Construção e utilização de uma câmara de estimulação elétrica para reforçar a diferenciação osteogênica em células estromais/tronco mesenquimais em Vitro

Resumo

Aqui nós apresentamos um protocolo para a construção de uma câmara de cultura celular projetada para expor as células de vários tipos de estimulação elétrica e sua utilização no tratamento de células-tronco mesenquimais para realçar a diferenciação osteogênica.

Resumo

Células tronco mesenquimais/estromal (MSCs) têm sido amplamente utilizadas para promover a consolidação óssea em abordagens de engenharia de tecidos. Estimulação elétrica (EStim) tem demonstrada aumentar a diferenciação osteogênica de MSC in vitro e promover a consolidação óssea em situações clínicas. Aqui descrevemos a construção de uma câmara de cultura de células de EStim... e sua utilização no tratamento de rato osso-medula-derivado MSC para realçar a diferenciação osteogênica. Descobrimos que tratar MSCs com EStim durante 7 dias resulta em um aumento significativo na diferenciação osteogênica, e importante, este efeito pro-osteogênica persiste muito tempo depois (7 dias) EStim é descontinuado. Esta abordagem de pretreating MSCs com EStim para realçar a diferenciação osteogênica poderia ser usada para otimizar os resultados do tratamento de engenharia de tecido ósseo e, assim, ajudá-los a alcançar o seu potencial terapêutico completo. Além desta aplicação, esta câmara de cultura de células de EStim e protocolo também podem ser usados para investigar outros comportamentos de célula EStim-sensíveis, tais como a migração, proliferação, apoptose e acessório do andaime.

Introdução

Um aumento no trauma e/ou defeitos ósseos induzida por doença estão sendo tratados usando diferentes combinações de terapia celular e tecnologias de medicina regenerativa. MSCs são a célula de escolha em tais tratamentos, devido à sua relativamente alta atividade osteogênica, isolamento e expansão de eficiência e segurança¹. Para maximizar sua atividade osteogênica e, assim, otimizar sua eficácia terapêutica, foram introduzidos vários métodos para manipular MSCs antes da sua utilização nestes tratamentos (como comentado por Mauney et al.²). Um tal método é EStim, que foi mostrado para aumentar a diferenciação osteogênica do MSC em vitro³ e promover a consolidação em vivo⁴. Apesar do crescente número de estudos com foco em tratamento MSCs com EStim, um regime ideal para maximizar o efeito de pro-osteogênica do EStim ainda tem de ser definido.

Outros métodos in vitro usando EStim utilizam sal pontes submergidas em meio de cultura, que separa as células dos eletrodos metálicos⁵. A vantagem desta é que entregar EStim através de pontes de sal elimina a introdução de subprodutos químicos (por exemplo, corrosão dos eletrodos metálicos) que podem ser citotóxicos. Apesar desta vantagem, pontes de sal são complicados para trabalhar com, e entregam a EStim difere que entregue em modelos in vivo, tornando difícil correlacionar os resultados obtidos ao utilizar os dois sistemas. Configurações que entregam EStim via eletrodos metálicos ou carbono fixados dentro dos poços de cultura celular (como revisto por Hronik-Tupaj e Kaplan⁶) melhor simulam dispositivos utilizados no vivo; no entanto, esses dispositivos são difíceis de limpar/esterilizar entre usos e o número de células que podem ser estudadas por experiência é limitado. Nós projetamos a câmara EStim apresentada aqui especificamente para resolver as limitações destas outras configurações. Enquanto a maioria da nossa experiência usando esta câmara EStim foi com 2D e 3D culturas contendo medula óssea e adiposo tecido-derivada de MSCs^3,4, a principal vantagem desta câmara é que é versátil e, com menor relativamente alterações, pode ser adaptado para outros tipos de células sob uma variedade de diferentes condições de estudar.

Aqui descrevemos a construção de uma câmara de cultura de células de EStim; Então, vamos demonstrar a sua utilização por tratados MSCs com diferentes regimes de EStim e medir o efeito resultante na diferenciação osteogênica. Diferenciação osteogênica MSC é avaliada através de deposição de cálcio, atividade da fosfatase alcalina e expressão de gene marcador osteogênica. Importante, no passado experiências que usou esta configuração, observou-se que estes efeitos pro-osteogênica persistirem muito tempo depois foi descontinuado o tratamento de EStim.

Protocolo

1. construção da câmara de cultura de células de estimulação elétrica

1. Para construir a câmara EStim, coletar duas tampas das placas de cultura padrão 6-poços de célula; fio de 99,99% de platina, 60 cm de comprimento com um diâmetro de 0,5 a 1 mm; fio de cobre revestido de prata, 70 cm de comprimento com um diâmetro de 0,6 mm; alicate de corte; kit de ferro de soldar; um tubo de cola supercondutor; conector de bloco de terminais de um fio, seis pequenos 2,2 V diodos emissores de luz (opcional); um tubo de adesivo de silicone não corrosivo do revestimento (opcional); um rolo de fita de isolamento eléctrico preto; padrão, flexível, isolado cobre fio elétrico (0,14 mm²), 2 m de comprimento (tabela de materiais).
2. Em uma tampa de 6 placa, marca e em seguida faça dois furos (com um diâmetro de ~ 1 mm), 25 mm separado, perto da borda externa de cada um dos seis poços (12 furos no total), como mostrado na figura 1A, B.
3. Corte 12 comprimentos de 5 cm de fio de platina com alicate de corte. Dobre cada um dos fios manualmente em uma L-forma, deixando uma ponta de 3 cm de comprimento e os outros 2 cm. cortar o fio de prata-revestido em dois comprimentos de 35 cm.
4. Inserir a extremidade (3 cm) mais em de um fio de platina (de dentro para fora) em cada furo, deixando 1-2 mm salientes do lado de fora da tampa, dobrá-lo usando fórceps. Prenda os fios de platina nos furos da tampa com cola supercondutor e deixe-o secar por cerca de 6 h.
5. Solde as pontas de todos os seis fios de platina (que mais tarde vai servir como catodos, ver figura 1A) salientes das tampas para um dos fios prata-revestido. Repita o mesmo procedimento, soldar os fios de platina seis restantes (que mais tarde servirá como ânodos) para o outro fio prata-revestido.
   1. Adicione LEDs no circuito entre cada um dos seis pares de eletrodo de platina de ânodo-cátodo, para confirmar a funcionalidade durante os experimentos (opcionais). Coloque um pedaço de fita de isolamento preto no âmbito de cada LED para evitar expor as células nas placas de cultura para o diodo emissor de luz (Figura 1).
6. O conector de bloco terminal do fio para o canto superior esquerdo da tampa 6 placa de cola e conecte os dois fios de prata-revestido para os terminais de entrada, como mostrado na Figura 1.
7. Corte uma seção de 20 x 20 mm do canto superior esquerdo de uma segunda tampa de 6 placa (figura 1B, tampa Nr. 2) para acomodar o conector de bloco terminal da tampa primeiro. Cubra a tampa primeira, equipada com os eléctrodos, com a segunda tampa e gravá-los em conjunto com fita adesiva.
   1. Para melhorar a ligação das duas tampas, use adesivo de silicone, revestimento (opcional). Para fazer isso, cobrir a tampa com os eletrodos de prata com uma camada de 3 a 5 mm de adesivo de silicone e cubra com a outra tampa, permitindo 12 h para a cola secar.
8. Conecte uma extremidade das dois fios de cobre isolados padrão para os terminais de saída do conector de fio e outras extremidades com conectores machos de banana (4 mm).
   Nota: O comprimento destes fios depende da distância da prateleira na incubadora, onde as células serão mantidas, a fonte de alimentação, fora da incubadora (Figura 1).
9. Ajustar a dosagem (tensão) e regime de EStim entregue para as células, regulando a alimentação de DC.
   1. Ligue o fornecimento de energia, pressionando o botão ON/OFF no painel frontal. Ative o canal 1, pressionando o botão 1.
   2. Pressione o botão Nr. 4 (V-set) para definir a tensão. Pressione botões 2, . e 5 para definir a saída de carga de 2,5 V. Pressione Enter.
   3. Certifique-se de que a saída de carga de 2,5 V (2.500 mV) corresponde a uma EStim de 100 mV/mm, de acordo com a equação seguinte, simplificada.
      V _EStim = ; ou
      V = V_EStim × d
      Aqui, V = tensão de alimentação de saída em milivolts; d = distância entre os eléctrodos em milímetros; V _EStim = a tensão de estimulação em milivolts por milímetro.
      Nota: Esta simplificação aplica-se somente em caso de tensão DC constante. A resistência entre o meio e as células é insignificante como eletrodos não estão em contacto directo com as células; em vez disso, EStim é entregue para as células através do meio.

2. mesenquimais de células estaminais cultura osteogênica médio

1. Comprar e armazenar MSCs rato comercialmente disponíveis (ver Tabela de materiais) em nitrogênio líquido, até o dia do experimento. Alternativamente, MSCs de isolado de outros animais de acordo com protocolos publicados noutro local^7,8 , em conformidade com os regulamentos institucionais locais para o uso de animais experimentais.
2. No dia do experimento, remover (1 x 10⁶ células), um frasco de MSCs do armazenamento de nitrogênio líquido e rapidamente (dentro de 1 min) descongelar as células em um banho de água pré-aquecida a 37 ° C.
   1. Sob condições estéreis de um capuz de fluxo laminar, pipetar o conteúdo do frasco para um tubo falcon de 50ml e adicionar 9 mL do meio normal (NM) pré-aquecido a 37 ° C, constituído por meio da águia modificados de Dulbecco (DMEM; 1 x) com 10% inactivadas pelo calor fetal de soro bovino (FBS) e 1% solução de penicilina/estreptomicina. Granule as células por 5 min por centrifugação a 300 x g.
   2. Em uma capa de fluxo laminar, remover o sobrenadante e cuidadosamente Ressuspender as células em 12 mL de NM pré-aquecido a 37 ° C. Transferi as células ressuspensa para um frasco de cultura de células T-75.
3. Cultura de células em 37 ° C, 5% de CO₂, 5% O₂ até atingirem uma confluência de 80%-90% (aproximadamente após 3-5 dias).
4. Passagem das células.
   Nota: Realizar todas as operações exceto centrifugação e incubação em condições estéreis de um capuz de fluxo laminar.
   1. Depois de atingir uma confluência de 80%-90%, recupere as células com solução de desprendimento de células. Aspire o meio de cultura celular, lave 2 x com 1 x fosfato salino (PBS), adicionar 5 mL de 1 x solução de desprendimento de célula e retornar as células para a incubadora por 5 min.
   2. Uma vez que as células são desanexadas, adicione uma quantidade igual de meio de cultura para inactivar a solução de desprendimento. Coletar as células em um tubo falcon de 50ml e girá-los a 300 x g por 5 min.
   3. Descartar o meio e ressuspender as células em 1 mL de meio fresco normal. Avalie o número de células viáveis com mancha azul trypan.
   4. Semente de 1 x 10⁶ células em balão T-75 novo com 12 mL de NM escaldada. Cultura de células em 37 ° C, 5% de CO₂, 5% O₂ até atingirem uma confluência de 80%-90%.
      Nota: Célula passagem (etapas 2.4.1–2.4.4) pode ser repetido várias vezes até o número necessário de células é obtido. Não use mais de passagem 8 células.
5. Semente 9 x 10⁴ células em 3 mL de NM (10% inactivadas pelo calor fetal de soro bovino, 1% penicilina/estreptomicina, DMEM) em cada poço de uma placa de cultura de 6-poços. Incube as celulas para 1 dia em 37 ° C, 5% de CO₂, 5% O₂.
6. No dia seguinte, Aspire o meio de cultura e aplicar 3 mL de meio de diferenciação osteogênica (OM; normal suplementado com 10^-7 M dexametasona, β-glicerofosfato de 10 mM e 0,05 mM de ácido ascórbico-2-fosfato).
7. Coloque a placa de 6 com células na incubadora e incubar a 37 ° C, 5% de CO₂, 5% O₂ durante a noite.

3. tratamento de MSCs com EStim

1. No dia em que as células são tratadas com EStim, esterilizar os eletrodos em solução de etanol 70% por 30 min; em seguida, seque-os à luz numa câmara de segurança para um adicional 30 min UV.
2. Em uma capa de fluxo laminar, cobrir a placa de 6 contendo os MSCs cultivadas com a tampa equipada com os eléctrodos, certificando-se de que os eléctrodos estão completamente submersos no meio (se necessário, adicione médio). Transferir a placa 6-poços coberta (EStim câmara) com as células para a incubadora e conectar seus arames para fonte de alimentação.
3. Definir a fonte de alimentação para saída de carga 2,5 V e tratar as células com EStim para 1h^3,9.
4. Após a estimulação, desconecte a fonte de alimentação e remova a câmara de EStim da incubadora. Sob condições estéreis, troca a tampa equipada com eléctrodos com uma tampa da placa padrão 6.
5. Retorno das células para a incubadora e deixá-los durante a noite. Limpe os eléctrodos, primeiro com PBS e, em seguida, com solução de etanol a 70%. Limpe os produtos de corrosão acumulada da superfície do eletrodo com uma lixa fina.
6. Repita as etapas 3.1-3.5 para 6 dias consecutivos. No dia 4, antes da aplicação EStim e sob condições estéreis, mudar o meio de cultura por 1,5 mL de meio de aspiração e substitui-lo com 1,5 mL de OM fresca escaldada
7. Depois de aplicar EStim durante 7 dias consecutivos, manter as células em cultura por mais 7 dias, trocando a média a cada 3-4 dias.

4. medições de diferenciação osteogênica

1. Analise as alterações de morfologia celular sob um microscópio.
2. Para avaliar o efeito de EStim na diferenciação osteogênica MSC, medida deposição de cálcio, atividade da fosfatase alcalina e expressão de gene marcador osteogênica, como descrito em outra parte^3,9.

Resultados

Para avaliar o efeito de 100 mV/mm de EStim na diferenciação osteogênica do MSCs, células tratadas com EStim para 3, 7 e 14 dias ou folhas (controle) foram analisados no dia 14 de cultivo avaliando alterações morfológicas e deposição de cálcio (Figura 2 ). Isto foi feito por imagem de células usando microscopia de campo claro (alterações de morfologia) ou pela fixação de células em solução de paraformaldeído 4%, manchando-os com solução d...

Discussão

Aqui descrevemos a construção de uma câmara e um método para o tratamento de células-tronco mesenquimais com EStim que resulta em maior diferenciação osteogênica.

A configuração de EStim apresentada não requer equipamentos especial/conhecimento e pode ser realizada em um laboratório de biologia/bioquímica de células-tronco padrão por pesquisadores Júnior. No entanto, quando compilando e usando a câmara EStim, especial deve ter cuidado em algumas etapas críticas. Ao manusear o...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Estim fabrication
Banana connector/Jack adaptor	Poppstars	1008554	2 pieces
Cutting pliers	Knipex	78 03 125
DC power supply (0-30V/0-3A)	B&K Precision	Model 9130B	Any simular model could be used
Insulated flexible wires (0.14 mm2)	Conrad Electronic International	604794, 604093	2 pieces
Non-corrosive silicone rubber	Dow Corning	3140 RTV	*could be purchased by many stores
Platinum Wire (999,5/1000; 1mm ø)	Junker Edelmetalle	00D-3010	0.6 m needed for 1 Estim chamber
70% Ethanol solution	any		Sterilisation of Estim chamber
Silver coated copper wire (0.6 mm ø)	Conrad Electronic International	409334 - 62	≈70 cm needed for 1 Estim device
Soldering iron Set	Conrad Electronic International	1611410 - 62	Any simular model could be used
TPP 6-well plate lid	Sigma-Aldrich	Z707759-126EA	2 lids for Estim chamber
2.2V wired circular LEDs	Conrad Electronic International	599525 - 62	6 pieces
UHU Super glue	UHU GmbH & Co. KG	n/a	*could be purchased by many stores
MSC culture
β-Glycerophosphate disodium salt hydrate	Sigma-Aldrich	G9422	osteogenic cell culture
DMEM, low glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate	Thermo-Fischer Scientific	21885025	cell culture
DPBS, no calcium, no magnesium	Thermo-Fischer Scientific	14190144	cell culture
Dexamethasone	Sigma-Aldrich	D4902	osteogenic cell culture
Fetal Bovine Serum	Thermo-Fischer Scientific	10500064	cell culture
50 ml Falcon tube	Sarstedt	62,547,004	cell culture
L-Ascorbic acid	Sigma-Aldrich	A4544	osteogenic cell culture
Penicillin/Streptomycin	Thermo-Fischer Scientific	15140122	cell culture
Sprague-Dawley (SD) rat mesenchymal stem cells, bone marrow origin	Cyagen	RASMX-01001	cell culture
Cell detachment solution	Thermo-Fischer Scientific	A1110501	cell culture, cell detachment
TC Flask, T75	Sarstedt	833911302	cell culture
TPP 6-well plates	Sigma-Aldrich	Z707759-126EA	cell culture
Trypan Blue Dye, 0.4% solution	Bio-Rad	1450021	cell count