应用先进的体外培养技术研究人肠道微生物群

摘要

在这里, 我们提出了一个在体外培养结肠肠道微生物群的方案,使用一系列生物反应器, 模拟胃肠道的生理条件。

摘要

人体肠道微生物群在人类健康和疾病中都发挥着至关重要的作用。利用体内模型研究肠道微生物区系是困难的, 因为它的复杂性, 以及它与哺乳动物成分的不同联系。该协议的目的是在体外培养肠道微生物群, 从而能够研究肠道微生物群动态, 而不必考虑哺乳动物环境的贡献。利用体外培养技术, 模拟了胃肠道的生理条件, 包括 ph 值、温度、厌氧菌和转运时间等参数。通过添加黏液涂层载体, 创建黏膜相, 并添加进一步的维度, 模拟结肠的肠道表面。通过接种人体粪便材料, 引入肠道微生物群。在接种这种复杂的细菌混合物时, 特定的微生物在不同的纵向 (上升, 横向和下降冒号) 和横向 (腔和粘膜) 环境的体外模型中被丰富。至关重要的是, 要让系统达到稳定的状态, 在这种状态下, 社区和产生的代谢物保持稳定。本手稿的实验结果证明了接种肠道微生物群群落如何随着时间的推移发展成为一个稳定的群落。一旦达到稳定状态, 该系统可用于分析细菌相互作用和社区功能, 或测试任何添加剂对肠道微生物群的影响, 如食品、食品成分或药物。

引言

肠道微生物群是一个微生物群落, 存在于人类胃肠道 (git) 中。 这个群落在结肠中达到最大浓度, 估计可容纳 10 13-10^{14 种}细菌, 来自500-1000 种, 与结肠环境 1^,2共生。肠道微生物群的组成和功能沿 git 发生了空间变化, 形成了区域特定的群落, 最多样化^{的是远端 2、3、4、5}。对于每个解剖区域, 不同的微生物群落居住在腔内和粘膜^{衬里 6}。当底物穿过腔室 7时 7时⁷时, 腔内社区可以更直接地获得营养物质。尽管如此, 一些细菌优先居住在粘液层, 利用结肠细胞产生的粘液作为能量来源^1,5,8。腔内和黏膜相微环境的差异导致了分化和特定期群落的发育。这些群落共同提供代谢功能, 如营养代谢和维生素的产生, 以及免疫功能, 如防止人类病原体的殖民^1,3,9. 肠道微生物区系在与人结肠细胞的共轭作用^下也起作用3。

作为人类 git 的重要组成部分, 众所周知, 肠道微生物群对宿主健康和疾病状况^{的贡献3、9、10、11、12 也}就不足为奇了。肠道微生物群的变化与多种人类疾病有关, 包括肠道疾病 (ibd) 和肠道综合征 (ibs) 等 git 疾病, 以及肥胖、循环系统疾病和自闭症等其他疾病^{3 个,9,10,11,12}. 肠道微生物群产生的代谢物具有全球效应, 到达远离肠道的地方^12、13.例如, 肠道-大脑轴与焦虑和抑郁等精神障碍有关.因此, 研究肠道微生物群对多个研究领域都很重要, 适用于许多疾病, 即使是那些与 git 并不经常相关的疾病。

虽然人们普遍承认, 研究肠道微生物群很重要, 但这是一项复杂的工作。有多种动物模型, 从斑马鱼、老鼠和老鼠等小动物, 到猴子和^{猪 15-19}等较大的动物。然而, 这些动物在人体肠道微生物区系方面的应用并不简单, 因为这些动物有一个独特的细菌群落, 这种群落是在环境和饮食的基础上进化而来的, 它们在解剖上与人类不同^,21. 使用人的主体消除了相关性问题, 但又带来了另一组挑战。人类研究是昂贵的, 耗时的, 并在道德上受到限制11。此外, 混淆因素影响肠道微生物群在人类研究中, 包括年龄或发育阶段, 环境, 饮食, 药物, 和遗传因素^{2,4, 22}。 对可以在人类身上检测的东西, 以及可以在什么时候采集哪些类型的样本也有限制 4。

使用体内系统研究肠道微生物群的一个关键缺点是哺乳动物成分的存在。肠道微生物群和人体细胞相互作用, 在体内环境中, 不可能区分这两者。肠道微生物群产生的代谢物由结肠细胞吸收, 因此无法精确计算测量结果。因此, 任何机械研究都必须限于终点测量 11.体内研究的另一个主要缺点是无法纵向从 git 23 的不同区域采集样本.这不允许评估随着时间的推移结肠微环境中可能发生的变化 12. 包括人类研究在内的许多体内研究都依靠粪便样本分析来检测肠道微生物群^的变化。虽然这是提供信息, 但它没有提供整个 git 肠道微生物群的数据, 也没有区分腔和黏膜^{群落 5、6、7、8}。

对于肠道微生物群, 需要应用体外方法来研究细菌群落的动态, 而不受哺乳动物成分的干扰。使用体外方法可以严格控制环境^{条件 10}, 同时测试多个参数, 并能够进行纵向采样, 并在大容量¹¹。由于体外方法使用的是机械设备, 而不是主机, 因此不需要考虑年龄、环境、饮食或遗传背景。这些系统可以用来测试整个肠道微生物群群落, 只能测试选定的生物, 甚至是单一的菌株。重要的是, 体外结果是可重现的, 但仍保留了与体内研究^11,22相当的多样性水平。

根据所涉及的假设和预期的结果, 可以通过多种方式进行体外研究。 它们可以利用单血管系统和简单的方法, 例如用粪便均质24小时孵化样品, 或在 24-48 25^期间进行单批培养。它们还可以使用单血管系统和更复杂的方法来完成, 例如使用恒温器系统来产生稳定的肠道微生物群落¹¹。然而, 使用单个反应器可以过度简化微生物群^12,因为它只代表结肠的一个部分, 即使结肠是由上升、横向和下降区域组成的。

为了研究在结肠不同区域 (上升、横向和下降区域) 发育的肠道微生物群群落, 可以采用复杂的多阶段系统。在这些系统中, 建立了多个血管来模仿结肠的不同区域, 因此上升、横向和下降区域的肠道微生物群是独立培养的。这些容器是连接的, 使用泵按顺序移动基板, 从上升到横向到下降的结肠区域, 模仿营养物质通过 git 的流动。

本研究的目的是展示如何利用5个阶段的体外培养系统 (见材料表) 来培育肠道微生物群群落, 并展示稳定和组成方面的群落动态。在这个系统中, 一个血管代表胃, 一个代表小肠。冒号分为三个区域 (上升、横向、下降), 每个区域^{为26个区域.}在这一实验设置中, 两个完整的系统并行运行, 第1单元包含粘液载体, 以表示黏膜表面, 第2单元不含粘液载体。利用 16s rrna 基因测序和 scfa 分析, 对每个区域在腔和黏膜阶段发育的群落进行了比较, 并对一段时间内的粪便接种进行了比较。所提供的结果证明了社区的类型, 无论是在组成和功能方面, 都可以从这种类型的体外系统中产生。

研究方案

1. 材料和制剂

请注意:定义的介质是作为粉末购买的 (见材料表)。g/l 中定义介质的组成如下: arabinogalactan (1.2)、pectin (2.0)、xylan (0.5)、葡萄糖 (0.4)、酵母提取物 (3.0)、特殊肽 (1.0)、粘液素 (2.0)、l-半胱氨酸-hcl (0.2)。

1. 准备定义的介质
   1. 用双蒸馏化、去离子水填充4升的烧瓶。
   2. 在水中加入29.2 克的中粉, 混合装置完全均匀。
   3. 在盖子上加入磁性搅拌器, 松松地拧紧螺丝。
   4. 在121°c 下的高压灭菌器30分钟。
   5. 冷却后, 将准备好的定义介质存放在4°c 的冰箱中, 并具有恒定的搅拌 (磁力搅拌器)。
2. 准备胰液
   1. 在121°c 下, 在121°c 下, 在121°c 下, 在5l 容器中加入了搅拌器杆, 将蒸馏水和去离子水制成的2升高压灭菌器。
   2. 高压灭菌后, 让水冷却到室温。
   3. 加入12.5 克那合组织₃, 6 克胆汁, 0.9 克胰蛋白酶。放置在磁力搅拌器上混合。
      请注意:胰液应每2-3天新鲜一次, 制作后应进行搅拌冷藏。
3. 磷酸盐缓冲液
   1. 将装有磁性搅拌器杆的1l 烧瓶放在磁性搅拌器上。加入 0.5 l 的蒸馏水、去离子水, 然后打开搅拌。
   2. 下一步, 加入 6.8 g kh₂po₄, 8.8 克 k₂hpo4 和 0.1 g 硫代乙酸钠。用水顶至1升的最终体积。
   3. 组件完全溶解后, 使用 naoh 将 ph 值调整到7.0。
   4. 将缓冲液倒入一个2升的容器, 在121°c 下, 带螺帽盖, 并在121°c 下高压灭菌器, 30分钟. 确保盖子松松地拧紧, 不紧闭。
   5. 从高压灭菌器中取出后, 让溶液冷却到室温。将缓冲液在室温下存放长达2周。
4. 准备粘液素琼脂载体
   1. 高压灭菌塑料粘液载体 (见材料表)、钳子、塑料网 (管状形状) 和131°c 下的拉链30分钟。
   2. 在131°c 下, 双蒸馏、去离子水的高压灭菌器300毫升, 在室温下储存 30分钟, 直至使用。
   3. 在带有层流的生物安全柜中, 用无菌钳将无菌培养皿中充满塑料粘液载体。
      请注意:粘液载体是中空的塑料圈, 充满了粘液琼脂。一旦填充, 盖子可以放在上面, 这些可以放在一边。
   4. 准备粘液琼脂, 在300毫升的蒸压水中加入3克细菌琼脂和15克猪粘液。
   5. 在烟罩中, 将此溶液煮沸, 然后从热源中取出, 冷却 1分钟, 重复煮沸和冷却, 共3次。
   6. 一旦含有粘液琼脂溶液的玻璃容器冷却到可以触摸, 就用层流将其移入生物安全柜。
   7. 在带有层流的生物安全柜中, 将液体粘液琼脂倒在放置在 petri 盘中的塑料粘液载体上。确保所有载体完全充满粘液琼脂。
   8. 将盖子放回培养皿上, 让它在层流下冷却。
   9. 要组装粘液载体, 请使用高压塑料网, 并使用无菌钳插入含有培养皿中固化粘液琼脂的粘液载体。
   10. 使用拉链关闭网格的两端。这样网运作包含被黏液物琼脂填装的粘液载体。在4°c 下存放, 直至使用。

2. 系统的设置、接种和运行

1. 养殖系统的建立
   注:本研究采用了人类肠道微生物生态系统的双模拟器。
   1. 将10个含有搅拌器杆的生物反应器放置在磁力搅拌器上, 然后打开搅拌。
      请注意:每个单位将由5个生物反应器组成, 因此2个单位将需要10个生物反应器。
   2. 通过蠕动泵, 使用硅管依次连接5个生物反应器 (图 1)。使用泵将流体含量从一个生物反应器横向到下一个生物反应器。
   3. 标记生物反应器在以下序列: 胃, 小肠, 上升结肠, 横向结肠, 下降结肠代表胃肠道的顺序。
      请注意:生物反应器可以都是相同的, 或者与结肠生物反应器相比, 胃和小肠生物反应器可以更小, 因为它们的体积会更小。以这种方式设置生物反应器意味着上升结肠区域从小肠中获得营养物质, 横向结肠区域从上升结肠区域获得营养, 而下降的结肠区域从提升结肠区域获得营养物质。横向区域。通过这种方式, 系统模仿营养物质通过胃肠道的顺序运动。
   4. 使用磁力搅拌器, 将规定的中汁和胰液放入4°c 的冰箱中, 不断搅拌。使用硅管, 通过蠕动泵将定义的介质连接到胃生物反应器, 并通过蠕动泵将胰液连接到小肠。
   5. 在尿液排水袋中加入固化剂。通过蠕动泵将下降的结肠连接到尿液引流袋。在实验过程中将凝固的生物废物作为生物废物处理。
   6. 使用硅胶管, 按顺序连接每艘容器的水套, 并将每一端连接到循环水浴。用蒸馏水灌满循环水浴 (这一数额将根据所使用的循环水浴的类型而有所不同), 并设置为37°c。
   7. 使用硅管, 通过蠕动泵将酸和底座连接到每个容器的盖子上。推荐浓度为 0.5 m hcl 和 0.5 m naoh。
   8. 通过盖子中的指定端口将 ph 探头插入每艘容器。此端口设计用于固定 ph 探头并将螺钉固定在盖子中 (图 1)。设置每个区域的 ph 值如下: 胃, ph 值 = 2;小肠, ph 值 = 6.7-9. 9;上升结肠, ph 值 = 5.6-5.9;横向结肠, ph = 6.15-6.4;下降结肠, ph = 6.6-6.9。
      请注意:在初始阶段, 群落将根据区域 ph 值的差异进行区分。然而, 一旦喂养周期开始, 社区将进一步成熟的基础上, 营养输入的差异。
   9. 使用硅管将氮气线连接到每个容器的盖子上, 使用指定的端口。氮线应按以下顺序流动: 胃、小肠、上升结肠、横结肠、下降结肠。确保每个单元都有自己的冲洗, 以避免交叉污染。
      请注意:氮被用来去除系统中的氧气, 并在实验中保持厌氧菌病。
   10. 使用指定的端口通过每个生物反应器的盖子插入金属样品管。金属管向下延伸到生物反应器中, 用于采集流体样品。
   11. 在样品管的顶部添加一小块硅管, 并连接 luer 锁, 以便在取样过程中使用注射器。
2. 系统的接种
   1. 使用以下卷使用定义的介质填充冒号区域: 上升冒号中的 500 ml、横向冒号中的 800 ml 和下降冒号中的 600 ml。
   2. 在结肠区添加粘液琼脂载体, 其数量与反应器的体积成比例。在这个实验中, 每个反应器使用了60个载体。
   3. 使用样品管和注射器去除任何多余的定义介质, 因为添加载体可提高生物反应器中的液体水平。
   4. 打开 ph 探头, 使用计算机调整每个反应器中的 ph 值。
   5. 打开氮气冲洗20分钟。
      请注意:用于接种的粪便均质体是在10% 甘油溶液中作为10% 的粪便均质购买的 (见材料表)。粪便样本从捐献者中随机抽取, 其标准如下: 美国人在21-45 之间吃典型的西方饮食 (不是素食主义者或素食主义者), 不含抗生素至少 1年, 平均体重指数 (18.5-24.9).对于该协议, 只使用一个捐献者。但是, 由于实验设计, 这一点可以改变。
   6. 在接种之前, 按照制造商的准则解冻粪便均质。
   7. 通过样品端口添加相当于反应器体积5% 的粪便均质, 通过60毫升注射器 (横向结肠上升为25毫升, 横向结肠为 40 ml, 下降结肠为 30 ml), 从而接种每个结肠反应器。
   8. 通过 ph 控制, 在生物反应器中连夜生长培养。
   9. 在一夜生长后, 从每个结肠区域采集腔内液体的样本, 详见下文第3节。采样完成后, 打开计算机程序开始喂食。
3. 每日喂食周期
   注:每天的送料周期是计算机自动化的。
   1. 每天三次, 将140毫升的规定培养基泵入胃部生物反应器, 并允许孵育1小时。
   2. 孵育1小时后, 将胃的内容物泵入小肠。同时, 将60毫升的胰液注入小肠。
   3. 在小肠中, 将 ph 值调整为 ph 值 6.7-9. 9, 并允许混合物孵育90分钟。在孵育过程中, 打开每个系统的氮气冲洗, 每个系统总共10分钟。
   4. 90分钟孵育后, 将泵从小肠打开到上升结肠, 将上升结肠打开到横向结肠, 将横向结肠打开到下降结肠, 同时将下降结肠打开到废物。
4. 实验时间线
   注:此处使用的体外系统以连续的方式运行, 长度约为8周。下面是一个推荐的实验时间表, 但是, 这可以根据实验的要求和目标进行修改。
   1. 按照步骤2.1 中列出的步骤设置系统。
   2. 按照下面的协议从隔夜增长中收集样本。开始每天的循环, 按照上述协议每天进食三次。
   3. 运行实验总共 2周, 让细菌稳定。
      请注意:运行该系统意味着保持 ph 值, 每天三次遵循每天三次喂养周期, 每周2-3 次改变黏膜载体。
   4. 稳定后, 将实验作为对照期运行2周。
   5. 控制期结束后, 使用系统测试不同的组件或变量, 称为治疗期。
   6. 治疗期结束后, 停止添加组件或变量, 并将条件恢复正常。这被认为是冲洗期, 用于确定对社区的改变是否是永久性的。

3. 从系统中收集样品

请注意:在实验过程中, 可以按照以下准则, 随时从任何区域的腔或粘膜阶段采集样本。

1. 收集腔内样品
   1. 通过延伸到培养液中间的样品端口收集流水样品。首先用70% 乙醇或小酒精垫清洗样品端口上的 luer 锁, 并允许干燥。
   2. 确保从30毫升注射器中取出所有空气, 并将其连接到样品端口。向上和向下拉3-5 次, 以确保容器组件的适当混合。之后, 共绘制30毫升的文化。
   3. 根据需要将流光样品放入无菌猎鹰管中, 并存放在冰上。取样完成后, 将其转移到-80°c 的冰柜中。
   4. 对于 scfa 分析, 在4°c 下旋转15毫升的腔样, 在5分钟内旋转 5, 000 x 克.上清液使用 pes 0.2μm 过滤器进行注射器过滤。将过滤后的上清液存放在-80°c。
      1. 为了 dna 分析, 在4°c 下旋转1毫升的腔液, 在4°c 下旋转 5, 000 x克10分钟, 丢弃上清液, 并将颗粒储存在-80°c。
      2. 作为备份, 将10毫升的流明液存放在-80°c, 用于大多数实验。
2. 收集黏膜样本
   注:每2-3天更换一次粘膜载体。
   1. 从冰箱中取出并取出准备好的粘液载体。
   2. 打开氮气冲洗, 迅速打开反应堆盖。去除50% 的粘液载体, 并添加新的。
   3. 迅速密封盖子, 并保持氮气冲洗了20分钟。
   4. 对于 dna 提取, 脂肪 0.25-0.5 g 的琼脂进入一个2毫升管, 并存储在-80°c, 直到需要。

4. dna 提取、测序和分析

请注意:dna 是用 ctab dna 提取方法在通风柜²⁹中物理均质的方法提取的。提取后, 使用分光光度计对每个样本中的 dna 含量进行量化。

1. 准备 ctab 缓冲区
   1. 在200毫升的去离子蒸馏水_中溶解 4.2 g k 2 hpo 4 和 4.09 g ncl, 然后在121°c 下高压灭菌30分钟。
   2. 让溶液冷却到室温。
   3. 加入10克六烷基三甲基溴铵 (ctab), 搅拌至60°c。
   4. 在所有的 ctab 溶解后, 将溶液从热和冷却中取出到室温。
2. 准备聚乙二醇-6000 解决方案
   1. 在1升的去离子蒸馏水中溶解300克的聚乙二醇 6, 000 和93.5 克氯化碳。
   2. 在所有颗粒溶解后, 在121°c 下对溶液进行30分钟的高压灭菌。
   3. 高压灭菌后, 使用前将溶液冷却至室温。
3. 执行 dna 提取
   1. 在2毫升样品管和涡流中加入500μl 的 ctab 缓冲液和500μl 的苯酚-氯乙烯醇-异戊醇进行均质化。
   2. 将样品管的全部内容物转移到 0.1 mm 的物理均质管 (见材料表)。
   3. 在最高设置下两次将管材均质为 20秒, 中间暂停 20秒, 使用物理均质机 (见材料表)。
   4. 以 3, 000 x g 的速度离心均匀管 5分钟。
   5. 将上清液的300μl 转移到干净的 1.7 ml 管中, 并在原管中添加500μl 的 ctab 缓冲液。
   6. 在4.3.2 步骤中再次同质化该管----4.3.3 和离心机在 3, 000 x g处5分钟。
   7. 离心后, 再将300μl 的上清液转移到新管中, 新管中现在含有600μl。
   8. 在含有600μl 上清液的试管中总共加入600μl 氯-异戊醇。
   9. 将管材倒置混合, 然后短暂离心。将上相500μl 转移到干净的 1.7 ml 管中。确保只采取顶部阶段。
   10. 接下来, 加入1000μl 的 pg-6000 溶液, 倒置管混合, 然后在室温下孵育2小时。
   11. 孵育后, 将管材在 18, 200 x x 克、4°c 下离心10分钟。
   12. 丢弃上清液, 用冰凉70% 乙醇清洗颗粒。
   13. 在 18, 200 x克,4°c 的温度下再次离心管 10分钟, 丢弃上清液, 并允许颗粒在层流下在生物安全柜中干燥。
   14. 颗粒干燥后, 在每个管中加入75μl 的无 rnse、无 dnasse 水。
   15. 用分光光度计对重新悬浮的 dna 进行定量, 然后将其发送到 16s rrna 基因测序。

5. 短链脂肪酸 (scfa) 检测与分析

1. 将冷冻样品40°C 解冻 30分钟, 并以 2:1 (v: v) 的比例使用二乙醚提取短链脂肪酸。
2. 将有机相转移到装有一个柱的 gc/ms (见材料表), 该柱为30米、0.25 mm id、0.25 微米 (参见材料表), 在该柱中注入10μl。
3. 将注入端口温度和初始柱温度分别设置为260°c 和125°c。将初始温度保持在 1分钟, 然后将其提高到 250°c, 超过11.5 分钟, 柱流量为 1 ml/min。
   请注意:离子源的 ms 温度是220°C 和接口的250°C。
4. 使用标准曲线和 2-甲基己酸作为内部标准, 对每个 scfa 的数量进行量化。

结果

上述协议描述了一个5个阶段的体外系统的建立、接种和运行, 以研究结肠的肠道微生物群。为了生成以下数据, 在 dna 提取后, 儿童医院微生物组中心利用高通量测序 (例如 miseq ilumina 平台) 对 v1v2区域进行了 16s rRNA 标记基因 dna 测序费城²⁷。采用 qiime (微生物生态学定量洞察)^{1.9 28 版对}测序数据进行处理, 并在 r 环境下进行统计分析, ...

讨论

建立了体外培养系统, 研究大肠肠道微生物群。他们使用的设备设计, 以模拟胃肠道的生理条件, 促进一个成熟的肠道微生物群落的生长, 为结肠³³的每个区域。虽然这个概念是合乎逻辑和可理解的, 但研究肠道微生物区系的体外培养系统的实际运行需要精确和了解所需的内容和预期产生可靠结果的情况。

体外肠道微生物区系实验所需的元素是, 群落在接种后必...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
TWINSHIME	Prodigest	NA
Defined medium (Adult M-SHIME growth medium with starch)	Prodigest	NA
Masterflex tubing	cole Parmer	NA
Urine Drainage bag	Bard	NA
Labsorb	Sigma-Aldrich	NA
Fecal sample	Openbiome	NA
Syringes	Becton Dickson	NA
Defined medium	Prodigest	NA
Oxgall Bile	Becton Dickson	NA
Pancreatin	Sigma-Aldrich	NA
Glass ware	Ace Glass	NA
Porcine mucin	Sigma-Aldrich	NA
Bacteriological agar	Sigma-Aldrich	NA
Sterilization pouches	VWR	NA
BeadBug	Benchmark Scientific	NA
Triple-Pure High Impact Zirconium 0.1 mm Bead beater tube	Benchmark Scientific	NA
RNAse free, DNAse free, sterile water	Roche	NA
Shimadzu QP2010 Ultra GC/MS	Shimadzu	NA
Stabilwax-DA column, 30 m, 0.25 mm ID, 0.25 µm	Restek	NA
plastic mucin carriers	Prodigest	NA