JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هي الناجمة عن أورام المثانة مورين مع مسرطن النيتروسامين N-butyl-N-(4-hydroxybutyl) (BBN). يتم توليد ورم المثانة غير المتجانسة؛ ولذلك يلزم إجراء تقييم دقيق لعبء الورم قبل التعشيه للعلاج التجريبي. نقدم هنا بروتوكولا التصوير بالرنين المغناطيسي سريعة وموثوق بها لتقييم حجم الورم والمرحلة.

Abstract

نماذج ورم المثانة موريني حاسمة لتقييم الخيارات العلاجية الجديدة. أورام المثانة التي يسببها مع مسرطن النيتروسامين (BBN) N-butyl-N-(4-hydroxybutyl) مفيدة أكثر النماذج المستندة إلى خط الخلية نظراً لأنها عن كثب تكرار الملامح المجينية الأورام البشرية، وخلافا لنماذج الخلية وتكثيفها، أنها توفر فرصة جيدة لدراسة إيمونوثيرابيس. ومع ذلك، توليد ورم المثانة غير المتجانسة؛ ولذلك يلزم إجراء تقييم دقيق لعبء الورم قبل التعشيه للعلاج التجريبي. الموصوفة هنا هو نموذج الماوس BBN وبروتوكول لتقييم المثانة سرطان الورم العبء في فيفو استخدام تسلسل رنين المغناطيسي سريعة وموثوق بها (السيد) (صحيح [فيسب]). هذا الأسلوب بسيط ويمكن الاعتماد عليها لأنه، خلافا للموجات فوق الصوتية، السيد عامل مستقل ويسمح بمعالجة مباشرة بعد اقتناء الصور والاستعراض. استخدام صور محورية من المثانة، تحليل للمناطق ذات الاهتمام على طول الجدار المثانة وورم السماح لحساب مساحة الجدار وورم المثانة. يرتبط هذا القياس مع السابقين فيفو وزن المثانة (rs= 0.37، ف = 0.009) ومرحلة الورم (p = 0.0003). وفي الختام، BBN يولد الأورام غير المتجانسة التي تعتبر مثالية لتقييم إيمونوثيرابيس، والتصوير بالرنين المغناطيسي بشكل سريع وموثوق بها تقييم عبء الورم قبل التوزيع العشوائي للأسلحة العلاج التجريبي.

Introduction

سرطان المثانة هو السرطان الأكثر شيوعاً من الخامس عموما، مسؤولة عن حوالي 000 80 حالة جديدة و 000 16 حالة وفاة في الولايات المتحدة في عام 20171. بعد حوالي 30 سنة دون تقدما كبيرا في علاج سرطان المثانة2النظمية، أثبتت المحاكمات المانع حاجز المضادة-PD-1 ومكافحة-PD-L1 الأخيرة ردود مثيرة وأحيانا دائمة في المرضى الذين يعانون من متقدمة urothelial سرطان3،،من45. ومع ذلك، فقط حوالي 20% مرضى وتظهر استجابة موضوعية لهذه العلاجات، وكذلك الدراسات مطلوبة لتوسيع الاستخدام الفعال للعلاج المناعي في المرضى الذين يعانون من سرطان المثانة.

نماذج سرطان المثانة مورين أدوات حاسمة في التقييم السريري لعلاجات رواية6،7. من أجل التحكم لحجم الورم عند التعشئه الفئران للعلاجات المختلفة، يجب تقييم عبء الورم والتحكم بين مجموعات العلاج. الدراسات السابقة استخدمت الموجات فوق الصوتية أو الإضاءة الحيوية لتقييم أورثوتوبيك المثانة المستندة إلى خط خلية سرطان8،نماذج9،10،11. ومع ذلك، يقدم كلا تقنيات عدة عيوب. قياسات الموجات فوق الصوتية يمكن أن يتأثر بالمهارات للمشغل وتفتقر إلى ميزات ثلاثية الأبعاد وعالية الدقة المكانية. أساليب الإضاءة الحيوية يمكن أن يوفر تقييم شبه كمي للخلايا السرطانية فقط، ولا تسمح للتصور من مورفولوجيا وتشريح المثانة. وعلاوة على ذلك، يمكن فقط استخدام الإضاءة الحيوية مع النماذج المستندة إلى خط الخلية، التي تعبر عن طرحه الجينات في الفئران أصلع أو الفئران بمعاطف بيضاء.

التصوير بالرنين المغناطيسي (التصوير بالرنين المغناطيسي)، من ناحية أخرى، يوفر مرونة فريدة من نوعها في الحصول على صور عالية الدقة التشريحية، نستعرض طائفة واسعة من التباين الأنسجة يمكن التصور الدقيق والتقييم الكمي لعبء الورم دون الحاجة إلى التعبير عن خصائص طرحه. صور السيد استنساخه بسهولة أكبر مع خطوط الأنابيب التحليل المناسبة وتضمن التصور ثلاثي الأبعاد للمثانة. أكبر القيود المفروضة على التصوير بالرنين المغناطيسي هي طول الفترة الزمنية اللازمة لفحص وارتفاع التكاليف المرتبطة بها التي تحد من فحوصات عالية الإنتاجية. ومع ذلك، لقد بينت دراسات عديدة أن سقونسس يمكن أن توفر صور عالية الجودة التشخيصية التي يمكن استخدامها للكشف عن فعالية ورصد أورام المثانة المستندة إلى خط الخلية؛ وهكذا، يمكن لتحليل الإنتاجية العالية9،12.

هنا، يمكننا وصف أسلوب المستندة إلى السيد غير الغازية لموثوقية وكفاءة تميز الأورام الناجمة عن مادة مسرطنة المثانة في الفئران. ولتحقيق ذلك، نحن نستخدم تصوير سريع مع حالة ثابتة الحركة البدارية MR تقنية (صحيح [فيسب])، الذي تضمن دورات قصيرة المدة في المسح في حين لا يزال توفير جودة عالية وعالية الدقة المكانية (~ 100 ميكرون) لكشف وقياس المثانة 13من الأورام. وعلاوة على ذلك، التأكد من دقة هذا الفحص بالرنين المغناطيسي غير الغازية، يصف لنا الترابط بين المعلمات المستمدة من التصوير بالرنين المغناطيسي و السابقين فيفو وزن المثانة، فضلا عن مرحلة الورم أكد مرضية.

Protocol

عليها جميع الأساليب الموصوفة هنا "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (إياكوك) من جامعة نورث وسترن.

1-تنظيم دورات تعريفية للأورام مع BBN

  1. الحصول على فئران C57/BL6 الذكور، كل 6 أسابيع على الأقل القديمة.
    ملاحظة: وضع الفئران الذكور سرطان المثانة أكثر بسرعة وبانتظام من الفئران الإناث14،15.
  2. إضافة أمين N-nitrosobutyl(4-hydroxybutyl) (BBN) بجرعة 0.05% لمياه الشرب. قم بتخزينها في حاوية غير شفاف وتزويدها libitum الإعلانية كمياه الشرب للفئران16.
    ملاحظة: تخزين الحل BBN في حاوية واضحة سوف تتحلل مادة مسرطنة17.
  3. تغيير الماء BBN 0.05% مرتين في الأسبوع.
  4. مراقبة الحيوانات بالتفتيش عن علامات الشدة المرتبطة بأورام المثانة، بما في ذلك بيله دموية والمثانة الراسخ، والجماهير. فحص الفئران مرتين في الأسبوع، أو وفقا للمبادئ التوجيهية إياكوك المحلية.
  5. تتوقع الأورام بين 16 و 24 أسبوعا من التعرض18.

2-التصوير بالرنين المغناطيسي الإعداد

  1. القيام حقن تحت الجلد من المحلول الملحي المعقم (0.1-0.2 مل باستخدام حقنه الإبرة ومل 1 ز 25 – 27) 10 دقيقة قبل التصوير بالرنين المغناطيسي لتسهيل ملء المثانة.
  2. تخدير كل الماوس مع خليط غاز 100% O2 و isoflurane (2%-4% حسب الاقتضاء). التحقق من طائرة كافية للتخدير باختبار منعكس سحب (قرصه إصبع القدم) قبل المتابعة. تطبيق مرهم العين العقيمة للحيوان.
  3. نقل الماوس إلى صاحب التصوير تجهيزه نوسيكوني لإيصال isoflurane المستنشقة (0.5%-3%).
  4. مراقبة درجة حرارة الجسم والتنفس باستخدام مجس درجة حرارة المستقيم متصل بالكمبيوتر تسجيل الفسيولوجية.
    ملاحظة: يتم الاحتفاظ بدرجة حرارة الجسم العادية (36 – 37 درجة مئوية) استخدام الدارة الماء الساخن تعمل في صلب السيد صاحب الحيوان. درجة الحرارة تقاس عن طريق جهاز استشعار المستقيم وتسجيلها على الكمبيوتر الرصد الفسيولوجية باستخدام مخصص الفسيولوجية ورصد البرامج. يتم استخدام نفس النظام لتسجيل إشارات رسم القلب والتنفس يقاس من خلال وسادة هوائية تحت القفص الصدري و عن طريق 3-يؤدي تخطيط قلب كهربائي. إشارة التنفس يستخدم أيضا لتحريك الحصول على التصوير بالرنين المغناطيسي، والحد من القطع الأثرية المرتبطة بحركة التنفس.

3-التصوير بالرنين المغناطيسي الحصول على الصور

  1. استخدام لفائف هيئة التربيع للإثارة.
  2. وضع لفائف متلقي 4-القناة في أسفل البطن من الماوس التي تم مسحها ضوئياً لتمكين الكشف عن إشارات من منطقة الاهتمام الأمثل.
  3. بدء التعديلات التلقائي من خلال برامج التصوير المتكاملة للحصول على مجموعة ثلاثي محوري من صور للجسم كله الماوس. من هذا المرجع مجموعة من الصور، وتحديد المنطقة للفائدة (في هذه الحالة، منطقة المثانة).
  4. الحصول على ثلاث مجموعات من متعامد شرائح الصور على طول الطائرات المحورية والاكليليه السهمي استخدام أطر مرجعية الإشعاعية.
  5. استخدام [فيسب] صحيح التصوير تسلسل (المضمنة كواحدة من الميزات الموجودة في برامج التصوير المتكاملة) مع السيد المعلمات التالية: TR = 900 مللي ثانية، الشركة المصرية للاتصالات = 2 مللي ثانية، اتحاد كرة القدم = 70، 14 المتوسطات.
    ملاحظة: هذه مجموعة من معلمات تسمح للتصوير السريع مع عالية الجودة التشخيصية، بما في ذلك الترجيح T1/T2 في < 10 دقيقة للماوس.
  6. سمك القرار وشريحة المكانية تتحدد هندسية المعلمات المحددة من قبل المستخدم من خلال واجهة رسومية لمنصة التصوير المتكاملة. هذه النتائج في سلسلة من الشرائح عبر المثانة كله سمك 0.5 مم مع قرار في الطائرة من 0.148 مم.

4-السيد تحليل الصور

  1. تحديد مجموعة شرائح من سمك 0.5 مم والقرار في الطائرة من 0.148 مم تغطي المثانة كاملة.
  2. تصدير إلى برمجيات تحليل الصور الطبية عن طريق تحديد المجلد مع الصور المقابلة في شكل تحليل.
  3. حدد "عرض محوري الممثل" في مركز المثانة للتحليل الكمي بالتمرير من خلال الصور التي تم إنشاؤها وتحديد شريحة في نقطة الوسط من المثانة، والذي يسمح لرؤية جدار المثانة والتجويف.
    ملاحظة: يجب أن تكون الشريحة مركز اختيار واحد مع قطر أكبر.
  4. تحدد منطقة الفائدة (ROI) بعناية عن طريق تتبع الحدود حول الحافة الخارجية للمثانة (بلوخبها)، وحول التجويف الداخلي (بلوخفي) المثانة يدوياً (انظر الشكلين التخطيطي والممثل في الشكل 2) في طريقة العرض المحوري التمثيلية المختارة.
  5. طرح التجويف الداخلي من الحافة الخارجية لحساب المساحة السطحية لجدار المثانة.
    بلوخالجدار = بلوخبها --بلوخفي
    ملاحظة: المساحة السطحية للمثانة التحكم مع لا ورم يتوقع أن تكون أقل من ذلك مع وجود ورم مثانة.

5-القتل الرحيم وتشريح المثانة

  1. بعد 20 أسبوعا تعرض BBN، euthanize الفئران باستخدام إجراءات التشغيل الموحدة وفقا للمبادئ التوجيهية إياكوك المحلية.
  2. تنظيف منطقة شق مع الإيثانول 70%، ثم أمسك ورفع الجلد جدار البطن بالملقط.
  3. جعل شق خط الوسط من الارتفاق العانة في عملية الرهابه.
  4. حاد جداً في التجويف الصفاقى تتشبث بالملقط وإينسيسينج مع المقص.
  5. تحديد المثانة، والذي يقع في خط الوسط أسفل البطن.
  6. تحديد وقطع في الرباط السري متوسط الاتصال قبة المثانة بالسرة وجدار البطن.
  7. فهم قبة المثانة مع الملقط توفير كونتيرتراكشن وتشريح المثانة بعيداً عن المحيطة الهياكل، بما في ذلك الحويصلات والمستقيم، والدهون.
  8. تحديد الحالب دخول المثانة وقص بالمقص قريبة من المثانة.
  9. رفع المثانة سيفالاد، قطع مجرى البول مع المقص وإزالة المثانة.
  10. وزن المثانة فورا بعد الشطف مع برنامج تلفزيوني.

6-نسيجية فحص أنسجة المثانة

  1. إصلاح أنسجة المثانة في 10% فورمالين مخزنة محايدة ح 36 – 48 في درجة حرارة الغرفة (RT).
  2. تضمين الأنسجة في كتل البارافين وقص الشرائح للفحص اللاحق، ووصمة عار الشرائح مع الهيماتوكسيلين ويوزين للفحص المجهري، وكما هو موضح سابقا19،20.
  3. القيام فحص المجهري للمثانة الماوس في منخفض (2.5 x و 10 x) وتكبير عالية (20 x و 40 x)، دراسة للآفات العيانية وتضخم وسرطان في الموقع، الحليمية، الأورام الحليمية والأورام الغازية19 , 21.

النتائج

باستخدام بروتوكول وصف (الشكل 1)، كانت الناجم عن أورام المثانة في الفئران الذكور C57/B6. تم إجراء التصوير بالرنين المغناطيسي في 16 أسبوعا، وقد euthanized الفئران في 20 أسبوعا. وسجلت السابقين فيفو المثانة الأوزان (الأسلحة البيولوجية) لكل الماوس. كانت الملون الشر?...

Discussion

تصوير دقيق لنماذج الورم ضروري للمناسبة قبل القتل الرحيم التدريج والحيوان والعشوائية قبل الشروع في العلاج التجريبي. استخدام الإجراء المعروضة هنا، علينا أن نبدي المنهجية (1) توليد أورام المثانة باستخدام مادة مسرطنة BBN و (2) التجهيزة عبء ورم المثانة عن طريق استخدام منطقة المستمدة من "السيد ال?...

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgements

م. ج. ج. وتمول "ميزة الإدارة الصحية قدامى المحاربين في" منح BX0033692-01. م. ج. ج. كما تدعمها مؤسسة هانسون ص جون "أبحاث السرطان" في جامعة "روبرت H. لوري شاملة سرطان مركز من شمال غرب البلاد". ونشكر المركز "التصوير متعدية الجنسيات" لتوفير الحصول على التصوير بالرنين المغناطيسي وتجهيزها. مصادر التمويل لم يكن دور في كتابة المخطوطة أو مقرر أن يقدم للنشر.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
C57BL/6 miceThe Jackson Laboratory664Mice
N-butyl-N-(4-hydroxybutyl)nitrosamine carcinogen (BBN)TCI AmericanB0938Carcinogen
0.9% normal salineHospira, IncNDC 0409-488-02
IsofluranePiramal HealthCare60307-120-25Anesthetic
7Tesla ClinScan MRIBrukerNADedicated Small Animal Imaging MRI
SyngoSiemensNAMR Integrated Imaging Software
Model 1030 Monitoring & Gating SystemSmall Animal Instruments, Inc. (SAII)NASmall animal physiologic monitoring
Formalin, Neutral Buffered, 10%SigmaHT501128Fixative
Eosin YFisher ScientificNC1093844Histologic staining agent
HematoxylinFisher Scientific23-245651Histologic staining agent
Jim7Xinapse SystemsNAMedical image analysis software
GraphPad Prism v7.04GraphpadNAGraphing software
R v3.4.2The R Project for Statistical ComputingNAStatistical software
R package pROC v1.10.0.The R Project for Statistical ComputingNAROC analysis

References

  1. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer Statistics, 2017. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 67 (1), 7-30 (2017).
  2. Abdollah, F., et al. Incidence, survival and mortality rates of stage-specific bladder cancer in United States: a trend analysis. Cancer Epidemiology. 37 (3), 219-225 (2013).
  3. Rosenberg, J. E., et al. Atezolizumab in patients with locally advanced and metastatic urothelial carcinoma who have progressed following treatment with platinum-based chemotherapy: a single-arm, multicentre, phase 2 trial. The Lancet. 387 (10031), 1909-1920 (2016).
  4. Sharma, P., et al. Nivolumab monotherapy in recurrent metastatic urothelial carcinoma (CheckMate 032): a multicentre, open-label, two-stage, multi-arm, phase 1/2 trial. The Lancet Oncology. 17 (11), 1590-1598 (2016).
  5. Bellmunt, J., et al. Pembrolizumab as Second-Line Therapy for Advanced Urothelial Carcinoma. New England Journal of Medicine. 376 (11), 1015-1026 (2017).
  6. Chan, E., Patel, A., Heston, W., Larchian, W. Mouse orthotopic models for bladder cancer research. BJU International. 104 (9), 1286-1291 (2009).
  7. Zhang, N., Li, D., Shao, J., Wang, X. Animal models for bladder cancer: The model establishment and evaluation (Review). Oncology Letters. 9 (4), 1515-1519 (2015).
  8. Patel, A. R., et al. Transabdominal micro-ultrasound imaging of bladder cancer in a mouse model: a validation study. Urology. 75 (4), 799-804 (2010).
  9. Chin, J., Kadhim, S., Garcia, B., Kim, Y. S., Karlik, S. Magnetic resonance imaging for detecting and treatment monitoring of orthotopic murine bladder tumor implants. The Journal of Urology. 145 (6), 1297-1301 (1991).
  10. Jurczok, A., Fornara, P., Soling, A. Bioluminescence imaging to monitor bladder cancer cell adhesion in vivo: a new approach to optimize a syngeneic, orthotopic, murine bladder cancer model. BJU International. 101 (1), 120-124 (2008).
  11. Vandeveer, A. J., et al. Systemic Immunotherapy of Non-Muscle Invasive Mouse Bladder Cancer with Avelumab, an Anti-PD-L1 Immune Checkpoint Inhibitor. Cancer Immunology Research. 4 (5), 452-462 (2016).
  12. Kikuchi, E., et al. Detection and quantitative analysis of early stage orthotopic murine bladder tumor using in vivo magnetic resonance imaging. Journal of Urology. 170, 1375-1378 (2003).
  13. Chung, H. W., et al. T2-weighted fast MR imaging with true FISP versus HASTE: comparative efficacy in the evaluation of normal fetal brain maturation. American Journal of Roentgenology. 175 (5), 1375-1380 (2000).
  14. Miyamoto, H., et al. Promotion of bladder cancer development and progression by androgen receptor signals. Journal of the National Cancer Institute. 99 (7), 558-568 (2007).
  15. Bertram, J. S., Craig, A. W. Specific induction of bladder cancer in mice by butyl-(4-hydroxybutyl)-nitrosamine and the effects of hormonal modifications on the sex difference in response. European Journal of Cancer. 8 (6), 587-594 (1972).
  16. Nagao, M., et al. Mutagenicity of N-butyl-N-(4-hydroxybutyl)nitrosamine, a bladder carcinogen, and related compounds. Cancer Research. 37, 399-407 (1977).
  17. Hirose, M., Fukushima, S., Hananouchi, M., Shirai, T., Ogiso, T. Different susceptibilities of the urinary bladder epithelium of animal species to three nitroso compounds. Gan. Gann; The Japanese Journal of Cancer Research. 67 (2), 175-189 (1976).
  18. Shin, K., et al. Cellular origin of bladder neoplasia and tissue dynamics of its progression to invasive carcinoma. Nature Cell Biology. 16 (5), 469-478 (2014).
  19. Epstein, J. I. Chapter 17: Immunohistology of the Bladder, Kidney, and Testis. Diagnostic Immunohistochemistry. , 624-661 (2019).
  20. Cohen, S. M., Ohnishi, T., Clark, N. M., He, J., Arnold, L. L. Investigations of rodent urinary bladder carcinogens: collection, processing, and evaluation of urine and bladders. Toxicologic Pathology. 35 (3), 337-347 (2007).
  21. Wood, D. P. Tumors of the bladder. Campbell-Walsh Urology. 11 (92), 2184-2204 (2016).
  22. Zitvogel, L., Pitt, J. M., Daillere, R., Smyth, M. J., Kroemer, G. Mouse models in oncoimmunology. Nature Reviews Cancer. , (2016).
  23. Kaneko, S., Li, X. X chromosome protects against bladder cancer in females via a KDM6A-dependent epigenetic mechanism. Science Advances. 4 (6), eaar5598 (2018).
  24. Smilowitz, H. M., et al. Biodistribution of gold nanoparticles in BBN-induced muscle-invasive bladder cancer in mice. International Journal of Nanomedicine. 12, 7937-7946 (2017).
  25. Dai, Y. C., et al. The interaction of arsenic and N-butyl-N-(4-hydroxybutyl)nitrosamine on urothelial carcinogenesis in mice. PLoS One. 12 (10), e0186214 (2017).
  26. Williams, P. D., Lee, J. K., Theodorescu, D. Molecular Credentialing of Rodent Bladder Carcinogenesis Models. Neoplasia. 10 (8), (2008).
  27. Fantini, D., et al. A Carcinogen-induced mouse model recapitulates the molecular alterations of human muscle invasive bladder cancer. Oncogene. 37 (14), 1911-1925 (2018).
  28. . NCCN Guidelines in Clinical Oncology - Bladder Cancer 5.2018 Available from: https://www.nccn.org/professionals/physician_gls/pdf/bladder.pdf (2018)
  29. Costa, M. J., Delingette, H., Novellas, S., Ayache, N. Automatic segmentation of bladder and prostate using coupled 3-D deformable models. Medical Image Computing and Computer-Assisted Intervention. 10 (Pt 1), 252-260 (2007).
  30. Rosenkrantz, A. B., et al. Utility of quantitative MRI metrics for assessment of stage and grade of urothelial carcinoma of the bladder: preliminary results. American Journal of Roentgenology. 201 (6), 1254-1259 (2013).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

145 BBN

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved