Costruzione e l'uso di una camera di stimolazione elettrica per migliorare la differenziazione osteogenica in cellule mesenchimali staminali/Stromal In Vitro

Riepilogo

Qui presentiamo un protocollo per la costruzione di un alloggiamento della coltura cellulare progettato per esporre le cellule a vari tipi di stimolazione elettrica e il suo uso nel trattamento di cellule staminali mesenchimali per migliorare la differenziazione osteogenica.

Abstract

Cellule staminali/stromali mesenchimali (MSCs) sono stati ampiamente utilizzate per promuovere la guarigione dell'osso in approcci di ingegneria tissutale. Stimolazione elettrica (EStim) ha dimostrata di aumentare la differenziazione osteogenica MSC in vitro e promuovere nelle regolazioni cliniche di guarigione ossea. Qui descriviamo la costruzione di un alloggiamento della coltura delle cellule EStim e suo uso nel trattamento dell'osso-zucchino-derivate MSC per migliorare la differenziazione osteogenica del ratto. Abbiamo trovato che il trattamento MSCs con EStim per 7 giorni si traduce in un aumento significativo nel differenziamento osteogenico e d'importanza, questo effetto pro-osteogenico persiste a lungo dopo (7 giorni) EStim è interrotto. Questo approccio di pretrattamento MSCs con EStim per migliorare la differenziazione osteogenica potrebbe essere usato per ottimizzare i risultati del trattamento di tessuto osseo e, quindi, di aiutarli a raggiungere il loro potenziale terapeutico completo. Oltre a questa applicazione, questo alloggiamento della coltura delle cellule EStim e protocollo utilizzabile anche per studiare altri comportamenti di cella EStim-sensibili, come la migrazione, la proliferazione, apoptosi e impalcatura allegato.

Introduzione

Un aumento nel trauma e/o difetti ossei malattia-indotta sono stati trattati utilizzando diverse combinazioni di tecnologie di medicina rigenerativa e terapia cellulare. MSCs sono le cellule di scelta in tali trattamenti, a causa della loro attività osteogenica relativamente elevata, isolamento ed espansione efficienza e sicurezza¹. Per massimizzare la loro attività osteogenica e, quindi, ottimizzare la loro efficacia terapeutica, sono stati introdotti diversi metodi per manipolare MSCs prima del loro utilizzo in questi trattamenti (come Recensito da Mauney et al.²). Uno di questi metodi è EStim, che ha dimostrato di migliorare la differenziazione osteogenica MSC in vitro³ e promuovere in vivo⁴di guarigione ossea. Nonostante il numero crescente di studi concentrandosi sul trattamento MSCs con EStim, un regime ottimale per massimizzare l'effetto pro-osteogenico di EStim deve ancora essere definito.

Altri metodi in vitro utilizzando EStim utilizzano sale ponti sommersi nel terreno di coltura, che separa le cellule da elettrodi metallici⁵. Il vantaggio di questo è che la prestazione EStim tramite ponti sale Elimina l'introduzione di sottoprodotti chimici (ad esempio, la corrosione degli elettrodi metallici) che possono essere citotossici. Nonostante questo vantaggio, sale ponti sono ingombranti per lavorare con ed EStim consegnano differisce da quello consegnato in modelli in vivo, che lo rende difficile da correlare i risultati ottenuti con i due sistemi. Configurazioni che consegnare EStim tramite elettrodi metallici o carbonio fissati all'interno dei pozzi di cultura delle cellule (come Recensito da Hronik-Tupaj e Kaplan⁶) meglio simulano dispositivi utilizzati in vivo; Tuttavia, questi dispositivi sono difficili da pulire/sterilizzare tra un utilizzo e il numero delle cellule che possono essere studiate per esperimento è limitato. Abbiamo progettato la camera EStim presentata qui appositamente per risolvere le limitazioni di queste altre configurazioni. Mentre la maggior parte della nostra esperienza nell'utilizzo di quest'Aula EStim è stato con 2D e 3D colture contenenti midollo adiposo-tessuto-derivata e MSCs^3,4, dei principali vantaggi di questa camera è che è versatile e, con relativamente minori modifiche, può essere adattato per studiare altri tipi di cellule in una varietà di condizioni diverse.

Qui descriviamo la costruzione di un alloggiamento della coltura delle cellule EStim; quindi, dimostriamo l'uso dal servizio MSCs trattante con regimi differenti di EStim e misurando l'effetto risultante sul differenziamento osteogenico. Differenziazione osteogenica MSC è valutata tramite il deposito del calcio, attività della fosfatasi alcalina ed espressione genica osteogenica marcatore. Importante, in passato esperimenti che hanno usato questa configurazione, abbiamo osservato che questi effetti pro-osteogenico persistono lungamente dopo che il trattamento di EStim è stato interrotto.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocollo

1. costruzione di alloggiamento della coltura di stimolazione elettrica delle cellule

1. Per costruire la camera EStim, raccogliere due coperchi delle piastre per colture cellulari 6 pozzetti standard; filo di platino al 99,99%, 60 cm di lunghezza con un diametro di 0,5 – 1 mm; filo di rame argentati, 70 cm di lunghezza con un diametro di 0,6 mm; pinze di taglio; kit saldatore; un tubetto di colla superconduttore; connettore del blocchetto terminali di monofilo, sei piccolo 2,2 V LED (opzionale); un tubo di adesivo siliconico anti corrosivo rivestimento (opzionale); un rotolo di nastro nero dell'isolamento elettrico; standard, flessibile, isolato legare elettrico di rame (0,14 mm²), 2 m di lunghezza (tabella materiali).
2. In un coperchio piastra a 6 pozzetti, segno e poi due fori di trapano (con un diametro di ~ 1 mm), 25 mm apart, vicino al bordo esterno di ciascuna delle sei pozzi (12 buche in totale), come mostrato in Figura 1A, B.
3. Tagliate dodici lunghezze di 5 cm di filo di platino con pinze di taglio. Piegare ciascuno dei fili manualmente in una forma di L, lasciando un'estremità lungo 3 cm e gli altri 2 cm. tagliare il filo argento-rivestito in due lunghezze di 35 cm.
4. Inserire l'estremità piegata (3 cm) più lunga di un filo di platino (da dentro a fuori) ogni foro praticato, lasciando una sporgenza dalla parte esterna del coperchio, 1 – 2 mm piegarlo usando il forcipe. Fissare i cavi platino nei fori coperchio con superconduttore colla e lasciare asciugare per circa 6 ore.
5. Saldare i suggerimenti di tutti i sei fili di platino (che sarà poi servire come catodi, vedere Figura 1A) che sporge dai coperchi ad uno dei fili argentati. Ripetere la stessa procedura, saldare i fili di platino sei rimanenti (che serviranno poi come anodi) per l'altro filo argento-rivestito.
   1. Aggiungere il LED nel circuito tra ognuna delle sei coppie anodo catodo elettrodo di platino, per confermare la funzionalità durante gli esperimenti (opzionali). Posizionare un pezzo di nastro isolante nero sotto ogni LED per prevenire l'esposizione delle cellule in piastre di coltura per la luce del LED (Figura 1).
6. Il connettore del blocchetto terminali di filo all'angolo in alto a sinistra del coperchio piastra a 6 pozzetti per colla e collegare entrambi i fili argentati ai morsetti di ingresso, come mostrato in Figura 1.
7. Tagliare una sezione di 20 x 20 mm dall'angolo superiore sinistro di un secondo coperchio piastra a 6 pozzetti (Figura 1B, coperchio Nr. 2) per ospitare il connettore del blocchetto terminali sul coperchio del primo. Coprire il coperchio primo, dotato di elettrodi, con il secondo coperchio e fissarli con nastro adesivo insieme con nastro adesivo.
   1. Per migliorare l'incollaggio dei due coperchi, utilizzare adesivo siliconico, rivestimento (opzionale). A tale scopo, coprire il coperchio con gli elettrodi d'argento con uno strato di adesivo siliconico 3 – 5 mm e coprire con coperchio, permettendo 12 h per l'adesivo ad asciugare.
8. Collegare un'estremità dei due fili di rame isolati standard ai terminali di uscita del filo connettore e le altre estremità di connettori maschio a banana (4 mm).
   Nota: La lunghezza di questi fili dipende dalla distanza dalla mensola in incubatrice, dove verranno mantenute le celle, all'alimentazione, all'esterno dell'incubatrice (Figura 1).
9. Regolare il dosaggio (tensione) e regime di EStim consegnati alle cellule regolando l'alimentazione DC.
   1. Accendere l'alimentazione premendo il pulsante ON/OFF sul pannello frontale. Attiva il canale 1 premendo il tasto 1.
   2. Premere il pulsante Nr. 4 (V-set) per impostare la tensione. Premere contemporaneamente i tasti 2, . e 5 per impostare l'uscita di carico a 2,5 V. Premere invio.
   3. Accertarsi che l'uscita di carico di 2,5 V (2.500 mV) corrisponde a una stima di 100 mV/mm, secondo l'equazione seguente, semplificata.
      V _EStim = ; o
      V = V_EStim × d
      Qui, V = tensione di alimentazione di uscita in millivolt; d = la distanza tra gli elettrodi in millimetri; V _EStim = stimolazione tensione in millivolt per millimetro.
      Nota: Questa semplificazione si applica solo in caso di costante tensione di CC. La resistenza tra il mezzo e le cellule è trascurabile come elettrodi non sono a diretto contatto con le cellule; invece, EStim è trasportato alle cellule attraverso il mezzo.

2. mesenchymal stem cell cultura in medium osteogenica

1. Acquistare e conservare MSCs ratto commercialmente disponibili (Vedi Tabella materiali) in azoto liquido fino al giorno dell'esperimento. In alternativa, MSCs l'isolato dagli altri animali secondo i protocolli pubblicati altrove^7,8 disposizioni istituzionali locali per l'uso di animali da esperimento.
2. Il giorno dell'esperimento, rimuovere un flaconcino (1 x 10⁶ cellule) di cellule staminali mesenchimali dallo stoccaggio di azoto liquido e rapidamente (entro 1 min) scongelare le cellule in un bagno di acqua preriscaldato a 37 ° C.
   1. In condizioni di sterilità in cappa a flusso laminare, pipettare il contenuto del flacone in un tubo falcon 50 mL e aggiungere 9 mL di medium normale (NM) preriscaldata a 37 ° C, che consiste del mezzo dell'Aquila di Dulbecco modificato (DMEM; 1x) con 10% inattivati siero bovino fetale (FBS) e 1% soluzione di penicillina/streptomicina. Agglomerare le cellule per 5 min per centrifugazione a 300 x g.
   2. In una cappa a flusso laminare, rimuovere il supernatante e Risospendere accuratamente il pellet cellulare in 12 mL di NM preriscaldata a 37 ° C. Trasferire le cellule sedimento in un pallone di cultura delle cellule T-75.
3. Coltura, le cellule a 37 ° C, 5% CO₂, 5% O₂ fino a raggiungere una confluenza di 80 – 90% (dopo circa 3 – 5 giorni).
4. Le cellule del passaggio.
   Nota: Eseguire tutte le operazioni tranne centrifugazione e incubazione in condizioni sterili in una cappa a flusso laminare.
   1. Dopo aver raggiunto una confluenza di 80 – 90%, recuperare le cellule con soluzione di distacco delle cellule. Aspirare il terreno di coltura cellulare, lavare 2x con 1 soluzione salina x tampone fosfato (PBS), aggiungere 5 mL di soluzione per distacco delle cellule 1x e restituire le cellule nell'incubatore per 5 min.
   2. Una volta che le cellule sono staccate, aggiungere una pari quantità di terreno di coltura per inattivare la soluzione di distacco. Raccogliere le cellule in un tubo falcon 50 mL e li spin a 300 x g per 5 min.
   3. Eliminare il terreno e risospendere le cellule in 1 mL di medium normale fresco. Valutare il numero di cellule vitali con la macchia blu di trypan.
   4. Semi di 1 x 10⁶ cellule in una nuova staffa di T-75 con 12 mL di NM preriscaldati. Coltura, le cellule a 37 ° C, 5% CO₂, 5% O₂ fino a raggiungere una confluenza di 80 – 90%.
      Nota: Cella passaggio (misure 2.4.1–2.4.4) può essere ripetuto alcune volte fino ad ottenuta il numero necessario di cellule. Non utilizzare cellule oltre passaggio 8 anni di età.
5. ⁴ cellule di seme 9 x 10 in 3 mL di nanometro (10% inattivati siero fetale bovino, 1% di penicillina/streptomicina, DMEM) in ciascun pozzetto di una piastra di coltura 6 pozzetti. Incubare le cellule per 1 giorno a 37 ° C, 5% CO₂, 5% O₂.
6. Il giorno successivo, aspirare il terreno di coltura e applicare 3 mL di mezzo di differenziazione osteogenica (OM; normale supplementato con 10^-7 M desametasone, β-glicerofosfato di 10 mM e 0,05 mM acido ascorbico-2-fosfato).
7. Posizionare la piastra 6 pozzetti con cellule nell'incubatrice e incubare a 37 ° C, 5% CO₂, 5% O₂ durante la notte.

3. trattamento di MSCs con EStim

1. Il giorno che le cellule sono trattate con EStim, sterilizzare gli elettrodi in soluzione di etanolo 70% per 30 min; quindi, asciugarli sotto la luce in un armadietto per altri 30 min di sicurezza UV.
2. In una cappa a flusso laminare, coprire la piastra 6 pozzetti contenenti i MSCs coltivate con il coperchio dotato di elettrodi, assicurandosi che gli elettrodi sono completamente sommerse in mezzo (se necessario, aggiungere il terreno). Trasferire la piastra 6 pozzetti coperta (EStim sezione) con le cellule nell'incubatore e collegare i suoi fili dell'alimentazione.
3. Impostare l'alimentazione a 2,5 V carico uscita e trattare le cellule con EStim per 1h^3,9.
4. Dopo stimolazione, scollegare l'alimentazione elettrica e rimuovere la camera EStim dall'incubatrice. In condizioni di sterilità, scambiare il coperchio dotato di elettrodi con un coperchio piatto 6 pozzetti standard.
5. Riporre le cellule nell'incubatore e lasciarli durante la notte. Pulire gli elettrodi, prima con PBS e poi con soluzione di etanolo al 70%. Pulire i prodotti di corrosione accumulato dalla superficie dell'elettrodo con carta vetrata fine.
6. Ripetere i passaggi da 3.1 – 3,5 per 6 giorni consecutivi. Il giorno 4, prima dell'applicazione EStim e in condizioni di sterilità, modificare il terreno di coltura ad aspirazione 1,5 mL di terreno e la sua sostituzione con 1,5 mL di preriscaldati om fresco
7. Dopo aver applicato EStim per 7 giorni consecutivi, mantenere le cellule in coltura per altri 7 giorni, scambiando il mezzo ogni 3 – 4 giorni.

4. misurazioni di differenziazione osteogenica

1. Analizzare i cambiamenti di morfologia delle cellule al microscopio.
2. Per valutare l'effetto di EStim il differenziamento osteogenico MSC, misura il deposito del calcio, attività della fosfatasi alcalina ed espressione del gene marcatore osteogenica, come descritto altrove^3,9.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Risultati

Per valutare l'effetto di 100 mV/mm di EStim sul differenziamento osteogenico di cellule staminali mesenchimali, cellule trattate con EStim per 3, 7 e 14 giorni o non trattato (controllo) sono stati analizzati al giorno 14 di coltura valutando i cambiamenti morfologici e deposizione di calcio (Figura 2 ). Questo è stato fatto da imaging celle utilizzando la microscopia a campo chiaro (cambiamenti di morfologia) o fissando le cellule in soluzione di paraforma...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussione

Qui descriviamo la costruzione di una camera e un metodo per il trattamento di cellule staminali mesenchimali con EStim che si traduce in una maggiore differenziazione osteogenica.

Il setup di EStim presentato non richiede particolare attrezzature/conoscenza e può essere eseguito in un laboratorio di Biologia/biochimica standard sulle cellule staminali dai ricercatori junior. Tuttavia, quando costruire e usare la camera di EStim, è necessario prestare attenzione speciale in pochi passaggi cr...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Estim fabrication
Banana connector/Jack adaptor	Poppstars	1008554	2 pieces
Cutting pliers	Knipex	78 03 125
DC power supply (0-30V/0-3A)	B&K Precision	Model 9130B	Any simular model could be used
Insulated flexible wires (0.14 mm2)	Conrad Electronic International	604794, 604093	2 pieces
Non-corrosive silicone rubber	Dow Corning	3140 RTV	*could be purchased by many stores
Platinum Wire (999,5/1000; 1mm ø)	Junker Edelmetalle	00D-3010	0.6 m needed for 1 Estim chamber
70% Ethanol solution	any		Sterilisation of Estim chamber
Silver coated copper wire (0.6 mm ø)	Conrad Electronic International	409334 - 62	≈70 cm needed for 1 Estim device
Soldering iron Set	Conrad Electronic International	1611410 - 62	Any simular model could be used
TPP 6-well plate lid	Sigma-Aldrich	Z707759-126EA	2 lids for Estim chamber
2.2V wired circular LEDs	Conrad Electronic International	599525 - 62	6 pieces
UHU Super glue	UHU GmbH & Co. KG	n/a	*could be purchased by many stores
MSC culture
β-Glycerophosphate disodium salt hydrate	Sigma-Aldrich	G9422	osteogenic cell culture
DMEM, low glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate	Thermo-Fischer Scientific	21885025	cell culture
DPBS, no calcium, no magnesium	Thermo-Fischer Scientific	14190144	cell culture
Dexamethasone	Sigma-Aldrich	D4902	osteogenic cell culture
Fetal Bovine Serum	Thermo-Fischer Scientific	10500064	cell culture
50 ml Falcon tube	Sarstedt	62,547,004	cell culture
L-Ascorbic acid	Sigma-Aldrich	A4544	osteogenic cell culture
Penicillin/Streptomycin	Thermo-Fischer Scientific	15140122	cell culture
Sprague-Dawley (SD) rat mesenchymal stem cells, bone marrow origin	Cyagen	RASMX-01001	cell culture
Cell detachment solution	Thermo-Fischer Scientific	A1110501	cell culture, cell detachment
TC Flask, T75	Sarstedt	833911302	cell culture
TPP 6-well plates	Sigma-Aldrich	Z707759-126EA	cell culture
Trypan Blue Dye, 0.4% solution	Bio-Rad	1450021	cell count