JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כאן אנו מציגים פרוטוקול להקמת תא התרבות תאים שנועדו לחשוף תאים לסוגים שונים של גירוי חשמלי, ושימוש בו בטיפול גזע mesenchymal כדי לשפר את הבידול osteogenic.

Abstract

תאי גזע mesenchymal/סטרומה (MSCs) נעשה שימוש נרחב כדי לקדם את עצם ריפוי ברקמות הנדסה גישות. גירוי חשמלי (EStim) הוכח להגדיל MSC בידול osteogenic במבחנה, לקדם את עצם ריפוי בהגדרות קליניים. כאן נתאר הקמת חדר תרבות תא EStim ואלשין השימוש בטיפול עצמות מח-נגזר MSC כדי לשפר את הבידול osteogenic. מצאנו כי בטיפול MSCs עם EStim במשך 7 ימים גורמת לעליה משמעותית הבידול osteogenic, חשוב, אפקט pro-osteogenic זה נמשכת זמן רב לאחר (7 ימים) EStim הוא הופסק. גישה זו של pretreating MSCs עם EStim כדי לשפר את הבידול osteogenic יכול לשמש כדי למטב את רקמת העצם הנדסה תוצאות הטיפול, לפיכך, לסייע להם לממש את הפוטנציאל הטיפולי מלאה שלהם. בנוסף יישום זה, הזה EStim תא תרבות קאמרית, פרוטוקול יכול לשמש גם כדי לחקור התנהגויות תא רגיש EStim אחרות, כגון העברה, התפשטות, אפופטוזיס מצורף לגרדום.

Introduction

עלייה טראומה ו/או פגמים הנוצרות על-ידי מחלת עצם מטופלים באמצעות צירופים שונים של טיפול בתאי וטכנולוגיות רפואה רגנרטיבית. MSCs הם התא לפי בחירה, טיפולים כאלה, בשל פעילות osteogenic יחסית גבוהה, בידוד, הרחבת והיעילות, בטיחות1. על מנת למקסם את הפעילות osteogenic שלהם, לכן, למטב את האפקטיביות הטיפולית שלהם, הוכנסו מספר שיטות לטיפול MSCs לפני השימוש בטיפולים אלה (כפי שנסקרו על ידי Mauney et al.2). שיטה אחת כזאת היא EStim, אשר הוכח לשפר MSC בידול osteogenic חוץ גופית3 ולקדם את עצם ריפוי ויוו4. למרות המספר הגדל והולך של לימודי התמקדות בטיפול MSCs עם EStim, משטר אופטימלית עבור למקסם את אפקט pro-osteogenic של EStim טרם מוגדר.

שיטות הפריה אחרות באמצעות EStim לנצל את גשרי מלח בתוך המדיום תרבות, המפריד בין תאים אלקטרודות מתכתי5. היתרון של זה היא כי אספקת EStim באמצעות גשרים מלח מבטלת המבוא של לוואי כימיות (למשל, קורוזיה של אלקטרודות מתכתי) שעשויים להיות ציטוטוקסיות. למרות יתרון זה, גשרי מלח הם מסורבלים כדי לעבוד עם, EStim הם מספקים שונה כי מודלים ויוו ונמסרו ב, ולכן קשה לתאם את התוצאות המתקבלות בעת שימוש את שתי המערכות. כיוונוני לספק EStim באמצעות אלקטרודות מתכתי או פחמן קבוע בתוך הבארות התרבות התא (כפי שנסקרו על ידי Hronik-Tupaj, קפלן6) כדאי לדמות התקנים המשמשים ויוו; עם זאת, התקנים אלה שקשה לנקות/לחטא בין שימושים, מספר התאים שניתן ללמוד לכל ניסוי מוגבל. תיכננו תא EStim המובאים כאן במיוחד כדי לטפל המגבלות של אלה כיוונונים אחרים. בעוד רוב הניסיון שלנו באמצעות לשכת EStim הזה כבר עם 2D ו 3D תרבויות המכיל מח עצם ושומן-רקמה-נגזר MSCs3,4, אחד היתרונות המרכזיים של החדר הזה זה תכליתי והוא, עם יחסית מינורי שינויים, ניתן להתאים ללמוד את סוגי תאים אחרים תחת מגוון תנאים שונים.

כאן נתאר את בניית חדר תרבות תא EStim; לאחר מכן, נדגים את השימוש בו על ידי MSCs בטיפול עם משטרי שונים של EStim ומדידת האפקט המתקבל על בידול osteogenic. בידול osteogenic MSC מוערך באמצעות התצהיר סידן פעילות פוספטאז אלקליין, ביטוי גנים סמן osteogenic. חשוב, ב עבר ניסויים בשימוש תוכנית התקנה זו, הבחנו כי השפעות פרו-osteogenic אלו נמשכות זמן רב לאחר הטיפול EStim הופסק.

Protocol

1. בנייה לשכת התרבות של גירוי חשמלי תא

  1. כדי לבנות תא EStim, לאסוף את העפעפיים שני לוחות תרבות תא 6-ובכן תקן; 99.99% פלטינה חוט, 60 ס"מ אורך בקוטר של 0.5-1 מ מ; חוט נחושת מצופה כסף, 70 ס מ אורך בקוטר 0.6 מ"מ; פלייר למהנדס חשמל; מלחם קיט; שפופרת אחת של דבק superconductive; חוט אחד מסוף לחסום מחבר, שישה קטנים 2.2 V נוריות (אופציונלי); שפופרת אחת של דבק סיליקון חלד ציפוי (אופציונלי); גליל אחד של סרט בידוד חשמלי שחור; תקן, גמיש, מבודדים נחושת חוט חשמלי (0.14 מ מ2), 2 מטר אורך (טבלה של חומרים).
  2. מכסה צלחת 6-ובכן, מארק, ואז תרגיל שני חורים (בקוטר של ~ 1 מ מ), 25 מ מ זו מזו, ליד הקצה החיצוני של כל אחד מששת בארות (12 חורים סה כ), כפי שמוצג איור 1A, B.
  3. חתך אורכי 12 5 ס מ של חוט פלטינה עם מגזריים. לכופף כל אחד החוטים ידנית לתוך צורת L, עוזב את קצה אחד ארוך 3 ס"מ וחותכים השני 2 ס מ. הכבל מצופים כסף לתוך שני אורכי 35 ס מ.
  4. להוסיף יותר זמן (3 ס"מ) כפוף סוף חוט פלטינה (מ פנימה להוציא) לתוך כל חור מסועף, להשאיר 1-2 מ מ בולטות מבחוץ של המכסה, לכופף אותו באמצעות מלקחיים. לאבטח את החוטים פלטינה החורים המכסה עם דבק superconductive ולהשאיר לו להתייבש במשך כ- 6 שעות.
  5. הלחמה קצות כל החוטים פלטינה 6 (זה מאוחר יותר לשמש cathodes, ראה איור 1A) מהעורקים עפעפיו לאחד החוטים מצופה כסף. חזור על הליך דומה הלחמה החוטים הנותרים פלטינה 6 (שישמש מאוחר יותר אנודות) לכבל אחרים מצופה כסף.
    1. הוסף נוריות במעגל בין כל אחת של שש אנודת-קטודה אלקטרודת פלטינה הזוגות, לאשר פונקציונליות במהלך הניסויים (אופציונלי). מניחים חתיכת סרט בידוד שחור תחת כל הוביל כדי למנוע חשיפת התאים צלחות תרבות נורית ה-LED (איור 1C).
  6. הדבק המחבר מסוף לחסום תיל כדי לפינה השמאלית העליונה של המכסה 6-ובכן צלחת וחבר שני חוטים מצופים כסף המסופים קלט, כפי שמוצג באיור 1C.
  7. לגזור מקטע 20 מ מ x 20 מ מ מהפינה השמאלית העליונה של מכסה 6-ובכן צלחת השני (איור 1B, המכסה Nr. 2) כדי להכיל את המחבר מסוף לחסום את המכסה הראשון. מכסה את המכסה הראשון, מצויד האלקטרודות, עם המכסה השני, להדביק אותם ביחד עם סרט דביק.
    1. כדי לשפר את התקשרות של הכיסוי שני, השתמש דבק סיליקון ציפוי (אופציונלי). כדי לעשות זאת, מכסה את המכסה עם האלקטרודות כסף עם 3-5 מ מ שכבה של דבק סיליקון, ולכסות המכסה אחרים, ומאפשר 12 שעות על הדבק להתייבש.
  8. חבר קצה אחד שני רגיל החוטים נחושת מבודד המסופים פלט של המחבר תיל ומסתיים אחרים למחברים זכר בננה (4 מ מ).
    הערה: אורך החוטים האלה תלוי המרחק מן המדף בחממה, שבו התאים יישמר, לספק הכוח, מחוץ החממה (איור 1D).
  9. להתאים את המינון (מתח), משטר של EStim להעביר התאים על ידי ויסות אספקת חשמל DC.
    1. הפעל את אספקת החשמל על-ידי לחיצה על כפתור ON/OFF בלוח הקדמי. להפעיל ערוץ 1 על ידי לחיצה על לחצן 1.
    2. הקש על לחצן Nr. 4 (V-set) כדי להגדיר את המתח. עיתונות כפתורים 2, . ו- 5 כדי להגדיר את הפלט טען ב- 2.5 (פ') הקש Enter.
    3. להבטיח כי הפלט עומס של 2.5 V (2,500 mV) מקביל EStim mV/מ"מ, לפי המשוואה הבאה, פשוטה.
      V EStim = figure-protocol-3169 ; או
      V = VEStim × d
      . הנה, V = מתח פלט במילי-ואטים; d = המרחק בין האלקטרודות במילימטרים; V EStim = המתח גירוי במילי-ואטים לכל מילימטר.
      הערה: פישוט זה חלה רק במקרה של מתח DC מתמדת. ההתנגדות בין המדיום לבין התאים הוא זניח כמו אלקטרודות שאינם נמצאים במגע ישיר עם התאים; במקום זאת, EStim מועבר לתאים דרך המדיום.

2. mesenchymal תא גזע תרבות osteogenic בינוני

  1. לרכוש ולאחסן MSCs עכברוש זמינים מסחרית (ראו טבלה של חומרים) בחנקן נוזלי עד היום של הניסוי. לחלופין, בידוד MSCs מבעלי חיים אחרים על פי פרוטוקולים שפורסם במקומות אחרים7,8 על פי תקנות מוסדיים מקומיים לשימוש של חיות ניסוי.
  2. ביום של הניסוי, להסיר את בקבוקון אחד (1 x 106 תאים) של MSCs האחסון חנקן נוזלי, במהירות (תוך 1 דקות) והפשרה של התאים בתוך אמבט מים טרופה על 37 מעלות צלזיוס.
    1. בתנאים סטריליים ב תא למינארי, pipette את התוכן המבחנה לתוך צינור בז ' 50 מל ' ולהוסיף 9 מיליליטר בינונית רגילה (ננומטר) prewarmed עד 37 ° C, המורכב בינוני הנשר של Dulbecco ששונתה (DMEM; 1 x) עם 10% לא פעיל חום העובר שור סרום (FBS) ו- 1% פתרון פניצילין/סטרפטומיצין. גלולה את התאים עבור 5 דקות על ידי צנטריפוגה ב x 300 גרם.
    2. תא למינארי, להסיר את תגובת שיקוע, בזהירות resuspend בגדר תא ב 12 מ של NM prewarmed ל- 37 מעלות צלזיוס. העבר את התאים resuspended בקבוקון התרבות של תאים T-75.
  3. התרבות התאים 37 ° C, 5% CO2, 5% O2 עד שיגיעו למפגש של 80% – 90% (לאחר כ 3-5 ימים).
  4. המעבר את התאים.
    הערה: ביצוע כל הפעולות מלבד צנטריפוגה הדגירה בתנאים סטריליים תא למינארי.
    1. כשמגיעים זרימה של 80% – 90%, לאחזר את התאים עם פתרון ניתוק התא. תשאף המדיום התרבות תאים, לשטוף 2 x עם 1 x באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS), הוסף 5 מ של 1 x פתרון ניתוק התא, וחוזרים התאים החממה במשך 5 דקות.
    2. ברגע התאים מנותקים, להוסיף כמות שווה של תרבות בינוני כדי להשבית את הפתרון ניתוק. לאסוף את התאים בשפופרת בז 50 מ ל, לסובב אותם ב 300 x גרם במשך 5 דקות.
    3. למחוק את המדיום, resuspend תאים 1 מ"ל של מדיום נורמלי טריים. להעריך את מספר התאים קיימא עם הכתם trypan blue.
    4. זרע עונה 1 פרק 106 תאים בבקבוקון T-75 חדש עם 12 מ של prewarmed ננומטר. התרבות התאים 37 ° C, 5% CO2, 5% O2 עד שיגיעו למפגש של 80% – 90%.
      הערה: תא passaging (צעדים 2.4.1–2.4.4) יכול לחזור כמה פעמים עד המספר הדרוש של תאים מתקבל. אל תשתמש שגילן עולה על המעבר 8 תאים.
  5. זרע 9 x 104 תאים ב- 3 מ"ל של NM (10% לא פעיל חום העובר שור סרום, 1% פניצילין/סטרפטומיצין, DMEM), כל טוב של צלחת 6-ובכן תרבות. דגירה התאים ליום 1-37 מעלות צלזיוס, 5% CO2, 5% O2.
  6. למחרת, תשאף תרבות בינוני ולהחיל 3 מ"ל של בידול osteogenic בינוני (אום; בינונית רגילה בתוספת 10-7 מ' דקסמטסון 10 מ מ β-glycerophosphate, מ מ 0.05 חומצה אסקורבית-2-פוספט).
  7. מקום 6-ובכן לצלחת עם תאים בחממה, דגירה 37 ° C, 5% CO2, 5% O2 בן לילה.

3. טיפול MSCs עם EStim

  1. ביום שהתאים מטופלים עם EStim, לעקר את האלקטרודות בפתרון אתנול 70% למשך 30 דקות; לאחר מכן, יבש אותם תחת אולטרא סגול בבטיחות בארון למשך 30 דקות נוספות.
  2. ב תא למינארי, לכסות את הצלחת 6-ובכן המכיל את MSCs תרבותי עם המכסה מצויד האלקטרודות, מוודא כי האלקטרודות לחלוטין טובע בינוני (אם יש צורך, להוסיף בינוני). להעביר את הצלחת 6-ובכן מקורה (EStim קאמרית) עם תאי החממה וחבר שלה חוטים לספק הכוח.
  3. הגדר את אספקת החשמל 2.5 V פלט טעינה ולפנק את התאים עם EStim עבור 1 h3,9.
  4. לאחר גירוי, נתק את אספקת החשמל, להסיר את התא EStim החממה. תחת תנאים סטריליים, להחליף את המכסה מצויד עם אלקטרודות עם מכסה תקן 6-ובכן צלחת.
  5. להחזיר את התאים החממה ולהשאיר אותם בן לילה. לנקות את האלקטרודות, תחילה עם PBS ולאחר מכן עם 70% אתנול פתרון. לנקות את המוצרים קורוזיה שהצטברו מהמשטח אלקטרודה עם נייר זכוכית עדין.
  6. חזור על שלבים 3.1 – 3.5 6 ימים רצופים. יום 4, לפני החלת EStim, תחת תנאים סטריליים, לשנות המדיום תרבות על-ידי כ רפה בעברית 1.5 מיליליטר בינוני והחלפתו 1.5 מיליליטר המפרך טרי prewarmed
  7. לאחר החלת EStim 7 ימים רצופים, לשמר את התאים בתרבות 7 ימים נוספים, להחלפת המדיום כל 3-4 ימים.

4. מדידות בידול osteogenic

  1. לנתח את השינויים מורפולוגיה תאים במיקרוסקופ.
  2. כדי להעריך את השפעת EStim על MSC בידול osteogenic, מדד סידן התצהיר, פעילות פוספטאז אלקליין osteogenic סמן ביטוי גנים, כפי שתואר במקומות אחרים3,9.

תוצאות

כדי להעריך את ההשפעה של 100 mV/מ מ EStim על הבידול osteogenic של MSCs, תאים שטופלו EStim עבור 3, 7, ו 14 ימים או nontreated (בקרה) נותחו ביום 14 של culturing על-ידי הערכת שינויים מורפולוגיים ומשקעים סידן (איור 2 ). הדבר נעשה על-ידי הדמיה תאים באמצעות מיקרוסקופיית שדה בהיר (מורפולוגיה שינוי...

Discussion

כאן נתאר הקמת תא, שיטה לטיפול בבעיות גזע mesenchymal עם EStim כי התוצאות התמיינות משופרת osteogenic.

הגדרת EStim שהוצגו לא דורשת ציוד/ידע מיוחד, יכול להתבצע בתוך מעבדה ביולוגיה/ביוכימיה סטנדרטי בתאי גזע על ידי החוקרים הצעירים. עם זאת, כאשר בונים ומפעילים תא EStim, טיפול מיוחד חייב להילקח מספר ?...

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgements

עבודה זו נתמך בחלקה של אאו גרנט סטארט-אפ של קרן (S-14-03 H) ושל קרן Friedrichsheim (Stiftung Friedrichsheim) ב פרנקפורט, גרמניה.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Estim fabrication
Banana connector/Jack adaptorPoppstars10085542 pieces
Cutting pliersKnipex78 03 125
DC power supply (0-30V/0-3A)B&K PrecisionModel 9130BAny simular model could be used
Insulated flexible wires (0.14 mm2)Conrad Electronic International604794, 6040932 pieces
Non-corrosive silicone rubberDow Corning3140 RTV*could be purchased by many stores
Platinum Wire (999,5/1000; 1mm ø)Junker Edelmetalle00D-30100.6 m needed for 1 Estim chamber
70% Ethanol solutionanySterilisation of Estim chamber
Silver coated copper wire (0.6 mm ø)Conrad Electronic International409334 - 62≈70 cm needed for 1 Estim device
Soldering iron SetConrad Electronic International1611410 - 62Any simular model could be used
TPP 6-well plate lidSigma-AldrichZ707759-126EA2 lids for Estim chamber
2.2V wired circular LEDsConrad Electronic International599525 - 626 pieces
UHU Super glueUHU GmbH & Co. KGn/a*could be purchased by many stores
MSC culture
β-Glycerophosphate disodium salt hydrateSigma-AldrichG9422osteogenic cell culture
DMEM, low glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvateThermo-Fischer Scientific21885025cell culture
DPBS, no calcium, no magnesiumThermo-Fischer Scientific14190144cell culture
DexamethasoneSigma-AldrichD4902osteogenic cell culture
Fetal Bovine SerumThermo-Fischer Scientific10500064cell culture
50 ml Falcon tubeSarstedt62,547,004cell culture
L-Ascorbic acidSigma-AldrichA4544osteogenic cell culture
Penicillin/StreptomycinThermo-Fischer Scientific15140122cell culture
Sprague-Dawley (SD) rat mesenchymal stem cells, bone marrow originCyagenRASMX-01001cell culture
Cell detachment solutionThermo-Fischer ScientificA1110501cell culture, cell detachment
TC Flask, T75Sarstedt833911302cell culture
TPP 6-well platesSigma-AldrichZ707759-126EAcell culture
Trypan Blue Dye, 0.4% solutionBio-Rad1450021cell count

References

  1. Oryan, A., Kamali, A., Moshiri, A., Baghaban Eslaminejad, M. Role of Mesenchymal Stem Cells in Bone Regenerative Medicine: What Is the Evidence?. Cells, Tissues, Organs. 204 (2), 59-83 (2017).
  2. Mauney, J. R., Volloch, V., Kaplan, D. L. Role of Adult Mesenchymal Stem Cells in Bone Tissue Engineering Applications: Current Status and Future Prospects. Tissue Engineering. 11 (5-6), 787-802 (2005).
  3. Mobini, S., Leppik, L., Thottakkattumana Parameswaran, V., Barker, J. H. In vitro effect of direct current electrical stimulation on rat mesenchymal stem cells. PeerJ. 5, e2821 (2017).
  4. Leppik, L., et al. Combining electrical stimulation and tissue engineering to treat large bone defects in a rat model. Scientific Reports. 8 (1), S1 (2018).
  5. Song, B., et al. Application of direct current electric fields to cells and tissues in vitro and modulation of wound electric field in vivo. Nature Protocols. 2 (6), 1479-1489 (2007).
  6. Hronik-Tupaj, M., Kaplan, D. L. A review of the responses of two- and three-dimensional engineered tissues to electric fields. Tissue Engineering. Part B, Reviews. 18 (3), 167-180 (2012).
  7. Huang, S., et al. An improved protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse bone marrow. Journal of Orthopaedic Translation. 3 (1), 26-33 (2015).
  8. Nau, C., et al. Tissue engineered vascularized periosteal flap enriched with MSC/EPCs for the treatment of large bone defects in rats. International Journal of Molecular Medicine. 39 (4), 907-917 (2017).
  9. Eischen-Loges, M., Oliveira, K. M. C., Bhavsar, M. B., Barker, J. H., Leppik, L. Pretreating mesenchymal stem cells with electrical stimulation causes sustained long-lasting pro-osteogenic effects. PeerJ. 6, 4959 (2018).
  10. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  11. Curtis, K. M., et al. EF1alpha and RPL13a represent normalization genes suitable for RT-qPCR analysis of bone marrow derived mesenchymal stem cells. BMC Molecular Biology. 11, 61 (2010).
  12. Wang, L., Li, Z. -. y., Wang, Y. -. p., Wu, Z. -. h., Yu, B. Dynamic Expression Profiles of Marker Genes in Osteogenic Differentiation of Human Bone Marrow-derived Mesenchymal Stem Cells. Chinese Medical Sciences Journal (Chung-kuo i hsueh k'o hsueh tsa chih). 30 (2), 108-113 (2015).
  13. Kim, H. B., Ahn, S., Jang, H. J., Sim, S. B., Kim, K. W. Evaluation of corrosion behaviors and surface profiles of platinum-coated electrodes by electrochemistry and complementary microscopy: biomedical implications for anticancer therapy. Micron. 38 (7), 747-753 (2007).
  14. Cho, Y., Son, M., Jeong, H., Shin, J. H. Electric field-induced migration and intercellular stress alignment in a collective epithelial monolayer. Molecular Biology of the Cell. , mbcE18010077 (2018).
  15. Tai, G., Tai, M., Zhao, M. Electrically stimulated cell migration and its contribution to wound healing. Burns & Trauma. 6, 20 (2018).
  16. Love, M. R., Palee, S., Chattipakorn, S. C., Chattipakorn, N. Effects of electrical stimulation on cell proliferation and apoptosis. Journal of Cellular Physiology. 233 (3), 1860-1876 (2018).
  17. Adams, D. S., Levin, M. General principles for measuring resting membrane potential and ion concentration using fluorescent bioelectricity reporters. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (4), 385-397 (2012).
  18. Jin, G., Li, K. The electrically conductive scaffold as the skeleton of stem cell niche in regenerative medicine. Materials Science & Engineering. C, Materials for Biological Applications. 45, 671-681 (2014).
  19. Hronik-Tupaj, M., Rice, W. L., Cronin-Golomb, M., Kaplan, D. L., Georgakoudi, I. Osteoblastic differentiation and stress response of human mesenchymal stem cells exposed to alternating current electric fields. Biomedical Engineering Online. 10, 9 (2011).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

143MSCosteogenic6

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved