核磁気共鳴化学発癌剤誘発マウス膀胱腫瘍の評価

要約

マウス膀胱腫瘍は N-butyl-N-(4-hydroxybutyl) ニトロソアミン発がん性物質 (BBN) で誘導されます。膀胱腫瘍の世代は異質です。したがって、ランダム化実験的な治療の前に腫瘍負荷の正確な評価が必要です。腫瘍の大きさおよび段階を評価する高速で信頼性の高い MRI プロトコルをご紹介します。

要約

マウス膀胱腫瘍モデルは、新たな治療選択肢の評価のために重要です。N-butyl-N-(4-hydroxybutyl) ニトロソアミン (BBN) 発癌物質と膀胱腫瘍は細胞ライン ベース モデル上有利な密接に人間の腫瘍の遺伝子プロファイルの複製、細胞モデル、異種移植片とは異なり彼らを提供するため、免疫療法の研究のための良い機会。ただし、膀胱腫瘍の世代は異質です。したがって、ランダム化実験的な治療の前に腫瘍負荷の正確な評価が必要です。ここで説明は BBN マウス モデルと膀胱癌腫瘍負担評価生体内で高速かつ信頼性の高い磁気共鳴 (MR) シーケンス (true FISP) を使用するためのプロトコルです。このメソッドは、シンプルで信頼性の高いので、超音波とは異なり氏はオペレーターに依存して、単純な買収後画像処理とレビュー。腫瘍、膀胱壁に沿って、関心の領域の解析膀胱の軸のイメージを使用すると、膀胱壁と腫瘍領域の計算を可能にします。この測定は前のヴィヴォ膀胱重量と相関 (r_s= 0.37、p = 0.009) と腫瘍の段階 (p = 0.0003)。結論としては、BBN は異種腫瘍免疫療法の評価に最適なを生成し、MRI は迅速かつ確実に実験的治療群にランダム化前に腫瘍量を評価します。

概要

膀胱癌は 5 番目に多い癌で全体的に、約 80,000 の新規症例と 2017年¹にアメリカ合衆国で 16,000 の死の責任があります。膀胱がん²全身治療の著しい進歩なし約 30 年後最近アンチ PD 1 とアンチ PD L1 チェックポイント阻害剤試験は、高度な患者の刺激的で、時折耐久性反応を示しています。尿路上皮癌^3,4,5。患者のおよそ 20% を示すこれらの治療に奏効し、さらなる研究は、膀胱癌患者における免疫療法の効果的な利用を拡大する必要が。

マウス膀胱癌モデルは、新しい治療法^6、7の前臨床評価に重要なツールです。さまざまな治療法にマウスをランダム化する際、腫瘍サイズの制御するために腫瘍の負担が評価され、治療グループ間制御する必要があります。以前の研究では、同所性同種細胞ライン ベースの膀胱癌モデル^8,9,10,11を評価するのに超音波や生物発光を使用しています。しかし、両方の方法は、いくつかの欠点を提示します。超音波測定は、オペレーターのスキルの影響し、三次元機能と高空間分解能不足します。発光方法は腫瘍細胞の半定量的評価を提供できるだけと膀胱解剖学および形態の可視化を可能にしません。さらに、発光はヘアレス マウスや、白いコートを持つマウスの発光遺伝子を発現する細胞ライン ベース モデルでのみ使用できます。

磁気共鳴画像 (MRI) は、他の一方で、幅広い組織コントラストは正確な可視化を可能にすると腫瘍負荷の定量的評価、高解像度の解剖学的画像の取得にユニークな柔軟性を提供します。生物発光の性質を表現することがなく。MR 画像は適切な解析パイプラインをより簡単に再現可能であり、膀胱の 3次元可視化を保証します。MRI の最大の制限は、検討と高コスト高スループット試金を制限するために必要な時間の長さです。しかし、いくつかの研究は、氏シーケンスが効果的に検出およびセル行ベースの膀胱腫瘍を監視するために使用できる高品質な診断画像を提供できることを示しています。したがって、彼らは、ハイスループット分析^9,12の使用可能性があります。

ここでは、確実にかつ効率的にマウスで発がん物質による膀胱腫瘍の特性評価に非侵襲的氏ベース手法について述べる。これを達成するために検出と膀胱の測定のため、高品質と高空間分解能 (~ 100 ミクロン) 提供して短いスキャン セッションを保証する定常摂動氏技術 (true FISP) による高速イメージングを使用します。腫瘍¹³。さらに、この非侵襲性の MRI 測定の精度を確認するため腫瘍の病理組織学的確認の段階と同様、MRI 派生パラメーターおよび前のヴィヴォ膀胱重量との相関関係をについて説明します。

プロトコル

ここで説明したすべてのメソッドは、機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) ノースウェスタン大学によって承認されています。

1. BBN と共に腫瘍の誘導

1. 男性 C57/BL6 マウス、それぞれ少なくとも 6 週齢を取得します。
   注: 雄マウスは、迅速かつ一貫して雌マウス^14,15より膀胱癌を開発します。
2. 飲料水には、0.05% の線量で N-nitrosobutyl(4-hydroxybutyl) アミン (BBN) を追加します。不透明な容器に保管し、マウス¹⁶に飲料水として自由を提供すること。
   注: 明確なコンテナーに BBN ソリューションを格納すると、発がん性物質¹⁷が低下します。
3. 週 2 回 0.05 %bbn 水を変更します。
4. 固まり、しっかり膀胱、血尿など膀胱腫瘍に関連付けられている苦痛の兆候を調べることによって、動物を監視します。週 2 回またはローカル IACUC ガイドラインに従ってマウスを検査します。
5. 露出¹⁸16 ~ 24 週の間に腫瘍を期待してください。

2. MRI セットアップ

1. 滅菌生理食塩水の皮下注射を行う (0.1 – 0.2 mL 25-27 G 針と 1 mL 注射器を使用して) MRI 膀胱充填を容易にする前に 10 分。
2. 100% O₂とイソフルラン (2%-4% に応じて) のガス混合物各マウスを麻酔します。続行する前に引っ込め反射 (つま先ピンチ) をテストすることによって麻酔の適切な面を確認します。動物に生殖不能の眼軟膏を適用します。
3. 吸入イソフルラン (0.5%-3%) の配信のためノーズが整って画像ホルダーにマウスを転送します。
4. 体温と呼吸生理学的記録のコンピューターに接続されている直腸温度プローブを使用して監視します。
   注: 正常な体温 (36-37 ° C) は動物氏ホルダーに組み込まれているお湯の循環回路を使用して維持されます。温度は直腸のセンサーを測定し、専用の生理学的な監視ソフトウェアを使用して生理学的モニター コンピューターに記録。同じシステムを使用して、胸郭と 3 誘導心電図電極を介して下に置かれる空気の枕を測定した呼吸、心電図信号を記録します。呼吸信号も MRI で集録をトリガーと呼吸運動に関連付けられている成果物を減らすのために使用されます。

3. MRI 画像の取得

1. 励振用直交体コイルを利用します。
2. 興味の地域から信号の最適化された検出を有効にするスキャンされているマウスの下腹部に 4 チャンネルの受信コイルを配置します。
3. 三軸セット全体のマウス体内の画像を取得する統合イメージング ソフトウェアによって自動的に調整を開始します。この参照から画像のセットを (この場合は膀胱の領域) に関心の領域を識別します。
4. 放射線のフレームの参照を使用して軸、冠状および矢状面に沿った直交スライス画像の 3 つのセットを取得します。
5. 次の MR パラメーターで true FISP シーケンス (統合イメージング ソフトウェアの機能の 1 つとして含まれている) をイメージングを活用: TR = 900 ミリ秒、TE = 2 ミリ秒、FA = 70、14 平均。
   注: このパラメーターのセットにより、良質診断、T1 ・ T2 の重みを含む急速なイメージングのため < マウスあたり 10 分。
6. 空間分解能・ スライス厚は、統合された画像処理プラットフォームのグラフィカル インターフェイスを通じてユーザーによって選択された幾何学的なパラメーターによって決定されます。平面内の分解能には 0.148 mm 厚さ 0.5 mm の全体膀胱全体のスライスのシリーズでこの結果します。

4. MR 画像の解析

1. 0.5 mm 厚のスライス、面内分解能全体の膀胱をカバー 0.148 mm のセットを識別します。
2. 医用画像解析ソフトウェアにエクスポートするには、分析フォーマットの対応する画像のフォルダーを選択します。
3. 生成されたイメージをスクロールし、膀胱は、膀胱壁と内腔の可視化では、中間点でスライスを識別する定量分析のため膀胱の中心に「代表的な軸表示」を選択します。
   注: 中央のスライスは最大径で選ばれた 1 つをする必要があります。
4. (BLA_を) 膀胱の外側のエッジと膀胱の内部ルーメン (BLA_で) の周囲の境界を手動で追跡することで利益 (率 ROI) の領域を慎重に描く (図 2の回路図と代表的な図参照)選択した代表的な軸のビュー。
5. 膀胱壁のサーフェス領域を計算する外側のエッジからの内部ルーメンを減算します。
   _壁BLA BLA_をBLA_で=
   注: ない腫瘍コントロール膀胱の表面積は、膀胱腫瘍のそれよりも小さいをされる予定です。

5. 安楽死と膀胱の解剖

1. BBN 露出の 20 週間後ローカル IACUC ガイドラインに従って標準操作手順を使用してマウスを安楽死させます。
2. 70% エタノールで、切開部をきれいし、つかみ、鉗子と腹壁皮膚を持ち上げます。
3. 剣状突起に恥骨から正中切開を行います。
4. 鋭く鉗子で把持し、ハサミで切開で腹腔内を切開します。
5. 正中線の下腹部に位置する膀胱を識別します。
6. 特定し、腹壁、臍と膀胱ドームを接続する正中臍靱帯を切ってください。
7. 中指を提供、周辺構造、精嚢、直腸、脂肪などから膀胱を解剖し鉗子で膀胱のドームを把握します。
8. 尿管が膀胱に入るを識別し、膀胱の近くにハサミでカットします。
9. 膀胱を頭の方に持ち上げ、尿道をハサミでカットし、膀胱を削除します。
10. すぐに PBS で洗浄後、膀胱の重量を量る。

6. 膀胱組織の病理

1. 36-48 時間室温 (RT) で 10% 中性緩衝ホルマリンの膀胱組織を修正します。
2. 組織をパラフィン ブロックに埋め込む、その後の検査のためのスライドをカット、ヘマトキシリンとエオシン顕微鏡検査のためのスライドを染色^19,20を前述のよう。
3. 低マウス膀胱の顕微鏡検査を実行 (2.5 倍と 10 倍) と (20 x、40 x) 高倍率、肉眼病変、過形成、上皮内癌、乳頭腫、乳頭状腫瘍、浸潤性腫瘍¹⁹の検証^,21。

結果

記述されているプロトコル (図 1) を使用して、膀胱腫瘍は C57/B6 雄マウスに誘導されました。16 週間で MRI を行いマウスは、20 週間で安楽死されました。前のヴィヴォ膀胱重量 (BW) それぞれについてマウスを記録しました。ヘマトキシリンとエオシン、スライド染色や腫瘍の段階のすべての組織スライドをレビューしました。

ディスカッション

腫瘍モデルの正確な画像は、適切な事前の安楽死のステージングと実験的な治療の開始前に動物のランダム化に必要です。ここに示す手順を使用して、(1) BBN 発癌物質を用いた膀胱腫瘍を生成し、(2) 膀胱腫瘍の負担大幅に氏 MR 派生領域測定 (BLA_壁) 相関を使用して階層化する方法を紹介します。膀胱重量前のヴィヴォ、病理学的腫瘍の段階と関連付けられる。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57BL/6 mice	The Jackson Laboratory	664	Mice
N-butyl-N-(4-hydroxybutyl)nitrosamine carcinogen (BBN)	TCI American	B0938	Carcinogen
0.9% normal saline	Hospira, Inc	NDC 0409-488-02
Isoflurane	Piramal HealthCare	60307-120-25	Anesthetic
7Tesla ClinScan MRI	Bruker	NA	Dedicated Small Animal Imaging MRI
Syngo	Siemens	NA	MR Integrated Imaging Software
Model 1030 Monitoring & Gating System	Small Animal Instruments, Inc. (SAII)	NA	Small animal physiologic monitoring
Formalin, Neutral Buffered, 10%	Sigma	HT501128	Fixative
Eosin Y	Fisher Scientific	NC1093844	Histologic staining agent
Hematoxylin	Fisher Scientific	23-245651	Histologic staining agent
Jim7	Xinapse Systems	NA	Medical image analysis software
GraphPad Prism v7.04	Graphpad	NA	Graphing software
R v3.4.2	The R Project for Statistical Computing	NA	Statistical software
R package pROC v1.10.0.	The R Project for Statistical Computing	NA	ROC analysis