La formazione immagine a risonanza magnetica valutazione dei tumori della vescica murino indotto da agente

Riepilogo

Tumori della vescica murino sono indotti con l'agente cancerogeno nitrosamina di N-butyl-N-(4-hydroxybutyl) (BBN). Generazione del tumore della vescica è eterogenea; Pertanto, una valutazione accurata del carico del tumore è necessario prima di randomizzazione al trattamento sperimentale. Qui presentiamo un protocollo di MRI veloce e affidabile per valutare la fase e dimensioni del tumore.

Abstract

Modelli di tumore della vescica murino sono fondamentali per la valutazione di nuove opzioni terapeutiche. Tumori della vescica indotti con l'agente cancerogeno nitrosamina (BBN) di N-butyl-N-(4-hydroxybutyl) sono vantaggiosi rispetto ai modelli basati su linee cellulari perché essi strettamente replicare i profili genomici dei tumori umani, e, a differenza di modelli cellulari e gli xenotrapianti, forniscono un buona occasione per lo studio delle immunoterapie. Tuttavia, la generazione del tumore della vescica è eterogenea; Pertanto, una valutazione accurata del carico del tumore è necessario prima di randomizzazione al trattamento sperimentale. Descritto qui è un modello murino BBN e protocollo per valutare vescica cancro tumore onere in vivo utilizzando una sequenza veloce e affidabile a risonanza magnetica (MR) (true FISP). Questo metodo è semplice e affidabile perché, a differenza di ultrasuono, signor è indipendente dall'operatore e consente l'elaborazione semplice post-acquisizione immagini e recensione. Usando immagini assiali della vescica, l'analisi delle regioni di interesse lungo la parete della vescica e del tumore permette il calcolo della superficie di parete e del tumore della vescica. Questa misurazione correla con ex vivo peso della vescica (r_s= 0,37, p = 0,009) e Stadio del tumore (p = 0,0003). In conclusione, BBN genera tumori eterogenei che sono ideali per la valutazione delle immunoterapie e MRI può rapidamente e valutare in modo affidabile il carico del tumore prima della randomizzazione a bracci di trattamento sperimentale.

Introduzione

Cancro alla vescica è il quinto tumore più comune nel complesso, responsabile di circa 80.000 nuovi casi e 16.000 morti negli Stati Uniti nel 2017¹. Dopo circa 30 anni senza progressi significativi nel trattamento sistemico della vescica cancro², prove recenti di inibitore anti-PD-1 e anti-PD-L1 checkpoint hanno dimostrato risposte emozionante e durevole occasionalmente in pazienti con avanzato urothelial carcinoma^3,4,5. Tuttavia, solo circa il 20% dei pazienti mostrano una risposta obiettiva a questi trattamenti, e ulteriori studi sono necessari per espandere l'uso efficace di immunoterapia in pazienti con cancro alla vescica.

Modelli del cancro della vescica murino sono strumenti critici nella valutazione preclinica di nuovi trattamenti^6,7. Al fine di controllare per dimensioni del tumore quando randomizing topi ai diversi trattamenti, carico del tumore deve essere valutato e controllato tra gruppi di trattamento. Gli studi precedenti hanno usato ultrasuono o bioluminescenza per valutare orthotopic cella basata su riga vescica cancro modelli^8,9,10,11. Tuttavia, entrambe le tecniche presentano diversi svantaggi. Misurazioni agli ultrasuoni possono essere influenzate dalla abilità dell'operatore e mancano di caratteristiche tridimensionali e ad alta risoluzione spaziale. Metodi di bioluminescenza possono fornire solo la valutazione semi-quantitativa delle cellule del tumore e non consentono per la visualizzazione della vescica anatomia e morfologia. Inoltre, bioluminescenza può essere utilizzato solo con modelli basati su linee cellulari, che esprimono geni bioluminescente in topi glabri o topi con camici bianchi.

La formazione immagine a risonanza magnetica (MRI), d'altra parte, offre flessibilità unica nell'acquisizione di immagini ad alta risoluzione anatomiche, che espone una vasta gamma di contrasto del tessuto che consente una visualizzazione accurata e valutazione quantitativa del carico del tumore senza il bisogno di esprimere proprietà bioluminescenti. Immagini di MR sono più facilmente riproducibili con le opportune analisi condotte e garantite visualizzazione 3-d della vescica. Le più grandi limitazioni di MRI sono la lunghezza del tempo necessario per un esame e associati costi elevati che limitano l'elevato throughput saggi. Tuttavia, parecchi studi hanno indicato che le sequenze di RM possono fornire immagini diagnostiche di alta qualità che possono essere utilizzate per rilevare efficacemente e monitorare i tumori delle cellule della vescica basata su riga; così, essi possono essere utilizzati per alta velocità effettiva analisi^9,12.

Qui, descriviamo un metodo non invasivo basato su MR per attendibilmente ed efficientemente caratterizzano i tumori della vescica indotta da agente cancerogeno nei topi. A tale scopo, utilizziamo un imaging veloce con tecnica di MR di precessione di stato stazionario (true FISP), che garantisce brevi sessioni di scansione pur fornendo alta qualità e alta risoluzione spaziale (~ 100 micron) per la rilevazione e la misura della vescica i tumori¹³. Inoltre, per confermare l'accuratezza di questo test non invasivo di MRI, descriviamo la correlazione tra parametri MRI-derivato ed ex vivo della vescica peso così come la fase del tumore patologico confermato.

Protocollo

Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dal istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) della Northwestern University.

1. induzione di tumori con BBN

1. Ottenere topi C57/BL6 maschii, ogni almeno 6 settimane di età.
   Nota: I topi maschii di sviluppano cancro alla vescica in modo più rapido e coerente di topi femmina^14,15.
2. Aggiungi N-nitrosobutyl(4-hydroxybutyl) ammina (BBN) ad una dose di 0.05% all'acqua potabile. Conservarla in un contenitore opaco e fornirlo ad libitum come acqua potabile ai topi¹⁶.
   Nota: Conservare la soluzione BBN in un contenitore trasparente si degrada il cancerogeno¹⁷.
3. Cambiare l'acqua BBN 0.05% due volte alla settimana.
4. Monitorare gli animali tramite il controllo per i segni di disagio associato con i tumori della vescica compreso ematuria, costante della vescica e masse. Ispezionare i topi due volte alla settimana o secondo le linee guida locali IACUC.
5. Si aspettano i tumori di sviluppare tra 16 e 24 settimane di esposizione¹⁸.

2. installazione MRI

1. Eseguire un'iniezione sottocutanea di soluzione fisiologica sterile (0,1 – 0,2 mL utilizzando una siringa di ago e 1ml di 25 – 27 G) 10 min prima del MRI per facilitare il riempimento della vescica.
2. Anestetizzare ogni mouse con una miscela di gas di 100% O₂ e isoflurano (2%-4% se necessario). Il riflesso di ritiro (pizzico di punta) prima di procedere verificare un adeguato piano di anestesia. Applicare unguento oculare sterile per l'animale.
3. Trasferisce il mouse al titolare della imaging dotato di una punta conica per la consegna di inalazione isoflurane (0,5% – 3%).
4. Monitorare la temperatura corporea e respirazione usando una sonda di temperatura rettale connessa al computer di registrazione fisiologica.
   Nota: La temperatura corporea normale (36 – 37 ° C) viene mantenuta utilizzando il circuito ricircolo di acqua calda integrato nell'animale attacco MR. Temperatura è misurata tramite un sensore rettale e registrata sul computer di monitoraggio fisiologico tramite apposito software di monitoraggio fisiologico. Lo stesso sistema è utilizzato per registrare i segnali di respirazione ed elettrocardiogramma misurati attraverso un cuscino pneumatico posizionato sotto la gabbia toracica e tramite elettrodi 3 derivazioni dell'elettrocardiogramma. Il segnale di respirazione è anche utilizzato per trigger acquisizione di MRI e riducendo gli elementi associati a movimento di respirazione.

3. acquisizione di immagini MRI

1. Utilizzare una bobina del corpo di quadratura per l'eccitazione.
2. Posizionare una bobina ricevente 4 canali sull'addome inferiore del mouse sottoposto a scansione per abilitare il rilevamento ottimizzato dei segnali dalla regione di interesse.
3. Avviare regolazioni automatiche attraverso il software di imaging integrato di acquisire un tri-assiale set di immagini del corpo intero del mouse. Da questo insieme di riferimento delle immagini, è necessario identificare l'area di interesse (in questo caso, la regione della vescica).
4. Acquisire tre insiemi di immagini ortogonali affettato lungo i piani assiali, coronali e sagittali utilizzando radiologica fotogrammi di riferimento.
5. Utilizzare il vero FISP imaging sequenza (incluso come una delle caratteristiche del software di imaging integrato) con i seguenti parametri di MR: TR = 900 msec, TE = 2 ms, FA = 70, 14 medie.
   Nota: Questo set di parametri consente per rappresentazione rapida con alta qualità diagnostica, tra cui ponderazione T1/T2 in < 10 min per topo.
6. Spaziale ad alta risoluzione e fetta di spessore sono determinati dalla parametri geometrici selezionati dall'utente tramite l'interfaccia grafica della piattaforma imaging integrata. Ciò comporta una serie di fette attraverso l'intera vescica di 0,5 mm di spessore con una risoluzione in-aereo di 0,148 millimetri.

4. signor analisi dell'immagine

1. Identificare l'insieme delle fette dello spessore di 0,5 mm e risoluzione in piano di 0,148 mm che copre l'intera vescica.
2. Esportare il software di analisi di immagini mediche selezionando la cartella con le immagini corrispondenti in formato ANALYZE.
3. Selezionare "vista assiale rappresentanza" al centro della vescica per analisi quantitativa scorrendo le immagini generate e identificando una fetta al punto mediano della vescica, che permette per la visualizzazione della parete della vescica e del lume.
   Nota: La fetta di centro dovrebbe essere il prescelto con il diametro più grande.
4. Delineare con attenzione la regione di interesse (ROI) tracciando manualmente i confini intorno al bordo esterno della vescica (BLA_fuori) e dintorni il lume interno (BLA_in) della vescica (Vedi figure schematiche e rappresentante nella Figura 2) nella vista assiale rappresentativa selezionata.
5. Sottrarre il lume interno dal bordo esterno per calcolare l'area della superficie della parete della vescica.
   BLA_parete = BLA_fuori - BLA_in
   Nota: L'area della superficie di una vescica di controllo con nessun tumore dovrebbe essere inferiore a quello con un tumore della vescica.

5. l'eutanasia e la dissezione della vescica

1. Dopo 20 settimane di esposizione BBN, eutanasia i topi utilizzando procedure operative standard in conformità con le linee guida locali IACUC.
2. Pulire l'area dell'incisione con etanolo al 70%, poi afferrare e sollevare la pelle della parete addominale con il forcipe.
3. Fare un'incisione del midline dalla sinfisi pubica al processo xifoideo.
4. Acutamente incise la cavità peritoneale da afferrare con una pinza e incisione con le forbici.
5. Identificare la vescica, che si trova nell'addome inferiore del midline.
6. Identificare e tagliare il legamento ombelicale mediano che collega la cupola della vescica al umbilicus e parete addominale.
7. Afferrare la cupola della vescica con la pinzetta per fornire reggibacino e sezionare la vescica dalle strutture, tra cui le vescicole seminali, il retto ed il grasso circostanti.
8. Identificare gli ureteri entrando la vescica e tagliare con le forbici vicino la vescica.
9. Sollevamento cephalad la vescica, l'uretra di tagliare con le forbici e rimuovere la vescica.
10. Pesare immediatamente la vescica dopo risciacquare con PBS.

6. l'esame istologico del tessuto della vescica

1. Fissare il tessuto della vescica in 10% formalina neutra tamponata per 36 – 48 h a temperatura ambiente (TA).
2. Incorporare il tessuto in blocchi di paraffina, i vetrini per l'esame successivo di tagliare e colorare i vetrini con ematossilina ed eosina per esame al microscopio come descritto in precedenza^19,20.
3. Eseguire un esame al microscopio della vescica del mouse in basso (2.5 x e x 10) e alta (20x e 40x) ingrandimenti, esaminando per le lesioni macroscopiche, iperplasia, il carcinoma in situ, papillomi, tumori papillari e neoplasma dilaganti^{19 , 21}.

Risultati

Mediante il protocollo descritto (Figura 1), i tumori della vescica sono state indotte in di topo maschio C57/B6. MRI è stato effettuato a 16 settimane, e topi sono stati eutanasizzati a 20 settimane. Ex vivo pesi della vescica (BW) per ogni mouse sono stati registrati. Vetrini sono stati colorati con ematossilina ed eosina, e tutte le diapositive di istologia sono state esaminate per la fase del tumore.

Discussione

Accurato imaging di modelli del tumore è necessario appropriato pre-eutanasia staging e randomizzazione animale prima dell'inizio del trattamento sperimentale. Utilizzando la procedura presentata qui, dimostriamo metodologia per (1) generare tumori della vescica utilizzando l'agente cancerogeno BBN e (2) stratificare il carico del tumore della vescica attraverso l'uso di Mr MR An-derivato zona misura (BLA_parete) correla significativamente con ex vivo peso della vescica ed è associato con la fase pat...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57BL/6 mice	The Jackson Laboratory	664	Mice
N-butyl-N-(4-hydroxybutyl)nitrosamine carcinogen (BBN)	TCI American	B0938	Carcinogen
0.9% normal saline	Hospira, Inc	NDC 0409-488-02
Isoflurane	Piramal HealthCare	60307-120-25	Anesthetic
7Tesla ClinScan MRI	Bruker	NA	Dedicated Small Animal Imaging MRI
Syngo	Siemens	NA	MR Integrated Imaging Software
Model 1030 Monitoring & Gating System	Small Animal Instruments, Inc. (SAII)	NA	Small animal physiologic monitoring
Formalin, Neutral Buffered, 10%	Sigma	HT501128	Fixative
Eosin Y	Fisher Scientific	NC1093844	Histologic staining agent
Hematoxylin	Fisher Scientific	23-245651	Histologic staining agent
Jim7	Xinapse Systems	NA	Medical image analysis software
GraphPad Prism v7.04	Graphpad	NA	Graphing software
R v3.4.2	The R Project for Statistical Computing	NA	Statistical software
R package pROC v1.10.0.	The R Project for Statistical Computing	NA	ROC analysis