Construcción y uso de una cámara de estimulación eléctrica para mejorar la diferenciación osteogénica de células madre mesenquimales, estromales In Vitro

Resumen

Aquí presentamos un protocolo para la construcción de una cámara de cultivo celular diseñada para exponer distintos tipos de estimulación eléctrica y su uso en el tratamiento de células madre mesenquimales para realzar la diferenciación osteogénica de las células.

Resumen

Células madre/estromales mesenquimales (MSCs) se han utilizado extensivamente para promover el hueso curativo en enfoques de ingeniería de tejidos. Estimulación eléctrica (EStim) se ha demostrado para aumentar la diferenciación osteogénica de MSC in vitro y promover hueso curativo en ajustes clínicos. Aquí describimos la construcción de una cámara de cultivo celular de EStim y su uso en el tratamiento de MSC de médula ósea para mejorar la diferenciación osteogénica de la rata. Se encontró que el tratamiento de MSCs con EStim durante 7 días da lugar a un aumento significativo en la diferenciación osteogénica, y lo importante, este efecto osteogénico pro persiste mucho tiempo después (7 días) EStim. Este enfoque de pretratamiento de MSCs con EStim para mejorar la diferenciación osteogénica podría utilizarse para optimizar los resultados del tratamiento de recreando el tejido del hueso y, así, ayudarles a alcanzar su potencial completo terapéutico. Además de esta aplicación, esta EStim compartimiento de la cultura de célula y protocolo pueden también utilizar para investigar otros comportamientos de célula EStim-sensibles, tales como la migración, proliferación, apoptosis y accesorio del andamio.

Introducción

Un aumento de traumas o defectos óseos inducidos por la enfermedad son tratados con diferentes combinaciones de tecnologías de la medicina regenerativa y terapia celular. MSCs son la célula de elección en estos tratamientos, debido a su relativamente alta actividad osteogénica, aislamiento y eficiencia de expansión y seguridad¹. Para maximizar su actividad osteogénica y, así, optimizar su eficacia terapéutica, se han introducido varios métodos para manipular MSCs antes de su uso en estos tratamientos (ya revisado por Mauney et al.²). Un tal método es EStim, que se ha demostrado para mejorar la diferenciación osteogénica de MSC en vitro³ y promover hueso curativo en vivo⁴. A pesar del creciente número de estudios centrados en el tratamiento de MSCs con EStim, un régimen óptimo para maximizar el efecto pro-osteogénica de EStim todavía tiene que definirse.

Otros métodos in vitro utilizando EStim utilizan puentes de sal sumergidos en el medio de cultivo, que separa las células de electrodos metálicos⁵. La ventaja es que entrega EStim a través de puentes de sal elimina la introducción de subproductos químicos (por ejemplo, corrosión de los electrodos metálicos) que pueden ser citotóxicos. A pesar de esta ventaja, puentes de sal son engorrosos para trabajar con, y EStim que difiere de la que en los modelos in vivo, lo que es difícil correlacionar los resultados obtenidos al utilizar los dos sistemas. Configuraciones que EStim vía los electrodos metálicos o carbono fijados dentro de los pozos de la cultura de célula (ya revisado por Tupaj Hronik y Kaplan⁶) simulan mejor los dispositivos usados en vivo; sin embargo, estos dispositivos son difíciles de limpiar/esterilizar entre los usos y el número de células que pueden ser estudiados por experimento está limitado. Diseñamos la cámara EStim presentada específicamente para hacer frente a las limitaciones de estas otras configuraciones. Aunque la mayor parte de nuestra experiencia con esta cámara EStim ha sido con 2D y 3D culturas que contiene médula ósea adiposo-tejido-derivadas y MSCs^3,4, una gran ventaja de esta cámara es es versátil y, con relativamente menores cambios, pueden ser adaptados a otros tipos celulares bajo una variedad de diferentes condiciones de estudio.

Aquí describimos la construcción de una sala de cultura de célula EStim; Luego, se demuestra su uso por MSCs tratando con diferentes regímenes de EStim y medir el efecto resultante sobre la diferenciación osteogénica. Diferenciación osteogénica MSC es evaluada a través de la deposición de calcio, actividad de la fosfatasa alcalina y expresión génica de marcadores osteogénicos. Lo importante, más allá de experimentos que utilizan esta configuración, observamos que estos efectos pro-osteogénica persisten mucho después de que se suspendió el tratamiento de EStim.

Protocolo

1. construcción del compartimiento de la cultura de la estimulación eléctrica de la célula

1. Para construir la cámara EStim, recoger dos tapas de placas de cultivo estándar celular 6-bien; cable 99.99% platino, 60 cm de longitud con un diámetro de 0,5 a 1 mm; alambre de cobre recubierto de plata, 70 cm de longitud con un diámetro de 0,6 mm; alicates de corte; kit de soldador; un tubo de pegamento superconductor; conector del bloque de terminal de un cable, pequeño seis 2,2 V LED (opcional); un tubo de pegamento de silicón no corrosivo capa (opcional); un rollo de cinta aisladora negra; estándar, flexible, con aislamiento cables eléctricos cobre (0,14 mm²), 2 m de largo (tabla de materiales).
2. En una tapa de placa de 6 pozos, marca y luego perfore dos agujeros (con un diámetro de ~ 1 mm), 25 mm., cerca del borde externo de cada uno de los seis pozos (12 agujeros en total), como se muestra en la figura 1A, B.
3. Cortar 12 tiras de 5 cm de alambre de platino con alicates de corte. Cada uno de los cables manualmente en forma de L, dejando 3 cm de largo uno de los extremos de la curva y los otros 2 cm. Corte el cable revestido de plata en dos longitudes de 35 cm.
4. Inserte el extremo doblado del más largo (3 cm) de un alambre de platino (de dentro hacia fuera) en cada orificio taladrado, dejando 1-2 mm que sobresale de la parte exterior de la tapa, lo doble con unas pinzas. Asegure los alambres de platino en los agujeros de la tapa con pegamento de superconductor y dejarlo secar por alrededor de 6 horas.
5. Las puntas de los alambres de platino seis (que más tarde servirá de cátodos, ver figura 1A) de la soldadura que sobresale de la tapa a uno de los cables recubiertos de plata. Repita el mismo procedimiento, soldar los cables de platino seis restantes (que más tarde servirá de ánodos) al otro cable revestido de plata.
   1. Añadir LEDs en el circuito entre cada uno de los seis pares de electrodo de platino de ánodo-cátodo, para confirmar la funcionalidad durante los experimentos (opcionales). Coloque un pedazo de cinta negra debajo de cada LED para evitar exponer a las células en las placas de la cultura a la luz de LED (figura 1).
6. Pegar el cable conector del bloque terminal en la esquina superior izquierda de la tapa de placa de 6 pozos y Conecte ambos cables recubiertos de plata a los terminales de entrada, como se muestra en la figura 1.
7. Corte una sección de 20 x 20 mm de la esquina superior izquierda de una segunda tapa de placa de 6 pozos (figura 1B, la tapa no. 2) para el conector del bloque de terminal en la primera tapa. Cubre la primera tapa, equipada con electrodos, con la segunda tapa y pegarlas con cinta adhesiva.
   1. Para mejorar la vinculación de las dos tapas, use adhesivo de silicona capa (opcional). Para ello, cubra la tapa con los electrodos de plata con una capa de 3-5 mm de silicona adhesivo y cubrir con la tapa, permitiendo a 12 h para que el adhesivo se seque.
8. Conecte un extremo de los dos cables de cobre aislados estándar para los terminales de salida del conector del cable y los otros extremos a conectores macho banana (4 mm).
   Nota: La longitud de los cables depende de la distancia de la plataforma en la incubadora, donde las células se mantendrá, a la alimentación, fuera de la incubadora (figura 1).
9. Ajustar la dosis (voltaje) y régimen de EStim entregado a las células mediante la regulación de la fuente de alimentación.
   1. Encienda la alimentación presionando el botón ON/OFF en el panel frontal. Activa canal 1 pulsando el botón 1.
   2. Pulse la tecla nº 4 (V-set) para ajustar la tensión. Pulse botones de 2, . y 5 para ajustar la salida de carga en 2.5 V. Oprima Enter.
   3. Asegurar que la salida de carga de 2,5 V (2.500 mV) corresponde a un EStim de 100 mV/mm, según la ecuación siguiente, simplificada.
      V _EStim = ; o
      V = V_EStim × d
      Aquí V = el voltaje de alimentación de la salida de milivoltios; d = distancia entre electrodos en milímetros; V _EStim = el voltaje de estimulación en milivolts por milímetro.
      Nota: Esta simplificación se aplica sólo en caso de voltaje de DC constante. La resistencia entre el medio y las células es insignificante ya que los electrodos no están en contacto directo con las células; en cambio, EStim se entrega a las células a través del medio.

2. mesenquimatosas células cultura en medio osteogénico

1. Comprar y almacenar MSCs rata comercialmente disponibles (véase Tabla de materiales) en nitrógeno líquido hasta el día del experimento. Por otra parte, aislamiento MSCs de otros animales según protocolos había publicado^7,8 según la normativa institucional local para el uso de animales de experimentación.
2. En el día del experimento, saque el almacenamiento de nitrógeno líquido de un frasco (1 x 10⁶ células) de MSCs y rápidamente (dentro de 1 min) descongelar las células en un baño de agua precalentada a 37 ° C.
   1. Bajo condiciones estériles en campana de flujo laminar, pipetee el contenido del frasco en un tubo falcon de 50 mL y añadir 9 mL de medio normal (NM) precalentado a 37 ° C, que consiste en medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM; 1 x) con 10% inactivado con calor suero bovino fetal (FBS) y 1% solución de penicilina/estreptomicina. Sedimenten las células durante 5 min mediante centrifugación a 300 x g.
   2. En campana de flujo laminar, quite el sobrenadante y con cuidado Resuspender el precipitado de células en 12 mL de NM precalentada a 37 ° C. Transferir las células resuspendidas a un matraz de cultivo de células T-75.
3. Las células a 37 ° C, 5% CO₂, 5% O₂ de la cultura hasta llegar a una confluencia del 80% – 90% (después de aproximadamente 3 a 5 días).
4. Las células de paso.
   Nota: Realice todas las operaciones excepto la centrifugación e incubación en condiciones estériles en campana de flujo laminar.
   1. Después de alcanzar una confluencia del 80% – 90%, recuperar las células con solución de separación celular. Aspirar el medio de cultivo celular, lavar 2 x 1 x tampón fosfato solución salina (PBS), añadir 5 mL de solución de separación celular 1 x y vuelva las células a la incubadora durante 5 minutos.
   2. Una vez que las células son separadas, añadir una cantidad igual de medio de cultivo para inactivar la solución de la separación. Recoger las células en un tubo falcon de 50 mL y centrifugado a 300 x g durante 5 minutos.
   3. Descartar el medio y resuspender las células en 1 mL de medio fresco normal. Evaluar el número de células viables con el colorante azul de trypan.
   4. Semilla 1 x 10⁶ células en un nuevo frasco de T-75 con 12 mL de NM precalentada. Las células a 37 ° C, 5% CO₂, 5% O₂ de la cultura hasta llegar a un 80% – 90% de confluencia.
      Nota: Celular pases (medidas 2.4.1–2.4.4) se puede repetir varias veces hasta obtener la cantidad necesaria de células. No utilice las células mayores de paso 8.
5. ⁴ células de semilla 9 x 10 3 ml de NM (10% suero bovino fetal inactivado con calor, 1% de penicilina/estreptomicina, DMEM) en cada pocillo de una placa de cultivo de 6 pozos. Incube las células durante 1 día a 37 ° C, 5% CO₂, 5% O₂.
6. Al día siguiente, aspirar el medio de cultivo y aplicar 3 mL de medio de diferenciación osteogénica (OM; normal suplementado con 10^-7 M de dexametasona, glicerofosfato-β de 10 mM y 0.05 mM de ácido ascórbico 2-fosfato).
7. Coloque la placa de 6 pozos con células en la incubadora e incubar a 37 ° C, 5% CO₂, 5% O₂ durante la noche.

3. tratamiento de MSCs con EStim

1. El día que las células se tratan con EStim, esterilizar los electrodos en solución de etanol 70% durante 30 minutos; Luego, secar bajo la luz en un gabinete durante una 30 minutos adicionales de seguridad UV.
2. En campana de flujo laminar, cubra la placa de 6 pozos con MSCs cultivadas con tapa equipada con electrodos, asegurándose de que los electrodos estén completamente sumergidos en el medio (si es necesario, añadir medio). La placa de 6 pozos cubierta (EStim cámara) con las células de transferencia a la incubadora y conecte sus cables a la fuente de alimentación.
3. Establecer la fuente de alimentación a la salida de carga de 2,5 V y tratar las células con EStim para 1 h^3,9.
4. Después de la estimulación, desconecte la alimentación y extraiga la cámara EStim de la incubadora. Bajo condiciones estériles, intercambiar la tapa consta de electrodos con una tapa estándar placa de 6 pozos.
5. Vuelva las células a la incubadora y dejar toda la noche. Limpiar los electrodos, primero con el PBS y luego con solución de etanol al 70%. Limpiar los productos de corrosión acumulados desde la superficie del electrodo con papel de lija fino.
6. Repita los pasos 3.1 a 3.5 durante 6 días consecutivos. El día 4, antes de aplicar EStim y bajo condiciones estériles, cambiar el medio de cultivo por aspiración 1,5 mL de medio y reemplazarlo con 1,5 mL de OM. fresco precalentado
7. Después de aplicar EStim durante 7 días consecutivos, mantener las células en cultivo por un adicional de 7 días, cambiar el medio cada 3-4 días.

4. medidas de diferenciación osteogénica

1. Analizar cambios de morfología de la célula bajo el microscopio.
2. Para evaluar el efecto de EStim en MSC Diferenciación osteogénica medida deposición de calcio, actividad de la fosfatasa alcalina y expresión génica de marcadores osteogénicos, como describe en otra parte^3,9.

Resultados

Para evaluar el efecto de 100 mV/mm de EStim en la diferenciación osteogénica de MSCs, las células tratadas con EStim para 3, 7 y 14 días o no tratada (control) fueron analizadas en el día 14 de cultivo mediante la evaluación de cambios morfológicos y la deposición de calcio (figura 2 ). Esto fue hecha por las células mediante microscopía de campo brillante (cambios de morfología) la proyección de imagen o por fijación de células en solución de...

Discusión

Aquí describimos la construcción de una cámara y un método para el tratamiento de células madre mesenquimales con EStim que se traduce en mayor diferenciación osteogénica.

La configuración de EStim presentada no requiere equipo especial/conocimientos y se puede realizar en un laboratorio de Biología/Bioquímica de la célula de vástago estándar por jóvenes investigadores. Sin embargo, al construir y utilizar la cámara EStim, especial debe tener cuidado en algunos pasos críticos. ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Estim fabrication
Banana connector/Jack adaptor	Poppstars	1008554	2 pieces
Cutting pliers	Knipex	78 03 125
DC power supply (0-30V/0-3A)	B&K Precision	Model 9130B	Any simular model could be used
Insulated flexible wires (0.14 mm2)	Conrad Electronic International	604794, 604093	2 pieces
Non-corrosive silicone rubber	Dow Corning	3140 RTV	*could be purchased by many stores
Platinum Wire (999,5/1000; 1mm ø)	Junker Edelmetalle	00D-3010	0.6 m needed for 1 Estim chamber
70% Ethanol solution	any		Sterilisation of Estim chamber
Silver coated copper wire (0.6 mm ø)	Conrad Electronic International	409334 - 62	≈70 cm needed for 1 Estim device
Soldering iron Set	Conrad Electronic International	1611410 - 62	Any simular model could be used
TPP 6-well plate lid	Sigma-Aldrich	Z707759-126EA	2 lids for Estim chamber
2.2V wired circular LEDs	Conrad Electronic International	599525 - 62	6 pieces
UHU Super glue	UHU GmbH & Co. KG	n/a	*could be purchased by many stores
MSC culture
β-Glycerophosphate disodium salt hydrate	Sigma-Aldrich	G9422	osteogenic cell culture
DMEM, low glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate	Thermo-Fischer Scientific	21885025	cell culture
DPBS, no calcium, no magnesium	Thermo-Fischer Scientific	14190144	cell culture
Dexamethasone	Sigma-Aldrich	D4902	osteogenic cell culture
Fetal Bovine Serum	Thermo-Fischer Scientific	10500064	cell culture
50 ml Falcon tube	Sarstedt	62,547,004	cell culture
L-Ascorbic acid	Sigma-Aldrich	A4544	osteogenic cell culture
Penicillin/Streptomycin	Thermo-Fischer Scientific	15140122	cell culture
Sprague-Dawley (SD) rat mesenchymal stem cells, bone marrow origin	Cyagen	RASMX-01001	cell culture
Cell detachment solution	Thermo-Fischer Scientific	A1110501	cell culture, cell detachment
TC Flask, T75	Sarstedt	833911302	cell culture
TPP 6-well plates	Sigma-Aldrich	Z707759-126EA	cell culture
Trypan Blue Dye, 0.4% solution	Bio-Rad	1450021	cell count