דימות תהודה מגנטית הערכה של גידולים המושרה מסרטן שלפוחית השתן מאתר

Summary

גידולים בשלפוחית השתן מאתר הם המושרה עם גורם מסרטן nitrosamine N-butyl-N-(4-hydroxybutyl) (BBN). שלפוחית השתן גידול דור הוא. הטרוגניות; לכן, הערכה מדויקת של נטל הגידול יש צורך לפני אקראיות לטיפול ניסיוני. כאן אנו מציגים פרוטוקול MRI מהיר, אמין כדי להעריך את גודל הגידול ועל הבמה.

Abstract

מודלים גידול שלפוחית השתן מאתר הם קריטיים עבור הערכת אפשרויות טיפוליות חדשות. גידולים בשלפוחית השתן המושרה עם מסרטן nitrosamine (BBN) N-butyl-N-(4-hydroxybutyl) הם יתרון על מודלים מבוססי-קו תא כי הם לשכפל מקרוב את הפרופילים גנומית של גידולים אנושיים, ו, בניגוד מודלים של התא, xenografts, הם מספקים הזדמנות טובה עבור המחקר של immunotherapies. עם זאת, דור גידול שלפוחית השתן היא הטרוגנית; לכן, הערכה מדויקת של נטל הגידול יש צורך לפני אקראיות לטיפול ניסיוני. המתוארים כאן הוא דגם העכבר BBN פרוטוקול כדי להעריך את שלפוחית השתן סרטן גידול הנטל ויוו באמצעות רצף תהודה מגנטית מהירה ואמינה (MR) (נכון FISP). שיטה זו היא פשוטה ואמינה כי, שלא כמו אולטרסאונד, מר אינו תלוי-המפעיל והיא מאפשרת עיבוד תמונה שלאחר רכישה ישירה של סקירה. באמצעות תמונות ההדמיה של שלפוחית השתן, ניתוח של אזורים מעניינים לאורך קיר השלפוחית, הגידול מאפשרים החישוב של קיר השלפוחית ואזור הגידול. מדידה זו עולה בקנה אחד עם ex-vivo שלפוחית השתן משקל (r_s= 0.37, p = 0.009), שלב הגידול (p = 0.0003). לסיכום, BBN גידולים הטרוגנית הינם אידיאליים עבור הערכה של immunotherapies ולאחר MRI יכול במהירות ולהעריך באופן אמין נטל הגידול לפני אקראיות לנשק טיפול ניסיוני.

Introduction

סרטן שלפוחית השתן הוא הסרטן השכיח ביותר החמישי. באופן כללי, אחראי כ 80,000 מקרים חדשים 16,000 מקרי מוות בארה ב 2017¹. לאחר 30 שנה ללא התקדמות משמעותית בטיפול מערכתי של סרטן שלפוחית השתן², האחרונות מחסום אנטי-PD-1 ו- anti-PD-L1 מעכב ניסויים הראו תגובות מרגשות ועמיד מדי פעם בחולים עם מתקדם urothelial קרצינומה של^3,4,5. עם זאת, רק כ-20% מהחולים להציג מענה אובייקטיבי טיפולים אלה, עוד יותר נדרשים מחקרים כדי להרחיב את השימוש היעיל חיסוני בחולים עם סרטן שלפוחית השתן.

מודלים סרטן שלפוחית השתן מאתר הם כלים קריטיים בהערכה פרה של טיפולים חדשניים^6,7. על מנת לשלוט על גודל הגידול בעת סידור אקראי של עכברים לטיפולים שונים, נטל הגידול חייב להיות מוערך ומבוקר בין קבוצות הטיפול. מחקרים קודמים השתמשו אולטראסאונד או ביולומינסנציה להעריך orthotopic תא מבוססי-קו שלפוחית השתן סרטן מודלים^8,9,10,11. עם זאת, בשתי הטכניקות להציג מספר חסרונות. מדידות אולטרסאונד שיכול להיות מושפע מיומנויות של המפעיל, חוסר רזולוציה מרחבית גבוהה ותכונות תלת מימדי. ביולומינסנציה שיטות רק יכול לספק הערכה כמותית למחצה של תאי הגידול, אינם מאפשרים ויזואליזציה של שלפוחית השתן אנטומיה, מורפולוגיה. יתר על כן, ניתן להשתמש ביולומינסנציה רק עם תא מבוססי-קו דגמים, המבטאים גנים מייצרים אור עכברים שיער או עכברים עם חלוק לבן.

דימות תהודה מגנטית (MRI), מצד שני, מציע גמישות ייחודית על רכישת תמונות אנטומיות ברזולוציה גבוהה, המציגות מגוון רחב של ניגודיות רקמות המאפשרת הדמיה מדויקת והערכה כמותית של נטל הגידול ללא צורך להביע את מאפייני ביולומנאסן. מר תמונות בקלות רבה יותר לשחזור עם הצינורות ניתוח המתאים, מובטח ויזואליזציה תלת-ממדי של שלפוחית השתן. המגבלות הגדולות של MRI הן משך הזמן הדרוש בדיקה, עלויות גבוהות המגבילות מבחני תפוקה גבוהה. עם זאת, מספר מחקרים הראו כי מר רצפים יכול לספק תמונות אבחון באיכות גבוהה יכול לשמש ביעילות לאתר ולפקח על גידולים בשלפוחית השתן מבוססי-קו תא; לפיכך, הם עשויים לשמש תפוקה גבוהה-ניתוח-^9,-¹².

כאן, אנו מתארים שיטה לא פולשנית המבוססת על מר לאפיין בצורה אמינה ויעילה גידולים המושרה מסרטן שלפוחית השתן בעכברים. כדי לעשות זאת, אנו משתמשים הדמיה מהיר עם מצב יציב נקיפה מר טכניקה (נכון FISP), אשר מבטיח הפעלות סריקה קצרה תוך מתן באיכות גבוהה, רזולוציה מרחבית גבוהה (~ 100 מיקרון) זיהוי, מדידה של שלפוחית השתן גידולים¹³. יתר על כן, כדי לאשר את הדיוק של זה וזמינותו MRI לא פולשנית, נתאר את המתאם בין פרמטרים נגזר MRI ו- ex-vivo שלפוחית השתן משקל, כמו גם שלב הגידול אישר באופן פתולוגי.

Protocol

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) של אוניברסיטת נורת'ווסטרן.

1. אינדוקציה של גידולים עם BBN

1. להשיג את זכר C57/BL6 עכברים, כל אחד לפחות בן 6 שבועות.
   הערה: עכברים זכרים לפתח סרטן שלפוחית השתן יותר במהירות ובאופן עקבי מאשר עכברים הנשי^14,15.
2. הוסף N-nitrosobutyl(4-hydroxybutyl) אמין (BBN) במינון של 0.05% למים. לשמור אותם בכלי אטום לאוויר, מספקים זה ad libitum כמו שתיית מים עכברים¹⁶.
   הערה: אחסון הפתרון BBN במיכל נקי תגרע מסרטן ה-¹⁷.
3. להחליף את המים BBN 0.05% פעמיים בשבוע.
4. נטר את החיות באמצעות בדיקת סימנים של מצוקה הקשורים גידולים בשלפוחית השתן כולל המטוריה, המשרד שלפוחית השתן וגושים. לבדוק את העכברים פעמיים בשבוע או לפי הנחיות IACUC מקומיים.
5. מצפה גידולים לפתח בין 16 ל 24 שבועות של חשיפה¹⁸.

2. MRI ההתקנה

1. לבצע זריקה תת עורית של מלח סטרילית (0.1-0.2 מ"ל באמצעות מזרק ומחט 1 מ"ל 25 – 27 גרם) 10 דקות לפני MRI כדי להקל על מילוי השלפוחית.
2. עזים ומתנגד לכל עכבר עם תערובת גז של 100% או₂ ואיזופלוריין (2%-4% לפי הצורך). ודא מטוס נאותה של הרדמה על-ידי בדיקת רפלקס הנסיגה (הבוהן צביטה) לפני שתמשיך. משחת עיניים סטרילי חלות על החיה.
3. להעביר את העכבר בעל הדמיה לבוש עם nosecone עבור מסירת בשאיפה איזופלוריין (0.5%-3%).
4. לפקח על טמפרטורת הגוף, הנשימה באמצעות בדיקה טמפרטורה רקטלית מחובר למחשב הקלטה פיזיולוגיים.
   הערה: טמפרטורת גוף נורמלית (36-37 מעלות צלזיוס) נשמר באמצעות המעגל מים חמים recirculating בנוי לתוך המחזיק מר חיים. הטמפרטורה נמדדת באמצעות חיישן רקטלי, נרשם במחשב פיקוח פיזיולוגיים באמצעות תוכנת מעקב פיזיולוגי ייעודי. באותה המערכת משמש כדי להקליט את האותות נשימה ומערכת רל נמדד באמצעות כרית פנאומטית תחת כלוב הצלעות, באמצעות אלקטרודות רל 3-עופרת. האות הנשימה משמש גם מפעילה רכישת MRI והפחתת חפצים הקשורים להנשמה תנועה.

3. ייבוא תמונות אר. איי

1. לנצל את סליל הגוף quadrature עבור עירור.
2. במקום סליל מקלט 4 ערוצים על הבטן התחתונה של העכבר מתבצעת סריקה כדי לאפשר זיהוי אופטימיזציה של אותות מן האזור עניין.
3. ליזום שינויים אוטומטיים באמצעות התוכנה הדמיה משולבת לרכוש מערכת tri-צירית תמונות של העכבר כל הגוף. הפניה זו סט של תמונות, לזהות את האזור של הריבית (במקרה זה, אזור שלפוחית השתן).
4. לרכוש שלושה סטים של תמונות אורתוגונלית פרוסים לאורך המטוסים צירית, הילתית ואת הווריד באמצעות מסגרות התייחסות רדיולוגית.
5. לנצל את FISP האמיתית הדמיה ברצף (כלול כאחת התכונות בתוכנת הדמיה משולב) עם מר בפרמטרים הבאים: TR = 900 מילי-שניות, טה = 2 מילי-שניות, הפא = 70, ממוצעים 14.
   הערה: קבוצה זו של פרמטרים מאפשר הדמיה מהירה עם איכות אבחון גבוהה, לרבות שקלול T1/T2 ב- < 10 דקות לכל העכבר.
6. עובי הפרוסה של רזולוציה מרחבית נקבעים לפי פרמטרים גיאומטריים שנבחרו על-ידי המשתמש באמצעות ממשק גרפי של פלטפורמת הדמיה משולב. התוצאה היא סדרה של פרוסות על פני כל שלפוחית השתן של 0.5 מ מ עובי עם פתרון בתוך המטוס של 0.148 מ מ.

4. מר וניתוח תמונות

1. לזהות את קבוצת פרוסות בעובי 0.5 מ מ והרזולוציה בתוך המטוס של 0.148 מ מ המכסה כל שלפוחית השתן.
2. לייצא תוכנת ניתוח תמונה רפואית על-ידי בחירת התיקיה עם תמונות המתאים בתבנית נתח.
3. בחר "מבט צירי נציג" במרכזו של שלפוחית השתן עבור ניתוח כמותי על-ידי גלילה באמצעות הדימויים שנוצר וזיהוי פרוסה אל נקודת האמצע של שלפוחית השתן, המאפשר ויזואליזציה של שלפוחית השתן לקיר, לומן.
   הערה: הפרוסה מרכז צריך להיות הנבחרת בקוטר הגדול.
4. בזהירות ניסחו את האזור של הריבית (ROI) ע י איתור באופן ידני את גבולות סביב הקצה החיצוני של שלפוחית השתן (BLA_החוצה) וליד לומן הפנימי (BLA_ב) של שלפוחית השתן (ראה דמויות סכמטית והייצוגיות באיור2) בתצוגה ' ' נבחר הנציגה צירית.
5. להחסיר לומן הפנימי מהקצה החיצוני כדי לחשב את פני השטח של הקיר שלפוחית השתן.
   בלה_קיר = בלה_החוצה - בלה_ב
   הערה: פני השטח של שלפוחית השתן שליטה עם שום גידול צפוי להיות פחות מזה עם גידול בשלפוחית השתן.

5. המתת חסד, דיסקציה של שלפוחית השתן

1. לאחר 20 שבועות של חשיפה BBN, המתת חסד העכברים באמצעות נהלי לפי הנחיות IACUC מקומיים.
2. לנקות את האזור. של החתך עם 70% אתנול, ואז אחוז והרם את העור דופן הבטן עם מלקחיים.
3. עושים חתך קו האמצע של symphysis הערווה אל הסרעפת.
4. בחדות פצעים וחתכים חלל הצפק על ידי האוחז עם מלקחיים אם עם מספריים.
5. לזהות שלפוחית השתן, אשר ממוקם בבטן התחתונה קו האמצע.
6. לזהות, לחתוך רצועה הטבור החציוני חיבור הכיפה של שלפוחית השתן הטבור דופן הבטן.
7. לתפוס את הכיפה של שלפוחית השתן עם מלקחיים כדי לספק countertraction ומנתחים שלפוחית השתן מן המקיפים מבנים, לרבות vesicles הזרע, פי הטבעת, שומן.
8. לזהות את ureters הזנת שלפוחית השתן, לגזור עם מספריים קרוב שלפוחית השתן.
9. הרמת שלפוחית השתן cephalad, לחתוך את השופכה עם מספריים ולהסיר את שלפוחית השתן.
10. מיד שוקלים שלפוחית השתן לאחר שטיפה זה עם PBS.

6. בבדיקה היסטולוגית של רקמה בשלפוחית השתן

1. לתקן את הרקמות שלפוחית השתן בפורמלין במאגר נייטרלי 10% עבור 36-48 שעות בטמפרטורת החדר (RT).
2. להטביע את הרקמה בבלוקים פרפין, לחתוך את השקופיות לבדיקה עוקבות, מכתים את השקופיות ועם hematoxylin אאוזין לבדיקה מיקרוסקופית כפי שתואר לעיל^19,20.
3. לבצע בדיקה מיקרוסקופית של שלפוחית השתן העכבר-נמוך (2.5 x ו- 10 x), הגדלה גבוהה (20 x ו- 40 x), בחינה מאקרוסקופית נגעים, היפרפלזיה, קרצינומה בחיי עיר, papillomas, גידולים papillary של neoplasms פולשנית^{19 , 21}.

תוצאות

גידולים בשלפוחית השתן באמצעות פרוטוקול המתואר (איור 1), היו המושרה בעכברים זכרים C57/B6. MRI בוצעה ב 16 שבועות, עכברים היו מורדמים ב 20 שבועות. Ex-vivo שלפוחית השתן משקולות (BW) עבור כל עכבר נרשמו. שקופיות, היו מוכתמים hematoxylin ואאוזין ולאחר כל השקופיות היסטולוגיה נב...

Discussion

הדמיה מדויקת של מודלים הגידול הוא הכרחי עבור המתאים היערכות מראש המתת חסד, אקראיות בעלי חיים לפני אתחול של טיפול ניסיוני. באמצעות ההליך המובאת כאן, נדגים מתודולוגיה ליצירה (1) גידולים בשלפוחית השתן באמצעות גורם מסרטן את BBN (2) stratify נטל גידול בשלפוחית השתן באמצעות מר מר-derived אזור בקורלציה מדיד...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57BL/6 mice	The Jackson Laboratory	664	Mice
N-butyl-N-(4-hydroxybutyl)nitrosamine carcinogen (BBN)	TCI American	B0938	Carcinogen
0.9% normal saline	Hospira, Inc	NDC 0409-488-02
Isoflurane	Piramal HealthCare	60307-120-25	Anesthetic
7Tesla ClinScan MRI	Bruker	NA	Dedicated Small Animal Imaging MRI
Syngo	Siemens	NA	MR Integrated Imaging Software
Model 1030 Monitoring & Gating System	Small Animal Instruments, Inc. (SAII)	NA	Small animal physiologic monitoring
Formalin, Neutral Buffered, 10%	Sigma	HT501128	Fixative
Eosin Y	Fisher Scientific	NC1093844	Histologic staining agent
Hematoxylin	Fisher Scientific	23-245651	Histologic staining agent
Jim7	Xinapse Systems	NA	Medical image analysis software
GraphPad Prism v7.04	Graphpad	NA	Graphing software
R v3.4.2	The R Project for Statistical Computing	NA	Statistical software
R package pROC v1.10.0.	The R Project for Statistical Computing	NA	ROC analysis