar, R. Search and clustering orders of magnitude faster than BLAST. Bioinformatics. 26 (19), 2460-2461 (2010).
  30. Cole, J., et al. Ribosomal Database Project: data and tools for high throughput rRNA analysis. Nucleic Acids Research. 42 (database issue), 633-642 (2014).
  31. McDonald, D., et al. An improved Greengenes taxonomy with explicit ranks for ecological and evolutionary analyses of bacteria and archaea. The ISME Journal. 6 (3), 610-618 (2012).
  32. Liu, L. S., et al. Establishing a mucosal gut microbial community in vitro using an artificial simulator. PLoS ONE. 13 (7), e0197692 (2018).
  33. Van de Wiele, T., Van den Abbeele, P., Ossieur, W., Possemiers, S., Marzorati, M., Verhoeckx, K., et al. Chapter 27: The Simulator of the Human Intestinal Microbial Ecosystem (SHIME ®). The Impact of Food Bio-Actives on Gut Health. , (2015).
  34. Van den Abbeele, P., et al. Butyrate-producing Clostridium cluster XIVa species specifically colonize mucins in an in vitro gut model. The ISME Journal. 7 (5), 949-961 (2013).
  35. Possemiers, S., Verthé, K., Uyttendaele, S., Verstraete, W. PCR-DGGE-based quantification of stability of the microbial community in a simulator of the human intestinal microbial ecosystem. FEMS Microbiology Ecology. 49 (3), 495-507 (2004).
  36. Tan, J., McKenzie, C., Potamitis, M., Thorburn, A., Mackay, C., Macia, L. The role of short-chain fatty acids in health and disease. Advances in Immunology. 121, 91-119 (2014).
  37. Yang, J., Kweon, M. The gut microbiota: a key regulator of metabolic diseases. BMB Reports. 49 (10), 536-541 (2016).
  38. Sonnenburg, J., Bäckhed, F. Diet-microbiota interactions as moderators of human metabolism. Nature. 535 (7610), 56-64 (2016).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

144vitro

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены