JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Burada çeşitli elektriksel stimülasyon ve Osteojenik farklılaşma geliştirmek için mezenkimal kök hücre tedavisinde kullanımı yapan hücreleri göstermek için tasarlanmış bir hücre kültürü odası yapımı için bir iletişim kuralı mevcut.

Özet

Mezenkimal kök/stromal hücreler (MSCs) kapsamlı yaklaşımlar mühendislik dokusunda kemik iyileşmesine katkıda bulunmak üzere kullanılmaktadır. Elektriksel stimülasyon (EStim) kemik klinik ayarlarında şifa teşvik ve MSC Osteojenik farklılaşma tüp bebek artırmak için gösterilmiştir. Burada biz bir EStim hücre kültürü odası İnşaatı tarif ve tedavisinde kullanımı sıçan kemik iliği türevi MSC Osteojenik farklılaşma geliştirmek için. MSCs EStim ile 7 gün süreyle tedavi Osteojenik farklılaşma önemli bir artış sonuçlanır ve önemlisi, uzun (7 gün) EStim kesilir sonra bu pro osteojenik etkisi devam ederse bulduk. Bu yaklaşım ile EStim Osteojenik farklılaşma geliştirmek için MSCs pretreating, tedavi sonuçları mühendislik kemik dokusu optimize etmek ve böylece, onlara tam terapötik potansiyellerini elde etmenize yardımcı için kullanılabilir. Bu uygulamanın yanı sıra, bu EStim hücre kültürü odası ve iletişim kuralı da geçiş, nükleer silahların yayılmasına karşı apoptozis ve iskele eki gibi diğer EStim duyarlı hücre davranışlar araştırmak için kullanılabilir.

Giriş

Travma ve/veya hastalık kaynaklı kemik defektleri artış hücre tedavisi ve rejeneratif tıp teknolojileri farklı kombinasyonları kullanarak tedavi. MSCs onların nispeten yüksek osteojenik etkinlik, yalıtım ve genişleme verimlilik ve güvenlik1nedeniyle bu tür tedavi seçiminde hücreyiz. Osteojenik faaliyetlerini en üst düzeye çıkarmak ve böylece, tedavi edici etkinliği onların en iyi duruma getirmek için çeşitli Yöntemler (Mauney ve ark.2tarafından gözden olarak) önce bu tedaviler kullanımları MSCs işlemek için getirilmiştir. Bir tür vitro3 MSC Osteojenik farklılaşma geliştirmek ve kemik içinde vivo4şifa teşvik için gösterilen EStim yöntemdir. MSCs EStim ile tedavi üzerinde odaklanan çalışmalar giderek artan sayıda rağmen EStim'ın pro osteojenik etkisi maksimize etmek için en uygun bir rejimi henüz tanımlanması gerekir.

EStim kullanarak diğer tüp bebek yöntemleri tuz köprüleri hücreleri metalik elektrotlar5' ten ayıran kültür orta sular altında kullanmak. Bunun yararı EStim tuz köprüler teslim sitotoksik olabilir kimyasal yan (Örneğin, korozyon metalik elektrot) getirilmesi ortadan kaldırır olduğunu. Bu avantaj rağmen tuz köprüleri ile çalışmak için hantal ve dağıttıkları EStim iki sistem kullanırken elde edilen sonuçlar ilişkilendirmek üzere o içinde teslim edilen içinde vivo modellerden farklıdır. Hücre kültür kuyu içinde sabit metalik veya karbon elektrotlar ile EStim teslim kurulumları (Hronik-Tupaj ve Kaplan6tarafından gözden olarak) daha iyi vivo içinde kullanılan aygıtlar simülasyonu; Ancak, bu cihazların temiz/kullanır arasında sterilize etmek zor ve deney okudu hücre sayısı sınırlıdır. Burada özellikle bu diğer ayarlar sınırlamaları gidermek için sunulan EStim odası dizayn ettik. Çoğu bu EStim odası kullanarak deneyimi ile 2D ve 3D kültürler, kemik iliği ve yağ-doku-kaynaklı MSCs3,4içeren bir önemli yararı bu odası bu iken bu çok yönlü ve, nispeten küçük değişiklikleri, diğer hücre tipleri farklı koşullarda çeşitli altında çalışmaya adapte olabilir.

Burada biz bir EStim hücre kültürü odası İnşaatı tarif; o zaman, biz kullanımı EStim ve Osteojenik farklılaşma ortaya çıkan etkisini ölçme farklı rejimleri ile tedavi MSCs tarafından göstermek. MSC Osteojenik farklılaşma kalsiyum birikimi, alkalen fosfataz aktivitesi ve osteojenik marker gen ekspresyonu ile değerlendirilir. Önemlisi, bu kurulum programı, kullanılan deneyler biz uzun EStim tedavi kesildi sonra bu pro osteojenik efektleri geçerli gözlenen.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

1. inşaat elektrik stimülasyonu hücre kültürü odası

  1. EStim odası kurmak için Standart 6-şey hücre kültür plakaların iki kapakları toplamak; % 99.99 platin tel, 60 cm çapında uzunluğu 0,5-1 mm; gümüş kaplı bakır tel, 70 cm 0.6 mm çapında uzunluğundadır; kesmek kerpeteni; Havya Seti; bir tüp dinamiğinin tutkal; bir kablo terminal bloğu bağlayıcı, (isteğe bağlı); altı küçük 2,2 V LED bir tüp küflenmez silikon yapıştırıcı kaplama (isteğe bağlı); bir rulo siyah elektrikli yalıtım bant; Standart, esnek, bakır elektrik tel (0.14 mm2), 2 m uzunluğunda (tablo malzemelerin) izole.
  2. 6-şey plaka kapak, mark ve sonra matkap iki delik (~ 1 mm çaplı), 25 mm ayrı, her altı dış kenarı 1A, B şekilgösterildiği gibi (Toplam 12 delikli), Kuyu yapımı.
  3. On iki 5 cm uzunlukta platin tel kesme pense ile kesti. Tel el ile şekle bir L-bir ucundan 3 cm uzunluğunda bırakarak, her viraj ve diğer 2 cm. iki 35 cm boy içine gümüş kaplı tel kesme.
  4. Bir platin kablo daha uzun (3 cm) bükülmüş ucunu bağlayın (--dan iç dışarı) her delinmiş deliğe forseps kullanarak viraj 1-2 mm kapak, dışarıdan çıkıntılı bırakarak. Platin tel dinamiğinin tutkal ile kapak delik güvenli ve yaklaşık 6 h kurumaya bırakın.
  5. İpuçları (Bu daha sonra katotlar hizmet, 1A anlamayagörmek) tüm altı platin tel lehim gümüş kaplı teller birine kapakları çıkıntılı. (Daha sonra anotlar görev yapacak) kalan altı platin teller lehim aynı işlemi diğer gümüş kaplı tel için tekrarlayın.
    1. LED devre her işlevsellik (isteğe bağlı) deneyler sırasında onaylamak için altı anot-katot platin elektrot çiftleri arasında ekleyin. Siyah izolasyon bandı her kültür tabakaları bana LED ışık (Şekil 1 c) hücrelerde maruz önlemek için liderliğindeki altında bir parça yerleştirin.
  6. 6-şey plaka kapak sol üst köşesine tel terminal bloğu konektöre tutkal ve her iki gümüş kaplı teller Şekil 1 cgösterildiği gibi giriş terminallere bağlayın.
  7. Bir ikinci 6-şey plaka kapak (Şekil 1B, kapak Nr. 2) ilk kapak terminal bloğu konektörüne karşılamak için bir 20 x 20 mm bölümünü sol üst üzerinden kesip. İlk kapağı ikinci kapak ile elektrotlar ile donatılmış, kapak ve yapışkan bant ile birlikte bant.
    1. İki kapak yapıştırma geliştirmek için (isteğe bağlı) kaplama silikon yapıştırıcı kullanın. Bunu yapmak için kapak silikon yapıştırıcı 3-5 mm tabakası ile gümüş elektrotlar ile kapak ve kuruması yapıştırıcı için 12 h sağlayan diğer kapak ile yeterli.
  8. Bir ucunu iki standart yalıtılmış bakır tel tel bağlayıcı ve muz erkek Rakorlar (4 mm) diğer biter çıkış terminallere bağlayın.
    Not: Nerede hücreleri, güç kaynağı, inkübatör (Şekil 1 d) dışında için tutulacaktır mesafe kuluçka raf bu kabloların uzunluğu bağlıdır.
  9. Doz (gerilim) ve DC güç kaynağı düzenleyerek hücrelere teslim EStim rejimi ayarlayın.
    1. Güç kaynağı ön panelde ON/OFF düğmesine basarak kapatın. Kanal 1 buton 1basarak etkinleştirin.
    2. Gerilim ayarla düğmesini Nr. 4 (V-set) tuşuna basın. Basın düğmeleri 2, . ve yük çıkış 2.5 V. basın Enterayarlamak için 5 .
    3. 2,5 V yük çıkışını sağlamak (2.500 mV) 100 mV/mm, bir EStim için aşağıdaki, Basitleştirilmiş denklem göre karşılık gelir.
      V EStim = figure-protocol-3598 ; veya
      V = VEStim × d
      Burada, V = millivolts; çıkış güç besleme gerilimi d = milimetre; elektrot arasındaki mesafe V EStim stimülasyon gerilim Milivolt olarak milimetre başına =.
      Not: Bu basitleştirme yalnızca sabit DC voltaj durumunda geçerlidir. Elektrotlar hücreleri ile doğrudan temas değildir olarak orta ve hücreler arasında direnç düzeydedir; Bunun yerine, EStim hücreleri vasıtasıyla teslim edilir.

2. osteojenik orta mezenkimal kök hücre kültüründe

  1. Satın almak ve ticari olarak mevcut fare MSCs ( Tablo malzemelerigörmek) sıvı azot içinde deneme güne kadar saklayın. Alternatif olarak, izole MSCs protokolleri göre diğer hayvanlardan başka bir yerde7,8 deneysel hayvan kullanımı için yerel kurumsal düzenlemelerine uygun olarak yayınlandı.
  2. Deneme günü, bir şişe (1 x 106 hücreler) MSCs sıvı azot depolama biriminden çıkarın ve hızlı bir şekilde (1 içinde) 37 ° C'ye ısıtılmış bir su banyosu hücrelerde tezcan
    1. Steril koşullarda laminar akış başlıklı 50 mL şahin tüp içine şişe içeriği pipette ve % 10 ısı inaktive fetal Sığır serum (FBS) ve % 1 ile 9 mL normal Orta (NM) 37 ° C, Dulbecco'nın değiştirilmiş kartal Orta (DMEM; 1 x) oluşan prewarmed ekleyin penisilin/streptomisin çözüm. 5 min için hücreleri tarafından Santrifüjü 300 x gde cips.
    2. Laminar akış başlıklı süpernatant kaldırmak ve dikkatle 37 ° C'ye prewarmed NM 12 ml hücre Pelet resuspend Resuspended hücreleri bir T-75 hücre kültür şişesi aktarın.
  3. (Yaklaşık 3-5 gün sonra) bir % 80-%90 izdiham ulaşana kadar 37 ° C, % 5 CO2, %5 O2 hücre kültür.
  4. Hücreleri geçiş.
    Not: bir laminar akış mahallede Santrifüjü ve steril koşullarda kuluçka hariç tüm işlemleri gerçekleştirir.
    1. Bir % 80-%90 izdiham ulaştıktan sonra hücre hücre dekolmanı çözümü ile almak. Hücre kültür orta Aspire edin, 2 x 1 x fosfat tamponlu tuz (PBS) ile yıkayın, 5 mL 1 x hücre dekolmanı çözümü ekleyin ve 5 min için kuluçka hücreleri geri dönün.
    2. Sonra hücreleri ayrılır, kültür dekolmanı çözüm devre dışı bırakabilirsiniz için orta eşit miktarda ekleyin. 50 mL şahin tüp hücrelerde toplamak ve onları vasıl 300 x g 5 min için spin.
    3. Orta atın ve 1 mL taze normal Orta hücrelerde resuspend. Trypan mavi leke ile hücrelerin sayısını değerlendirmek.
    4. 1 x 106 hücre içinde yeni bir T-75 şişesi 12 mL prewarmed NM ile tohum. Onlar bir % 80-%90 izdiham ulaşana kadar 37 ° C, % 5 CO2, %5 O2 hücre kültür.
      Not: hücre gerekli sayısı elde edilir kadar hücre passaging (adımları 2.4.1–2.4.4) bir kaç kez tekrar edilebilir. Hücreleri geçiş 8 büyük kullanmayın.
  5. Tohum 9 x 104 NM (% 10 ısı inaktive fetal Sığır serum, % 1 penisilin/streptomisin, DMEM) 6-şey kültür plaka her iyi 3 mL hücrelerde. Hücreleri 37 ° C, % 5 CO2, %5 O21 gün kuluçkaya.
  6. Ertesi gün, kültür orta Aspire edin ve Osteojenik farklılaşma Orta (OM; normal Orta 10-7 M deksametazon, 10 mM β-gliserofosfat ve 0.05 mM askorbik asit-2-fosfat ile desteklenmiş) 3 mL uygulayın.
  7. 6-şey plaka hücrelerle da kuluçka makinesine koyun ve 37 ° C, % 5 CO2, %5 O2 bir gecede kuluçkaya.

3. tedavi MSCs ile EStim

  1. Hücreleri EStim ile tedavi edilir günde 30 dk için % 70 etanol çözümde elektrotlar sterilize; o zaman, UV ışığı bir güvenlik için ek bir 30 dk Kabin altında Kuru onları.
  2. Bir laminar akış başlık, elektrotlar tamamen ortamda batık emin elektrotlar ile donatılmış kapaklı kültürlü MSCs içeren 6-şey plaka kapak (gerekirse, orta ekleyin). Kuluçka makinesi için hücreleri ile kapalı 6-şey plaka (EStim odası) aktarmak ve onun teller güç kaynağını bağlayın.
  3. Güç kaynağı 2.5 V yük çıktısına ayarla ve 1 h3,9EStim hücrelerle tedavi.
  4. Stimülasyon sonra güç kaynağı bağlantısını kesin ve EStim odası da kuluçka kaldırın. Steril koşullarda, elektrotlar Standart 6-şey plaka kapak ile donatılmış kapak değişimi.
  5. Hücreleri için kuluçka dönün ve gece bırakın. Elektrotlar, ilk PBS ve daha sonra ile % 70 etanol çözüm temiz. Birikmiş korozyon ürünleri ince zımpara kağıdı ile elektrot yüzeyinden temizlemek.
  6. 3.1-3.5 6 gün boyunca yineleyin. Günde 4, EStim uygulamadan önce ve steril koşullarda kültür orta orta 1,5 mL alıyorum ve prewarmed taze OM 1,5 mL ile değiştirerek değiştirin.
  7. EStim 7 gün üst üste uygulandıktan sonra hücre kültüründe bir izleyen 7 gün boyunca orta her 3-4 gün alışverişi korumak.

4. Osteojenik farklılaşma ölçümleri

  1. Hücre morfolojisi değişiklikleri bir mikroskop altında analiz.
  2. Olarak EStim MSC Osteojenik farklılaşma, ölçü kalsiyum birikimi, alkalen fosfataz aktivitesi ve osteojenik marker gen ekspresyonu üzerindeki etkisini değerlendirmek için başka bir3,9bölümünde.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

100 mV/mm EStim MSCs, hücreleri ile EStim 3 için tedavi Osteojenik farklılaşma üzerinde etkisini değerlendirmek için 7 ve 14 gün veya nontreated (kontrol) analiz tarafından değerlendirilmesi morfolojik değişiklikler ve kalsiyum birikimi (Şekil 2 kültür, 14 gün ). Bu parlak alan mikroskobu (morfoloji değişiklikleri) kullanarak hücreleri görüntüleme veya % 4 paraformaldehyde çözüm hücrelerde sabitleme, onları %0.02 alizarin kırmızı...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Burada bir odası ve gelişmiş Osteojenik farklılaşma sonuçları EStim ile mezenkimal kök hücre tedavisi için bir yöntem açıklanmaktadır.

Sunulan EStim Kur özel ekipman/bilgi gerektirmez ve bir standart kök hücre biyolojisi/Biyokimya laboratuarında genç araştırmacılar tarafından gerçekleştirilebilir. Ancak, ne zaman bina ve EStim odası kullanarak, kritik bir kaç adımda özel bakım alınmalıdır. Bu metal çok yumuşak ve hassas olduğu gibi platin elektrotlar işlerk...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

Bu eser kısmen bir AO Vakfı Start-Up hibe (S-14-03 H) ve Friedrichsheim Frankfurt am Main, Almanya tabanlı Vakfı (Stiftung Friedrichsheim) tarafından desteklenmiştir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Estim fabrication
Banana connector/Jack adaptorPoppstars10085542 pieces
Cutting pliersKnipex78 03 125
DC power supply (0-30V/0-3A)B&K PrecisionModel 9130BAny simular model could be used
Insulated flexible wires (0.14 mm2)Conrad Electronic International604794, 6040932 pieces
Non-corrosive silicone rubberDow Corning3140 RTV*could be purchased by many stores
Platinum Wire (999,5/1000; 1mm ø)Junker Edelmetalle00D-30100.6 m needed for 1 Estim chamber
70% Ethanol solutionanySterilisation of Estim chamber
Silver coated copper wire (0.6 mm ø)Conrad Electronic International409334 - 62≈70 cm needed for 1 Estim device
Soldering iron SetConrad Electronic International1611410 - 62Any simular model could be used
TPP 6-well plate lidSigma-AldrichZ707759-126EA2 lids for Estim chamber
2.2V wired circular LEDsConrad Electronic International599525 - 626 pieces
UHU Super glueUHU GmbH & Co. KGn/a*could be purchased by many stores
MSC culture
β-Glycerophosphate disodium salt hydrateSigma-AldrichG9422osteogenic cell culture
DMEM, low glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvateThermo-Fischer Scientific21885025cell culture
DPBS, no calcium, no magnesiumThermo-Fischer Scientific14190144cell culture
DexamethasoneSigma-AldrichD4902osteogenic cell culture
Fetal Bovine SerumThermo-Fischer Scientific10500064cell culture
50 ml Falcon tubeSarstedt62,547,004cell culture
L-Ascorbic acidSigma-AldrichA4544osteogenic cell culture
Penicillin/StreptomycinThermo-Fischer Scientific15140122cell culture
Sprague-Dawley (SD) rat mesenchymal stem cells, bone marrow originCyagenRASMX-01001cell culture
Cell detachment solutionThermo-Fischer ScientificA1110501cell culture, cell detachment
TC Flask, T75Sarstedt833911302cell culture
TPP 6-well platesSigma-AldrichZ707759-126EAcell culture
Trypan Blue Dye, 0.4% solutionBio-Rad1450021cell count

Referanslar

  1. Oryan, A., Kamali, A., Moshiri, A., Baghaban Eslaminejad, M. Role of Mesenchymal Stem Cells in Bone Regenerative Medicine: What Is the Evidence? Cells, Tissues, Organs. 204 (2), 59-83 (2017).
  2. Mauney, J. R., Volloch, V., Kaplan, D. L. Role of Adult Mesenchymal Stem Cells in Bone Tissue Engineering Applications: Current Status and Future Prospects. Tissue Engineering. 11 (5-6), 787-802 (2005).
  3. Mobini, S., Leppik, L., Thottakkattumana Parameswaran, V., Barker, J. H. In vitro effect of direct current electrical stimulation on rat mesenchymal stem cells. PeerJ. 5, e2821(2017).
  4. Leppik, L., et al. Combining electrical stimulation and tissue engineering to treat large bone defects in a rat model. Scientific Reports. 8 (1), S1(2018).
  5. Song, B., et al. Application of direct current electric fields to cells and tissues in vitro and modulation of wound electric field in vivo. Nature Protocols. 2 (6), 1479-1489 (2007).
  6. Hronik-Tupaj, M., Kaplan, D. L. A review of the responses of two- and three-dimensional engineered tissues to electric fields. Tissue Engineering. Part B, Reviews. 18 (3), 167-180 (2012).
  7. Huang, S., et al. An improved protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse bone marrow. Journal of Orthopaedic Translation. 3 (1), 26-33 (2015).
  8. Nau, C., et al. Tissue engineered vascularized periosteal flap enriched with MSC/EPCs for the treatment of large bone defects in rats. International Journal of Molecular Medicine. 39 (4), 907-917 (2017).
  9. Eischen-Loges, M., Oliveira, K. M. C., Bhavsar, M. B., Barker, J. H., Leppik, L. Pretreating mesenchymal stem cells with electrical stimulation causes sustained long-lasting pro-osteogenic effects. PeerJ. 6, 4959(2018).
  10. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), San Diego, CA. 402-408 (2001).
  11. Curtis, K. M., et al. EF1alpha and RPL13a represent normalization genes suitable for RT-qPCR analysis of bone marrow derived mesenchymal stem cells. BMC Molecular Biology. 11, 61(2010).
  12. Wang, L., Li, Z. -y, Wang, Y. -p, Wu, Z. -h, Yu, B. Dynamic Expression Profiles of Marker Genes in Osteogenic Differentiation of Human Bone Marrow-derived Mesenchymal Stem Cells. Chinese Medical Sciences Journal (Chung-kuo i hsueh k'o hsueh tsa chih). 30 (2), 108-113 (2015).
  13. Kim, H. B., Ahn, S., Jang, H. J., Sim, S. B., Kim, K. W. Evaluation of corrosion behaviors and surface profiles of platinum-coated electrodes by electrochemistry and complementary microscopy: biomedical implications for anticancer therapy. Micron. 38 (7), Oxford, UK. 747-753 (2007).
  14. Cho, Y., Son, M., Jeong, H., Shin, J. H. Electric field-induced migration and intercellular stress alignment in a collective epithelial monolayer. Molecular Biology of the Cell. , mbcE18010077(2018).
  15. Tai, G., Tai, M., Zhao, M. Electrically stimulated cell migration and its contribution to wound healing. Burns & Trauma. 6, 20(2018).
  16. Love, M. R., Palee, S., Chattipakorn, S. C., Chattipakorn, N. Effects of electrical stimulation on cell proliferation and apoptosis. Journal of Cellular Physiology. 233 (3), 1860-1876 (2018).
  17. Adams, D. S., Levin, M. General principles for measuring resting membrane potential and ion concentration using fluorescent bioelectricity reporters. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (4), 385-397 (2012).
  18. Jin, G., Li, K. The electrically conductive scaffold as the skeleton of stem cell niche in regenerative medicine. Materials Science & Engineering. C, Materials for Biological Applications. 45, 671-681 (2014).
  19. Hronik-Tupaj, M., Rice, W. L., Cronin-Golomb, M., Kaplan, D. L., Georgakoudi, I. Osteoblastic differentiation and stress response of human mesenchymal stem cells exposed to alternating current electric fields. Biomedical Engineering Online. 10, 9(2011).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Biyom hendisliksay 143elektriksel stim lasyon odash cre k lt rMSCOsteojenik farkl la mado ru ak m6 ey plaka

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır