Evaluación de la proyección de imagen de resonancia magnética de los tumores vesicales murina inducida por carcinógenos

Resumen

Los tumores de vejiga murino son inducidos con el carcinógeno nitrosaminas de N-butyl-N-(4-hydroxybutyl) (BBN). Generación de tumor de vejiga es heterogénea; por lo tanto, es necesaria una evaluación precisa de la carga tumoral antes de la aleatorización al tratamiento experimental. Aquí presentamos un protocolo MRI rápido y confiable para evaluar el escenario y tamaño del tumor.

Resumen

Modelos de tumor vesical murino son críticos para la evaluación de nuevas opciones terapéuticas. Los tumores de vejiga inducidos con el carcinógeno nitrosaminas (BBN) de N-butyl-N-(4-hydroxybutyl) son ventajosos sobre los modelos basados en la línea celular porque replican muy de cerca los perfiles genómicos de tumores humanos, y, a diferencia de modelos celulares y xenoinjertos, proporcionan un buena oportunidad para el estudio de las inmunoterapias. Sin embargo, la generación del tumor de vejiga es heterogénea; por lo tanto, es necesaria una evaluación precisa de la carga tumoral antes de la aleatorización al tratamiento experimental. Se describe aquí es un modelo de ratón BBN y protocolo para evaluar la vejiga cáncer tumor carga en vivo mediante una secuencia rápida y fiable de resonancia magnética (Sr.) (true FISP). Este método es simple y confiable porque, a diferencia del ultrasonido, Señor es independiente del operador y permite el tratamiento de la imagen después de la adquisición directa y la revisión. Utilizando las imágenes axiales de la vejiga, análisis de regiones de interés a lo largo de la pared vesical y tumor permiten el cálculo de área de pared y el tumor de vejiga. Esta medida se correlaciona con ex vivo el peso de la vejiga (r_s= 0,37, p = 0,009) y etapa del tumor (p = 0.0003). En conclusión, BBN genera tumores heterogéneos que son ideales para la evaluación de las inmunoterapias, y MRI puede rápida y confiablemente evaluar carga tumoral antes de la aleatorización al tratamiento experimental.

Introducción

Cáncer de vejiga es el cáncer más común en quinto lugar general, responsable de aproximadamente 80.000 nuevos casos y 16.000 muertes en los Estados Unidos en 2017¹. Luego de 30 años sin avances significativos en el tratamiento sistémico del cáncer de vejiga², reciente control anti-PD-1 y anti-PD-L1 inhibidor ensayos han demostrado respuestas interesantes y durables de vez en cuando en pacientes con avanzado uroteliales carcinoma^3,4,5. Sin embargo, sólo aproximadamente el 20% de los pacientes muestran una respuesta objetiva a estos tratamientos, y se necesitan más estudios para ampliar el uso efectivo de la inmunoterapia en pacientes con cáncer de vejiga.

Modelos de cáncer vesical murino son críticos en la evaluación preclínica de nuevos tratamientos^6,7. Para controlar el tamaño del tumor cuando se asignaron al azar a ratones con diferentes tratamientos, carga tumoral debe ser evaluado y controlado entre grupos de tratamiento. Estudios previos han usado ultrasonido o bioluminiscencia para evaluar orthotopic celular basada en línea de vejiga cáncer modelos^8,9,10,11. Sin embargo, ambas técnicas presentan varias desventajas. Las medidas de ultrasonido pueden ser influenciadas por las habilidades del operador y carecen de características tridimensionales y alta resolución espacial. Bioluminescence métodos sólo pueden proporcionar una evaluación semi-cuantitativa de las células tumorales y no permiten la visualización de la morfología y anatomía de la vejiga. Además, bioluminiscencia puede ser utilizado con modelos basados en la línea de celulares, que expresan genes bioluminiscentes en ratones sin pelo o ratones con batas blancas.

La proyección de imagen de resonancia magnética (MRI), por el contrario, ofrece una flexibilidad única en la adquisición de imágenes de alta resolución anatómicas, exhibiendo una amplia gama de contraste de tejido que permite la visualización precisa y evaluación cuantitativa de la carga tumoral sin la necesidad de expresar propiedades bioluminiscentes. Imágenes son más fácilmente reproducibles con las tuberías de análisis apropiado y garantizan la visualización 3-d de la vejiga. Las mayores limitaciones de la RMN son la longitud de tiempo necesario para un examen y asociados altos costos que limitan el análisis de alto rendimiento. Sin embargo, varios estudios han demostrado que el Señor secuencias pueden proporcionar imágenes diagnósticas de alta calidad que pueden utilizarse para detectar con eficacia y seguimiento de tumores de vejiga basado en la línea de la célula; así, se puede utilizar para análisis de alto rendimiento^9,12.

Aquí, describimos un método no invasivo basado en el Señor para confiablemente y eficientemente caracterizar los tumores de vejiga inducida por carcinógenos en ratones. Para lograr esto, utilizamos una proyección de imagen rápida con estado estacionario precesión Señor técnica (true FISP), garantizando sesiones breves análisis sin dejar de ofrecer alta calidad y alta resolución espacial (~ 100 micras) para la detección y medición de la vejiga tumores¹³. Además, para confirmar la exactitud de este análisis no invasivo de MRI, se describe la correlación entre parámetros derivados del MRI y ex vivo el peso de la vejiga así como estadio tumoral patológico confirmado.

Protocolo

Todos los métodos aquí descritos han sido aprobados por el institucional Animal Care y el Comité uso (IACUC) de la Universidad Northwestern.

1. inducción de tumores con BBN

1. Obtener ratones C57/BL6 machos, cada uno por lo menos 6 semanas.
   Nota: Ratones machos desarrollan cáncer de vejiga más rápida y consistentemente de ratones femeninos^14,15.
2. Añadir N-nitrosobutyl(4-hydroxybutyl) amina (BBN) en una dosis de 0.05% a agua potable. Guardarlo en un recipiente opaco y se dan ad libitum como agua potable a ratones¹⁶.
   Nota: Almacenar la solución BBN en un contenedor transparente se degradará el carcinógeno¹⁷.
3. Cambie el agua BBN 0,05% dos veces por semana.
4. Seguimiento de los animales mediante la inspección de signos de distrés asociado a tumores de la vejiga incluyen hematuria, firme vejiga y masas. Inspeccione los ratones dos veces por semana o de acuerdo con las pautas locales de IACUC.
5. Esperar que los tumores entre 16 y 24 semanas de exposición¹⁸.

2. configuración MRI

1. Realizar una inyección subcutánea de solución salina estéril (0,1 – 0,2 mL usando una jeringa de aguja y 1 mL de 25-27 G) 10 minutos antes de la resonancia magnética para facilitar el llenado de la vejiga.
2. Anestesiar cada ratón con una mezcla de gas de 100% O₂ y el isoflurane (2%-4% según sea necesario). Verificar un adecuado plano de anestesia por el reflejo de retirada (pellizco del dedo del pie) antes de continuar la prueba. Aplique ungüento oftálmico estéril a los animales.
3. Transferir el ratón al imagen titular equipado con una ojiva para la administración de isoflurano inhalado (0,5% – 3%).
4. Controlar la temperatura corporal y respiración utilizando una sonda rectal de la temperatura conectada a la computadora de registro fisiológico.
   Nota: La temperatura Normal del cuerpo (36-37 ° C) se mantiene mediante el recirculación circuito de agua caliente incorporado el titular Señor animal. Temperatura es medida a través de un sensor rectal y registrada en el equipo de monitoreo fisiológico con dedicado software de monitoreo fisiológico. El mismo sistema se utiliza para registrar las señales de respiración y electrocardiograma mide a través de una almohada neumática bajo la caja torácica y a través de electrodos de electrocardiograma 3 derivaciones. La señal de respiración también se utiliza para accionar adquisición de MRI y la reducción de artefactos asociados con el movimiento de la respiración.

3. adquisición de imágenes de MRI

1. Utilizar una bobina de cuadratura del cuerpo para la excitación.
2. Coloque una bobina del receptor de 4 canales en la parte inferior del abdomen del ratón está escaneando para habilitar la detección optimizada de las señales de la región de interés.
3. Iniciar ajustes automáticos a través del software de imagen integrado para adquirir un sistema triaxial de imágenes del cuerpo entero del ratón. Sistema de imágenes de esta referencia, identificar la región de interés (en este caso, la región de la vejiga).
4. Adquirir tres conjuntos de imágenes ortogonales en rodajas a lo largo de los planos axiales, coronales y sagitales, utilizando marcos de referencia radiológicos.
5. Utilizar el true FISP (incluida como una de las características en el software integrado de la proyección de imagen) de la secuencia de imágenes con los siguientes parámetros de Señor: TR = 900 mseg, TE = 2 ms, FA = 70, promedios de 14.
   Nota: Este conjunto de parámetros permite la proyección de imagen rápida con alta calidad diagnóstico, incluyendo la ponderación T1/T2 en < 10 min por ratón.
6. Grosor de rebanada y resolución espacial está determinada por parámetros geométricos seleccionados por el usuario a través de la interfaz gráfica de la plataforma de proyección de imagen integradora. Esto resulta en una serie de sectores a través de la vejiga entera de 0,5 mm de espesor con una resolución en el plano de 0.148 mm.

4. D. Análisis de imagen

1. Identificar el conjunto de láminas de 0,5 mm de espesor y resolución en el plano de 0.148 mm que cubre la vejiga entera.
2. Exportar a software de análisis de imagen médico seleccionando la carpeta con las imágenes correspondientes en el formato de análisis.
3. Seleccione "vista axial representativo" en el centro de la vejiga para el análisis cuantitativo por desplazarse a través de las imágenes generadas y la identificación de un segmento en el punto medio de la vejiga, que permite la visualización de la pared de la vejiga y el lumen.
   Nota: El segmento del centro debe ser el elegido con el diámetro más grande.
4. Delinear con cuidado la región de interés (ROI) manualmente trazando los límites alrededor del borde externo de la vejiga (BLA_{hacia fuera}) y alrededor de la luz interna (BLA_en) de la vejiga (vea las figuras esquemáticas y representativas en la figura 2) en la vista axial representativa seleccionada.
5. Restar la luz interna del borde exterior para calcular la superficie de la pared de la vejiga.
   BLA_pared = BLA_{hacia fuera} - BLA_en
   Nota: Se espera que la superficie de una vejiga de control sin tumor sea menor que con un tumor de vejiga.

5. eutanasia y disección de la vejiga

1. Después de 20 semanas de la exposición BBN, eutanasia los ratones utilizando procedimientos normalizados de acuerdo con las pautas locales de IACUC.
2. Limpiar la zona de incisión con etanol al 70%, entonces Sujete y levante la piel de la pared abdominal con el fórceps.
3. Hacer una incisión de línea media de la sínfisis púbica para el proceso del xiphoid.
4. Bruscamente haga una incisión en la cavidad peritoneal sujetando con pinzas y incisión con tijeras.
5. Identificar la vejiga, que se encuentra en el abdomen inferior de línea media.
6. Identificar y cortar el ligamento umbilical mediano conectar la cúpula de la vejiga al ombligo y la pared abdominal.
7. Agarre la cúpula de la vejiga con pinzas countertraction y disecar la vejiga de las estructuras, incluyendo las vesículas seminales, recto y grasa circundantes.
8. Identificar los uréteres en la vejiga y corte con unas tijeras cerca de la vejiga.
9. La vejiga de elevación cefálica, cortó la uretra con unas tijeras y quitar la vejiga.
10. Inmediatamente pesar la vejiga después de lavado con PBS.

6. histologic examinación del tejido de la vejiga

1. Fijar el tejido de la vejiga en 10% formalina tamponada neutra durante 36-48 h a temperatura ambiente (RT).
2. Incrustar el tejido en bloques de parafina, cortar las diapositivas para el examen posterior y las diapositivas con hematoxilina y eosina para la examinación microscópica de la mancha como se describió anteriormente^19,20.
3. Realizar un examen microscópico de la vejiga de ratón en baja (2.5 x y 10 x) y aumentos de alto (20 x y 40 x), examen de las lesiones macroscópicas, hiperplasia, carcinoma en situ, papilomas, tumores papilares y neoplasias invasoras^{19 , 21}.

Resultados

Utilizando el protocolo descrito (figura 1), los tumores de vejiga fueron inducidos en ratones machos C57/B6. MRI fue realizado en 16 semanas, y los ratones fueron sacrificados a las 20 semanas. Se registraron ex vivo vejiga pesos (BW) para cada ratón. Diapositivas se tiñeron con hematoxilina y eosina, todas las diapositivas de histología se revisaron y etapa del tumor.

Para analizar la ...

Discusión

Precisa proyección de imagen de modelos de tumores es necesario para la adecuada estadificación de la eutanasia y aleatorización animal antes de la iniciación del tratamiento experimental. Utilizando el procedimiento presentado aquí, demostramos metodología para (1) generar tumores de la vejiga usando el carcinógeno BBN y (2) estratificar la carga tumoral de vejiga mediante el uso de derivados de MR. Señor un área medida (BLA_pared) se correlaciona significativamente con ex vivo el peso de la ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57BL/6 mice	The Jackson Laboratory	664	Mice
N-butyl-N-(4-hydroxybutyl)nitrosamine carcinogen (BBN)	TCI American	B0938	Carcinogen
0.9% normal saline	Hospira, Inc	NDC 0409-488-02
Isoflurane	Piramal HealthCare	60307-120-25	Anesthetic
7Tesla ClinScan MRI	Bruker	NA	Dedicated Small Animal Imaging MRI
Syngo	Siemens	NA	MR Integrated Imaging Software
Model 1030 Monitoring & Gating System	Small Animal Instruments, Inc. (SAII)	NA	Small animal physiologic monitoring
Formalin, Neutral Buffered, 10%	Sigma	HT501128	Fixative
Eosin Y	Fisher Scientific	NC1093844	Histologic staining agent
Hematoxylin	Fisher Scientific	23-245651	Histologic staining agent
Jim7	Xinapse Systems	NA	Medical image analysis software
GraphPad Prism v7.04	Graphpad	NA	Graphing software
R v3.4.2	The R Project for Statistical Computing	NA	Statistical software
R package pROC v1.10.0.	The R Project for Statistical Computing	NA	ROC analysis