Magnet-Resonanz-Tomographie Bewertung der murinen Blase Karzinogen-induzierte Tumoren

Zusammenfassung

Murine Blase Tumoren werden mit dem N-butyl-N-(4-hydroxybutyl) Nitrosaminen karzinogen (BBN) induziert. Blase Tumor Generation ist heterogen; Daher ist eine genaue Beurteilung der Tumorlast vor Randomisierung, experimentelle Behandlung erforderlich. Hier präsentieren wir Ihnen eine schnelle und zuverlässige MRI-Protokoll zur Beurteilung der Tumorgröße und Bühne.

Zusammenfassung

Murine Blase Tumormodellen sind entscheidend für die Bewertung der neue Therapieoptionen. Blase Tumoren mit N-butyl-N-(4-hydroxybutyl) Nitrosaminen (BBN) Karzinogen induzierten sind vorteilhaft gegenüber zeilenorientierten Zellmodelle, weil sie eng die genomische Profile von menschlichen Tumoren replizieren, und im Gegensatz zu Zellmodelle und Xenotransplantate, sie bieten eine gute Gelegenheit für die Untersuchung von Immuntherapien. Allerdings ist die Blase Tumor Generation heterogen; Daher ist eine genaue Beurteilung der Tumorlast vor Randomisierung, experimentelle Behandlung erforderlich. Hier beschriebenen ist ein Mausmodell BBN und Protokoll, Blase Krebs Tumor Belastung in Vivo unter Verwendung einer schnellen und zuverlässigen Magnetresonanz (MR)-Sequenz (wahre FISP) zu bewerten. Diese Methode ist einfach und zuverlässig, denn im Gegensatz zu Ultraschall, Herr bedienerunabhängige und die einfache Bildverarbeitung nach der Übernahme und Überprüfung ermöglicht. Verwendung von axialen Bildern der Blase, Analyse der Regionen entlang der Blasenwand und Tumor können für die Berechnung der Blase Wand und Tumor-Bereich. Diese Messung korreliert mit ex Vivo Blase Gewicht (R_s= 0.37, p = 0.009) und Tumorstadium (p = 0,0003). Abschließend BBN erzeugt heterogenen Tumoren, die ideal sind für die Bewertung von Immuntherapien und MRT können schnell und zuverlässig beurteilen Tumorlast vor der Randomisierung, experimentelle Therapiearmen.

Einleitung

Blasenkrebs ist die fünft häufigste Krebsart insgesamt, verantwortlich für rund 80.000 Neuerkrankungen und 16.000 Todesfälle in den Vereinigten Staaten im Jahr 2017¹. Nach ca. 30 Jahren ohne bedeutende Fortschritte bei der systemischen Behandlung von Blase Krebs²haben den letzten Anti-PD-1 und Anti-PD-L1 Checkpoint Inhibitor Studien spannende und gelegentlich langlebige Reaktionen bei Patienten mit fortgeschrittenen gezeigt. important Karzinom^3,4,5. Allerdings nur etwa 20 % der Patienten zeigen eine objektive Antwort auf diese Behandlungen, und weitere Studien sind erforderlich, um den effektiven Einsatz der Immuntherapie bei Patienten mit Blasenkrebs zu erweitern.

Murine Blase Krebs Modelle sind wichtige Werkzeuge in präklinische Evaluierung von neuen Behandlungsmethoden^6,7. Um für die Größe des Tumors zu kontrollieren wenn Mäuse auf unterschiedliche Behandlungen randomizing, muss Tumorlast bewertet und kontrolliert zwischen den Behandlungsgruppen. Frühere Studien haben Ultraschall oder Biolumineszenz auszuwertende orthotopen Zelle zeilenbasiert Blase Krebs Modelle^8,9,10,11verwendet. Beide Techniken präsentieren jedoch einige Nachteile. Ultraschallmessungen beeinflussbar durch Fähigkeiten des Bedieners und dreidimensionale Funktionen und hoher räumlicher Auflösung fehlen. Biolumineszenz-Methoden können nur semi-quantitativen Bewertung der Tumorzellen und erlauben nicht zur Visualisierung der Blase Anatomie und Morphologie. Darüber hinaus kann Biolumineszenz nur mit Zellmodelle zeilenbasiert verwendet werden die Biolumineszenz Gene in haarlose Mäuse oder Mäuse mit weißen Kitteln zum Ausdruck bringen.

Magnetresonanz-Bildgebung (MRI), auf der anderen Seite bietet einzigartige Flexibilität bei der Akquisition von hochauflösenden anatomischen Bildern, präsentiert ein breites Spektrum von Gewebe-Kontrast, der genaue Visualisierung ermöglicht und quantitative Bewertung der Tumorlast ohne die Notwendigkeit, biolumineszente Eigenschaften auszudrücken. MRT-Bilder sind mit den entsprechenden Analyse-Pipelines leichter reproduzierbar und 3-d Visualisierung der Blase garantiert. Die größten Einschränkungen der MRT sind so lang wie die benötigte Zeit für eine Prüfung und damit verbundenen hohen Kosten, die hohen Durchsatz Assays zu begrenzen. Mehrere Studien haben jedoch gezeigt, dass Herr Sequenzen diagnostische Bilder in hoher Qualität anbieten können, die verwendet werden können, um effektiv erkennen und überwachen Zelle zeilenbasiert Blase Tumoren; So können sie für Hochdurchsatz-Analyse-^9,-¹²verwendet werden.

Hier beschreiben wir eine nicht-invasive MR-basierte Methode, um zuverlässig und effizient Karzinogen induzierten Blase-Tumoren in Mäusen zu charakterisieren. Um dies zu erreichen, verwenden wir eine schnelle Bildgebung mit Steady-State Präzession Herr Technik (wahre FISP), die kurze Scan Sitzungen gleichzeitig hohe Qualität und hohe räumliche Auflösung (~ 100 Mikrometer) bietet garantiert für die Detektion und Messung der Blase Tumoren¹³. Darüber hinaus bestätigen die Richtigkeit dieser nicht-invasiven MRI-Assay, beschreiben wir die Korrelation zwischen MRI-abgeleitete Parameter und ex Vivo Blase Gewicht sowie pathologisch bestätigt Tumorstadium.

Protokoll

Alle hier beschriebene Methoden wurden von den institutionellen Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) der Northwestern University genehmigt.

1. Induktion von Tumoren mit BBN

1. Erhalten Sie männliche C57/BL6 Mäuse, jeweils mindestens 6 Wochen alt.
   Hinweis: Männliche Mäuse entwickeln Blasenkrebs schnell und konsequent als weibliche Mäuse^14,15.
2. Hinzu kommt N-nitrosobutyl(4-hydroxybutyl) Amin (BBN) in einer Dosis von 0,05 % des Trinkwassers. In einer undurchsichtigen Behälter bewahren Sie auf und bieten Sie es Ad Libitum als Trinkwasser auf Mäuse¹⁶.
   Hinweis: Speichern von BBN-Lösung in einem klaren Behälter wird Karzinogen¹⁷beeinträchtigt.
3. Wasserwechsel 0,05 % BBN zweimal pro Woche.
4. Inspektion für Zeichen der Bedrängnisses verbunden mit Blase Tumoren einschließlich Hämaturie, feste Blase und Massen, um die Tiere zu überwachen. Überprüfen Sie die Mäuse zweimal pro Woche oder in Übereinstimmung mit örtlichen IACUC Richtlinien.
5. Erwarten, dass die Tumoren zwischen 16 und 24 Wochen nach der Exposition¹⁸zu entwickeln.

(2) MRI-setup

1. Führen Sie eine subkutane Injektion von sterilen Kochsalzlösung (0,1-0,2 mL mit einer 25-27 G Nadel und 1 mL Spritze) 10 min vor der MRT zur Füllung der Blase zu erleichtern.
2. Jede Maus mit einem Gasgemisch aus 100 % O₂ und Isofluran (2 %-4 % als notwendig) zu betäuben. Stellen Sie sicher eine angemessene Ebene der Narkose durch die Prüfung des Rücknahme-Reflexes (Zehe Prise) bevor Sie fortfahren. Sterile Augensalbe auf das Tier anwenden.
3. Übertragen Sie die Maus an den bildgebenden Halter, ausgestattet mit einem Nosecone für die Lieferung von inhalativen Isofluran (0,5 – 3 %).
4. Überwachen Sie Körpertemperatur und Atmung mittels rektale Temperatursonde an den physiologischen Aufnahme-Computer angeschlossen.
   Hinweis: Die normale Körpertemperatur (36 – 37 ° C) bleibt mit der umlaufenden Warmwasserkreislauf, gebaut in den tierischen Herr Halter. Temperatur ist durch eine rektale Sensor gemessen und auf die physiologischen Überwachungscomputer mit speziellen physiologischen monitoring-Software aufgezeichnet. Das gleiche System wird verwendet, um die Atmung und Elektrokardiogramm Signale gemessen durch einen pneumatischen Kissen unter den Brustkorb und über 3-Kanal-EKG-Elektroden platziert. Die Atmung Signal dient auch zur Auslösung MRT Akquisition und Verringerung der Artefakte, die Atmung Bewegung zugeordnet.

(3) MRI Bildaufnahme

1. Nutzen Sie eine Quadratur Körper Spule für Erregung.
2. Legen Sie eine 4-Kanal-Empfängerspule auf den Unterleib der Maus wird gescannt, um optimierte Erkennung von Signalen aus der Region von Interesse.
3. Initiieren Sie automatische Anpassungen durch die integrierte Software zur Abbilderstellung einen dreiachsigen Satz des ganzen Maus Körperbildern zu erwerben. Aus dieser Referenz Bilder eingestellt, die Region von Interesse (in diesem Fall der Blase-Region) zu identifizieren.
4. Drei Sätze von orthogonalen geschnitten Bilder entlang der axialen, koronalen und sagittalen Ebenen mit radiologischen Bezugsrahmen zu erwerben.
5. Nutzen die wahre FISP imaging-Sequenz (als eines der Merkmale in die integrierte imaging-Software enthalten) mit den folgenden Parametern Herr: TR = 900 msec, TE = 2 ms, FA = 70, 14 Durchschnittswerte.
   Hinweis: Dieser Satz von Parametern ermöglicht schnelle Bildgebung mit hoher diagnostischer Qualität, einschließlich T1/T2-Gewichtung in < 10 min per Mausklick.
6. Räumliche Auflösung und der Slice Dicke richtet sich nach geometrischen Parameter durch den Benutzer über die grafische Oberfläche der integrierten imaging Plattform ausgewählt. Dies ergibt eine Reihe von Scheiben über die ganze Blase von 0,5 mm Dicke mit einer Auflösung in der Ebene von 0,148 mm.

4. Herr Bildanalyse

1. Identifizieren Sie den Satz von 0,5 mm dicke Scheiben und in der Ebene Auflösung von 0,148 mm deckt die ganze Blase.
2. In die medizinische Bildanalyse-Software wählen Sie den Ordner mit den entsprechenden Bildern in ANALYZE-Format exportieren.
3. Wählen Sie "repräsentative axiale Ansicht" in der Mitte der Blase für Quantitative Analyse durch Scrollen durch die generierten Bilder und Identifizierung eine Scheibe in der Mitte der Blase, die Visualisierung der Blasenwand und Lumen ermöglicht.
   Hinweis: Die Mitte Scheibe sollte der Auserwählte mit dem größten Durchmesser.
4. Sorgfältig die Region of Interest (ROI) abzugrenzen, indem man manuell die Grenzen um den äußeren Rand der Blase (BLA_heraus) und um die inneren Lumen (BLA_in) der Blase (siehe schematische und repräsentative Zahlen in Abbildung 2) in der ausgewählten repräsentativen axiale Ansicht.
5. Subtrahieren Sie die innere Lumen von der Außenkante, die Fläche der Blasenwand zu berechnen.
   BLA_Wand = BLA_heraus - BLA_in
   Hinweis: Die Fläche der Kontrolle Harnblase mit keinen Tumor wird voraussichtlich weniger als mit einem Tumor der Harnblase.

(5) Sterbehilfe und Präparation der Blase

1. Nach 20 Wochen der BBN Exposition einschläfern Sie die Mäuse mit Standardarbeitsanweisungen nach lokalen IACUC Richtlinien.
2. Reinigen Sie den Bereich der Schnitt mit 70 % Ethanol, dann fassen und heben der Bauchdecke Haut mit einer Pinzette.
3. Machen Sie einen Mittellinie Schnitt von der Schambeinfuge, Xiphoid Prozeß.
4. Scharf Einschneiden der Bauchhöhle mit einer Pinzette anfassen und mit einer Schere einritzen.
5. Die Blase, befindet sich in der Mittellinie Unterbauch zu identifizieren.
6. Identifizieren Sie und schneiden Sie die mediane Nabelschnur Bänder verbinden die Kuppel der Blase mit dem Nabel und Bauchwand.
7. Fassen Sie die Kuppel der Blase mit Zange Gegenzugstab und sezieren die Blase vom umgebenden Strukturen, einschließlich der Samenbläschen, Rektum und Fett.
8. Identifizieren Sie die Harnleiter in die Blase und schneiden mit der Schere in der Nähe der Blase.
9. Heben die Blase kopfwärts, schneiden Sie die Harnröhre mit einer Schere und entfernen Sie die Blase.
10. Wiegen Sie die Blase sofort nach Spülen mit PBS.

(6) histologische Untersuchung der Blase Gewebe

1. Fixieren Sie das Gewebe der Blase, in 10 % neutral gepuffertem Formalin für 36-48 h bei Raumtemperatur (RT).
2. Einbetten des Gewebes in Paraffin-Blöcke, schneiden Sie die Folien für die anschließende Untersuchung und färben die Folien mit Hämatoxylin und Eosin für mikroskopische Prüfung wie bisher^19,20beschrieben.
3. Führen Sie eine mikroskopische Untersuchung der Maus Blase bei niedrigen (2.5 x und 10 X) und hoch (20 X und 40 X) Vergrößerungen, Prüfung für makroskopischen Läsionen, Hyperplasie, Karzinom in Situ, Papillome, papillären Tumoren und invasive Tumoren^{19 , 21}.

Ergebnisse

Mit dem beschriebenen Protokoll (Abbildung 1), wurden in C57/B6 männliche Mäuse Blase Tumoren induziert. MRI wurde auf 16 Wochen durchgeführt, und Mäuse wurden in der 20. Woche eingeschläfert. Ex-Vivo Blase Gewichte (BW) für jede Maus wurden aufgezeichnet. Dias wurden gefärbt mit Hämatoxylin und Eosin, und alle Histologie Folien für Tumorstadium überprüft wurden.

Um die Tumorlast...

Diskussion

Genaue Darstellung der Tumormodellen ist für geeignete vor Euthanasie Inszenierung und tierischen Randomisierung vor Einleitung einer experimentellen Behandlung notwendig. Bei der hier vorgestellten Verfahren zeigen wir Methodik (1) Blase Tumoren mit dem BBN Karzinogen und (2) Schichten Blase Tumorlast durch den Einsatz von Mr An Herrn abgeleitet Bereich Messung (BLA_Wand) korreliert deutlich mit Ex-Vivo Blase Gewicht und pathologischen Tumorstadium zugeordnet ist.

Durch ei...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57BL/6 mice	The Jackson Laboratory	664	Mice
N-butyl-N-(4-hydroxybutyl)nitrosamine carcinogen (BBN)	TCI American	B0938	Carcinogen
0.9% normal saline	Hospira, Inc	NDC 0409-488-02
Isoflurane	Piramal HealthCare	60307-120-25	Anesthetic
7Tesla ClinScan MRI	Bruker	NA	Dedicated Small Animal Imaging MRI
Syngo	Siemens	NA	MR Integrated Imaging Software
Model 1030 Monitoring & Gating System	Small Animal Instruments, Inc. (SAII)	NA	Small animal physiologic monitoring
Formalin, Neutral Buffered, 10%	Sigma	HT501128	Fixative
Eosin Y	Fisher Scientific	NC1093844	Histologic staining agent
Hematoxylin	Fisher Scientific	23-245651	Histologic staining agent
Jim7	Xinapse Systems	NA	Medical image analysis software
GraphPad Prism v7.04	Graphpad	NA	Graphing software
R v3.4.2	The R Project for Statistical Computing	NA	Statistical software
R package pROC v1.10.0.	The R Project for Statistical Computing	NA	ROC analysis