بناء واستخدام دائرة التحفيز الكهربائي لتعزيز Osteogenic التمايز في الخلايا الجذعية الوسيطة/اللحمية في المختبر

Summary

نقدم هنا بروتوكولا لبناء دائرة الثقافة الخلية مصممة للكشف عن خلايا لأنواع مختلفة من التحفيز الكهربائي، واستخدامها في علاج الخلايا الجذعية الوسيطة لتعزيز التمايز أوستيوجينيك.

Abstract

وقد استخدمت على نطاق واسع الخلايا الجذعية الوسيطة/stromal (MSCs) التئام العظام في الأنسجة الهندسة النهج. التحفيز الكهربائي (إستيم) قد ثبت لزيادة التمايز أوستيوجينيك ماجستير في المختبر وتعزيز العظام شفاء في إعدادات السريرية. هنا يمكننا وصف بناء دائرة الثقافة الخلية إستيم واستخدامها في علاج الفئران MSC المشتقة من نخاع العظام لتعزيز التمايز أوستيوجينيك. لقد وجدنا أن علاج MSCs مع إستيم لمدة 7 أيام يؤدي إلى زيادة كبيرة في التفريق بين أوستيوجينيك، والأهم من ذلك، يستمر هذا التأثير برو أوستيوجينيك بعد فترة طويلة من توقف إستيم (7 أيام). يمكن استخدام هذا النهج لتقشير MSCs مع إستيم لتعزيز التمايز أوستيوجينيك لتحسين نسيج العظام الهندسة نتائج العلاج، وهكذا، تساعدهم على تحقيق إمكاناتهم الكاملة العلاجية. وبالإضافة إلى هذا التطبيق، يمكن أيضا استخدام هذا إستيم خلية دائرة الثقافة والبروتوكول للتحقيق في السلوكيات خلية إستيم الحساسة الأخرى، مثل الهجرة والانتشار والمبرمج ومرفق السقالة.

Introduction

زيادة في الصدمات النفسية و/أو تشوهات العظام التي يسببها المرض يعالجون باستخدام تركيبات مختلفة من العلاج بالخلايا وتقنيات الطب التجديدي. MSCs هي الخلية المختارة في هذه العلاجات، بسبب نشاط osteogenic عالية نسبيا، والعزلة وكفاءتها التوسع، وسلامة¹. لتحقيق أقصى قدر من النشاط أوستيوجينيك، وهكذا، تحسين فعاليتها العلاجية، أدخلت عدة أساليب للتلاعب MSCs قبل استخدامها في هذه العلاجات (كما استعرضها موني et al.²). أحد هذه الأساليب هو إستيم، التي أبدت تعزيز التمايز أوستيوجينيك ماجستير في المختبر³ وتعزيز العظام شفاء المجراة في⁴. وعلى الرغم من تزايد عدد الدراسات التي تركز على علاج MSCs مع إستيم، نظام أمثل لتحقيق أقصى قدر من التأثير برو osteogenic إستيم في لم تتحدد.

استخدام أساليب أخرى في المختبر باستخدام إستيم الملح الجسور مغمورة في الأجلين المتوسط والثقافة، الذي يفصل بين الخلايا من أقطاب معدنية⁵. وميزة هذا هو أن إيصال إستيم عبر الجسور الملح يزيل إدخال مشتقات كيميائية (مثلاً، التآكل من أقطاب معدنية) التي قد تكون سامة للخلايا. وعلى الرغم من هذه الميزة، الجسور الملح مرهقة للعمل مع، واستيم وهي إيصال تختلف عن التي تم تسليمها في النماذج الحية، مما يجعل من الصعب على الربط بين النتائج التي تم الحصول عليها عند استخدام هذين النظامين. الأجهزة التي تقدم إستيم عبر أقطاب معدنية أو الكربون ثابتة داخل الآبار ثقافة الخلية (كما استعرضها توباي هرنيك وكابلان⁶) أفضل محاكاة الأجهزة المستخدمة في فيفو؛ ومع ذلك، هذه الأجهزة صعبة لتنظيف/تعقيم بين الاستخدامات وعدد الخلايا التي يمكن دراستها بكل تجربة محدودة. لقد قمنا بتصميم قاعة إستيم المقدمة هنا على وجه التحديد لمعالجة أوجه القصور في هذه الأجهزة الأخرى. في حين كان معظم من تجربتنا باستخدام هذه الدائرة إستيم مع 2D والثقافات ثلاثية الأبعاد تحتوي على نخاع العظام والدهنية-الأنسجة-المستمدة من MSCs^3،4، فائدة كبيرة من هذه الدائرة أن من تنوعاً ومع طفيفة نسبيا التغييرات، يمكن تكييفها لدراسة أنواع الخلايا الأخرى ضمن مجموعة متنوعة من الظروف المختلفة.

هنا يمكننا وصف بناء دائرة الثقافة الخلية إستيم؛ ثم، علينا أن نظهر استخدام MSCs معاملة مع أنظمة مختلفة من إستيم وقياس أثر على التمايز أوستيوجينيك. يتم تقييم التمايز osteogenic لجنة السلامة البحرية عن طريق ترسب الكالسيوم والنشاط الفوسفاتيز القلوية، وعلامة أوستيوجينيك التعبير الجيني. الأهم من ذلك، في الماضي التجارب التي تستخدم هذا الإعداد، لاحظنا أن تستمر هذه الآثار برو أوستيوجينيك بعد فترة طويلة من توقف العلاج إستيم.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1-تشييد قاعة الثقافة الخلية التحفيز الكهربائي

1. لبناء قاعة إستيم، جمع أغطية اثنين من لوحات قياسية 6-جيدا خلية الثقافة؛ سلك البلاتين 99.99 ٪، 60 سم في طول قطرها من 0.5 – 1 مم؛ المغلفة بالفضة الأسلاك النحاسية، 70 سم في طول قطرها 0.6 مم؛ كماشة؛ مجموعة لحام الحديد؛ أنبوب واحد من الغراء فائقة التوصيل؛ سلك واحد محطة كتلة موصل، الست الصغيرة 2.2 "الخامس المصابيح" (اختياري)؛ أنبوب واحد من لاصق سيليكون ستانلس طلاء (اختياري)؛ لفة واحدة من الشريط الأسود العزل الكهربائي؛ المعيار، مرنة، معزول الأسلاك الكهربائية النحاسية (0.14 مم²)، 2 متر في الطول (جدول المواد).
2. غطاء لوحة 6-جيدا، ومارك وثم حفر ثقوب اثنين (التي يبلغ قطرها ~ 1 مم)، الآبار 25 مم وبصرف النظر، قرب الحافة الخارجية لكل من الدول الست (12 ثقوب في المجموع)، كما هو مبين في الشكل 1 أ، ب.
3. قطع اثنا عشر أطوال 5 سم من سلك البلاتين بكماشة. ينحني كل من الأسلاك يدوياً في شكل L ترك نهاية واحدة طولها 3 سم والآخر 2 سم. قطع الأسلاك المغلفة بفضي إلى اثنين أطوال 35 سم.
4. إدراج نهاية سلك البلاتين واحدة بنت أطول (3 سم) (من الداخل الخارج) في كل حفر حفرة، ترك 1-2 مم بارزة من خارج الغطاء، وينحني باستخدام الملقط. تأمين أسلاك البلاتين في ثقوب الغطاء مع الغراء فائقة التوصيل وتركها لتجف لحوالي 6 ح.
5. لحام النصائح من جميع أسلاك البلاتين الستة (التي سوف تكون بمثابة الزركونيم لاحقاً، انظر الشكل 1A) بارزة من الأغطية لواحد من الأسلاك المغلفة بالفضة. كرر الإجراء نفسه، لحام أسلاك البلاتين الستة المتبقية (بمثابة الأنودات فيما بعد) للأسلاك المغلفة بالفضة الأخرى.
   1. إضافة المصابيح في الدائرة بين كل ستة أزواج قطب البلاتين الكاثود اﻷنود، تأكيد وظيفة أثناء التجارب (اختياري). ضع قطعة من الشريط العازل الأسود تحت كل أدى إلى الحيلولة دون تعريض الخلايا في لوحات الثقافة على ضوء الصمام (الشكل 1).
6. الصق رابط محطة كتلة الأسلاك إلى الركن الأيسر العلوي من الغطاء لوحة 6-جيدا وقم بتوصيل كل الأسلاك المغلفة بالفضة طرفيات الإدخال، كما هو مبين في الشكل 1.
7. قطع مقطع 20 ملم × 20 ملم من الركن الأيسر العلوي من غطاء لوحة 6-البئر الثانية (الشكل 1B، غطاء Nr. 2) لاستيعاب محطة كتلة الموصل الموجود على غطاء الأولى. تغطي غطاء الأولى، مزودة بأقطاب كهربائية، مع غطاء الثاني والشريط لهم جنبا إلى جنب مع شريط لاصق.
   1. تحسين الرابطة للأغطية اثنين، استخدام لاصق سيليكون الطلاء (اختياري). للقيام بذلك، تغطي الغطاء مع أقطاب الفضة بطبقة 3 – 5 مم من لاصق السيليكون وتغطية ذلك مع غطاء الأخرى، تسمح ح 12 لمادة لاصقة لتجف.
8. الاتصال واحدة من نهاية الأسلاك النحاسية المعزولة القياسية هما المحطات إخراج سلك موصل والغايات الأخرى للموز موصلات الذكور (4 ملم).
   ملاحظة: يتوقف طول هذه الأسلاك على المسافة من على الرف في الحاضنة، حيث سيتم الاحتفاظ الخلايا، للإمداد بالطاقة، خارج الحاضنة (الشكل 1).
9. ضبط الجرعة (الجهد) ونظام إستيم تسليمها إلى الخلايا عن طريق تنظيم العاصمة إمدادات الطاقة.
   1. قم بتشغيل إمدادات الطاقة عن طريق الضغط على زر ON/OFF على اللوحة الأمامية. تنشيط قناة 1 بالضغط على زر 1.
   2. اضغط على الزر رقم 4 (الخامس-مجموعة) تعيين الجهد. اضغط أزرار 2، . و 5 لتعيين الإخراج التحميل في 2.5 ف اضغط Enter.
   3. التأكد من أن مخرجات تحميل 2.5 الخامس (2,500 أم) يناظر إستيم أم 100/مم، وفقا للمعادلة التالية ومبسطة.
      V _إستيم = ؛ أو
      V = V_إستيم × د
      هنا، V = الجهد إمدادات طاقة الإنتاج في بالميليفولت؛ d = المسافة بين أقطاب في ملليمتر؛ V _إستيم = الجهد التحفيز في بالميليفولت كل ملليمتر.
      ملاحظة: يطبق هذا التبسيط فقط في حالة الجهد المستمر DC. المقاومة بين المتوسط والخلايا لا يكاد أقطاب ليست على اتصال مباشر مع الخلايا؛ بدلاً من ذلك، يتم تسليم إستيم إلى الخلايا من خلال الوسيلة.

2-الوسيطة من الخلايا الجذعية الثقافة في المتوسط أوستيوجينيك

1. شراء وتخزين MSCs الفئران المتاحة تجارياً (انظر الجدول للمواد) في النتروجين السائل حتى اليوم من هذه التجربة. وبدلاً من ذلك، عزل MSCs من الحيوانات الأخرى وفقا للبروتوكولات نشرت في مكان آخر^7،8 وفقا للأنظمة المؤسسية المحلية للاستخدام الحيوانات التجريبية.
2. في يوم التجربة، إزالة قنينة واحدة (1 × 10⁶ خلايا) من MSCs من تخزين النيتروجين السائل، والذوبان بسرعة (في حدود 1 دقيقة) الخلايا في حمام مائي يسخن إلى 37 درجة مئوية.
   1. تحت ظروف معقمة في غطاء الاندفاق الصفحي، "الماصة؛" محتوى القنينة في أنبوب فالكون 50 مل وإضافة 9 مل متوسط العادي (NM) بريوارميد إلى 37 درجة مئوية، تتكون من المتوسطة تعديل النسر دولبيكو (دميم; 1 x) مع 10% معطل الحرارة الجنيني البقري المصل (FBS) و 1% البنسلين/ستربتوميسين الحل. بيليه الخلايا لمدة 5 دقائق باستخدام الطرد المركزي في 300 x ز.
   2. في غطاء الاندفاق الصفحي، إزالة المادة طافية وعناية ريسوسبيند بيليه الخلية في 12 مل من شمال البحر الأبيض المتوسط بريوارميد إلى 37 درجة مئوية. نقل الخلايا ريسوسبينديد إلى قارورة ثقافة الخليوي T-75.
3. ثقافة الخلايا في 37 درجة مئوية، وأول أكسيد الكربون 5%₂، 5% O₂ حتى بلوغهم التقاء 80%-90% (بعد حوالي 3-5 أيام).
4. مرور الخلايا.
   ملاحظة: إجراء كافة العمليات باستثناء الطرد المركزي والحضانة تحت ظروف معقمة في غطاء الاندفاق الصفحي.
   1. وبعد التوصل التقاء 80%-90%، استرداد الخلايا مع الخلايا مفرزة الحل. نضح مستنبت الخلية وتغسل x 2 مع 1 x مخزنة الفوسفات المالحة (PBS) وإضافة 5 مل 1 × الخلية المفرزة الحل والعودة الخلايا للحاضنة لمدة 5 دقائق.
   2. متى يتم فصل الخلايا، إضافة مبلغ مساو من الثقافة المتوسطة لإلغاء تنشيط الحل مفرزة. جمع الخلايا في أنبوب فالكون 50 مل وتدور لهم في 300 x غ لمدة 5 دقائق.
   3. تجاهل على المديين المتوسط وريسوسبيند الخلايا في 1 مل متوسط الطبيعي الطازج. تقييم عدد الخلايا قادرة على البقاء مع وصمة عار تريبان الأزرق.
   4. البذور 1 × 10⁶ خلايا في قارورة T-75 جديدة مع 12 مل من بريوارميد شمال البحر الأبيض المتوسط. ثقافة الخلايا في 37 درجة مئوية، وأول أكسيد الكربون 5%₂، 5% O₂ حتى بلوغهم التقاء 80%-90%.
      ملاحظة: الخلية باساجينج (2.4.1–2.4.4 الخطوات) يمكن تكرارها عدة مرات حتى يتم الحصول على العدد المطلوب من الخلايا. لا تستخدم الخلايا الأقدم من مرور 8.
5. بذور 9 × 10⁴ خلايا في 3 مل من شمال البحر الأبيض المتوسط (إبطال الحرارة 10% الجنين المصل البقري، 1% البنسلين/ستربتوميسين، دميم) في كل من لوحة الثقافة 6-جيدا جيدا. احتضان الخلايا لمدة يوم واحد في 37 درجة مئوية، وأول أكسيد الكربون 5%₂، 5% O₂.
6. وفي اليوم التالي نضح المتوسطة الثقافة وتطبيق 3 مل من التمايز osteogenic المتوسطة (OM؛ المتوسطة العادية وتستكمل مع 10 الديكساميتازون^-7 م و 10 مم β-جليسيروفوسفاتي و 0.05 ملم حمض الأسكوربيك-2-الفوسفات).
7. ضع لوحة 6-جيدا مع الخلايا في الحاضنة واحتضان في 37 درجة مئوية، وأول أكسيد الكربون 5%₂، 5% O₂ بين عشية وضحاها.

3-علاج MSCs مع إستيم

1. اليوم الخلايا تعامل مع إستيم، تعقيم أقطاب كهربائية في الحل الإيثانول 70% لمدة 30 دقيقة؛ ثم تجفيفها تحت الأشعة فوق البنفسجية الخفيفة في مجلس الوزراء 30 دقيقة إضافية لسلامة.
2. في غطاء الاندفاق الصفحي، تغطي لوحة 6-البئر الذي يحتوي على MSCs مثقف مع غطاء مزودة بأقطاب كهربائية، مع التأكد من أن أقطاب كهربائية مغمورة تماما في المتوسط (إذا لزم الأمر، أضف المتوسطة). نقل لوحة 6-بئر مغطاة (غرفة إستيم) مع الخلايا للحاضنة وتتصل أسلاك التيار الكهربائي.
3. تحميل إخراج مجموعة الإمداد بالطاقة إلى 2.5 الخامس وعلاج الخلايا مع إستيم ح 1^3،9.
4. بعد التحفيز، وقطع إمدادات الطاقة وإزالة الدائرة إستيم من الحاضنة. تحت ظروف معقمة، تبادل غطاء مزودة بأقطاب مع غطاء قياسية لوحة 6-جيدا.
5. عودة الخلايا للحاضنة وتركهم بين عشية وضحاها. تنظيف أقطاب كهربائية، مع برنامج تلفزيوني أولاً ثم مع الحل الإيثانول 70%. تنظيف المنتجات الصدأ المتراكم من سطح القطب مع الصنفرة غرامة.
6. كرر الخطوات من 3، 1-3.5 لمدة 6 أيام متتالية. في يوم 4، قبل تطبيق إستيم وتحت ظروف معقمة، تغيير الثقافة المتوسطة يسفط 1.5 مل متوسطة والاستعاضة عنه ب 1.5 مل OM. الطازج بريوارميد
7. بعد تطبيق إستيم لمدة 7 أيام متتالية، الحفاظ على الخلايا في الثقافة لمدة 7 يوما إضافيا، تبادل المتوسطة كل 3 – 4 أيام.

4-قياسات التمايز أوستيوجينيك

1. تحليل التغيرات مورفولوجيا الخلايا تحت مجهر.
2. لتقييم تأثير إستيم على التمايز osteogenic لجنة السلامة البحرية وقياس ترسب الكالسيوم والنشاط الفوسفاتيز القلوية وعلامة أوستيوجينيك التعبير الجيني، كما وصفت في مكان آخر^3،9.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

لتقييم تأثير 100 mV/مم من إستيم على التفريق بين osteogenic MSCs، الخلايا تعامل مع إستيم 3، 7، و 14 يوما أو نونتريتيد (مراقبة) حللت في يوم 14 من استزراع بتقييم التغييرات الشكلية وترسب الكالسيوم (الشكل 2 ). وقد تم ذلك بتصوير الخلايا باستخدام مشرق الميدان مجهرية (تغيرات مور?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

هنا يصف لنا بناء غرفة وأسلوب لعلاج الخلايا الجذعية الوسيطة مع إستيم التي ينتج عنها تعزيز التمايز أوستيوجينيك.

الإعداد إستيم قدم لا تتطلب معدات خاصة والمعرفة، ويمكن أن يؤديها الباحثين المبتدئين في مختبر علم الأحياء/الكيمياء حيوية لخلايا الجذعية قياسية. ومع ذلك، عند بناء وا...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Estim fabrication
Banana connector/Jack adaptor	Poppstars	1008554	2 pieces
Cutting pliers	Knipex	78 03 125
DC power supply (0-30V/0-3A)	B&K Precision	Model 9130B	Any simular model could be used
Insulated flexible wires (0.14 mm2)	Conrad Electronic International	604794, 604093	2 pieces
Non-corrosive silicone rubber	Dow Corning	3140 RTV	*could be purchased by many stores
Platinum Wire (999,5/1000; 1mm ø)	Junker Edelmetalle	00D-3010	0.6 m needed for 1 Estim chamber
70% Ethanol solution	any		Sterilisation of Estim chamber
Silver coated copper wire (0.6 mm ø)	Conrad Electronic International	409334 - 62	≈70 cm needed for 1 Estim device
Soldering iron Set	Conrad Electronic International	1611410 - 62	Any simular model could be used
TPP 6-well plate lid	Sigma-Aldrich	Z707759-126EA	2 lids for Estim chamber
2.2V wired circular LEDs	Conrad Electronic International	599525 - 62	6 pieces
UHU Super glue	UHU GmbH & Co. KG	n/a	*could be purchased by many stores
MSC culture
β-Glycerophosphate disodium salt hydrate	Sigma-Aldrich	G9422	osteogenic cell culture
DMEM, low glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate	Thermo-Fischer Scientific	21885025	cell culture
DPBS, no calcium, no magnesium	Thermo-Fischer Scientific	14190144	cell culture
Dexamethasone	Sigma-Aldrich	D4902	osteogenic cell culture
Fetal Bovine Serum	Thermo-Fischer Scientific	10500064	cell culture
50 ml Falcon tube	Sarstedt	62,547,004	cell culture
L-Ascorbic acid	Sigma-Aldrich	A4544	osteogenic cell culture
Penicillin/Streptomycin	Thermo-Fischer Scientific	15140122	cell culture
Sprague-Dawley (SD) rat mesenchymal stem cells, bone marrow origin	Cyagen	RASMX-01001	cell culture
Cell detachment solution	Thermo-Fischer Scientific	A1110501	cell culture, cell detachment
TC Flask, T75	Sarstedt	833911302	cell culture
TPP 6-well plates	Sigma-Aldrich	Z707759-126EA	cell culture
Trypan Blue Dye, 0.4% solution	Bio-Rad	1450021	cell count