قياس الكورتيزول في كوالا(فيسكولارتوس سينيريوس)الفراء

Renae Charalambous; Edward Narayan

doi:10.3791/59216

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Summary

نقدم بروتوكول لتحديد المذيبات استخراج الأمثل لقياس الكورتيزول من الفراء كوالا. والمذيبات المستخدمة في هذا البروتوكول هي الميثانول والإيثانول والإيزوبروبانول. تحديد المذيبات استخراج الأمثل سوف تساعد في قياس موثوق الفراء لتحديد تأثير الإجهاد المزمن على الكوالا.

Abstract

الطرق المثلى لاستخراج هرمون المستخدمة لقياس الإجهاد في الحيوانات عبر أنواع العينة ليست دائماً هي نفسها. تواجه الأنواع المريخية الشهيرة في أستراليا، الكوالا(Phascolarctos cinereus)،التعرض لفترات طويلة لعوامل الإجهاد التي يسببها الإنسان وتقييم الإجهاد المزمن في السكان البرية له ما يبرره على وجه السرعة. واحدة من أكثر الطرق فعالية لقياس الإجهاد المزمن من خلال تحليل هرمون الكورتيزول الكورتيزول الكورتيزول في الشعر أو الفراء، كما أنه يدعم الاستجابات الفسيولوجية والسلوكية. تهدف هذه الدراسة التحقق من صحة المختبر لاختبار التقنيات الحالية للتحقق من طريقة استخراج هرمون الأمثل لاستخدامها كتدبير غير الغازية من الكورتيزول في الفراء كوالا. ومن المسلم به أن استخدام التقنيات غير الغازية لقياس هرمونات الإجهاد هو المفضل على التقنيات التقليدية، الغازية بسبب وجهات نظرهم العملية والأخلاقية المثالية. بالإضافة إلى ذلك، فمن الأسهل نسبيا للحصول على الفراء من الكوالا مما هو عليه للحصول على عينات من دمائهم. استخدمت هذه الدراسة عينات من فرو الكوالا المكتسبة من مستشفى أديلايد كوالا والحياة البرية لتشغيل عدد من تقنيات استخراج الهرمونات في محاولة للتحقق من طريقة استخراج الكورتيزول الأمثل. وأظهرت النتائج أن الميثانول 100٪ قدم استخراج المذيبات الأمثل مقارنة مع الإيثانول 100٪ أو 100٪ isopropanol على أساس نتائج التوازي. وفي الختام، وفرت هذه الطريقة لاستخراج الكورتيزول من فرو كوالا اختباراً موثوقاً به غير الغازية يمكن استخدامه لدراسة الإجهاد المزمن في الكوالا.

Introduction

النظم الإيكولوجية الأسترالية تحافظ على حياة الإنسان من خلال توفير الخدمات بما في ذلك الغذاء والألياف من بين العديد من التفاعلات الدينامية الأخرى¹. ومن المفارقات أن النشاط البشري هو الذي يعمل كمحرك مهيمن لاضطراب النظم الإيكولوجية من خلال تغيير التنوع البيولوجي². إن تجزئة الموائل، المعروفة باسم عملية تقسيم الموائل المستمرة الكبيرة إلى بقع صغيرة من الأراضي، معزولة عن بعضها البعض، هي التغير الرئيسي في التنوع البيولوجي البشري المنشأ الذي يهدد النظم الإيكولوجية الأسترالية². ويغير تجزؤ الموئل هيكل وتنوع تكوين الأنواع في أي منطقة معينة، مما يقلل من مساحة الموائل اللازمة لهذه الأنواع للحفاظ على تجمعات قابلة للحياة². ونتيجة لذلك هو زيادة المنافسة بين الأنواع للموارد بما في ذلك الغذاء والوقود والألياف والمياه³. إن تدمير النظم الإيكولوجية الأسترالية من خلال تغيير التنوع البيولوجي له عواقب كارثية على العديد من الأنواع الأسترالية الأصلية¹.

الأنواع المريخية الأكثر شهرة في أستراليا، والكوالا(Phascolarctos cinereus)،يعتمد على النظم الإيكولوجية الأسترالية تبقى صحية لبقائها⁴. وأدى إدخال التسوية الأوروبية إلى انخفاض سريع في عدد السكان الأستراليين من الكوالا، حيث ذبحوا بسبب رشقاتهم سعيا وراء الربح في تجارة تصدير ية كبيرة⁵. وقد حظرت هذه الممارسة في الثمانينات، ثم تمكن سكان الكوالا من تحقيق الاستقرار⁵. ومع ذلك، أدى النمو الأسي للسكان البشر في هذا النوع تتنافس على جزء كبير من بيئتها، وبقاءها هو مرة أخرى تحت التهديد⁶. ووفقا للاتحاد الدولي لحفظ الطبيعة، فإن جميع سكان الكوالا الأستراليين مدرجون في قائمة عرضة للانقراض مع انخفاض الاتجاه السكاني⁷. وتعزى هذه القائمة إلى عدم اليقين بشأن البارامترات السكانية ذات الصلة والتباين الملحوظ في الاتجاهات السكانية لهذا النوع⁷. وباعتبارها أكثر الحيوانات شهرة ومتوطنة، فإن الكوالا تعود بالفائدة إلى حد كبير على الاقتصاد الأسترالي من خلال السياحة (مكتب البيئة والتراث في نيو ساوث ويلز 2018). ويشير تقدير إلى أن السياحة ذات الصلة بالكوالا قد ولدت حوالي 9000 فرصة عمل وتسهم بما يتراوح بين 1.1 و2.5 مليار دولار في الاقتصاد (مكتب البيئة والتراث في نيو ساوث ويلز 2018). إزالة أي نوع واحد لديه القدرة على أن تكون كارثية، ويمكن أن ينظر إليها في الانخفاض المطرد للحياة البرية الأسترالية الأصلية⁶. وبالإضافة إلى ذلك، فإن الاقتصاد الأسترالي سوف يشعر العواقب إذا استمر سكان الكوالا الأسترالية في الانخفاض بمعدل⁶.

ويُقترح أن انتشار الوفيات والأمراض استجابة لتجزؤ الموائل هو نتيجة للإجهاد المزمن⁸. وبالفعل، أُعلن عن انقراض أربعة وعشرين نوعاً من الأنواع المريخية في أستراليا بسبب تجزؤ الموائل، مع اتباع الكوالا اتجاهاً مماثلاً⁸. إن تعقيد تجزؤ الموائل والنظم البيولوجية هو أمر تآزري ولكن يمكن تفكيكه من خلال تحليل الاستجابة للإجهاد⁶. عموما، أي اضطراب في محيط الحيوانات الطبيعية ينشط سلسلة معقدة من الأحداث العصبيةالهرمونية، والمعروفة باسم "القتال أو الطيران" استجابة 9،¹⁰. هذه الاستجابة للإجهاد هي العملية التي تبدأ في الدماغ حيث يتم تنشيط محور الغدة النخامية الغدة النخامية الغدة الكظرية (HPA)¹¹. عنصر من الدماغ يسمى تحت المهاد النشرات هرمون الإفراج عن الكورتيكوتروفين (CRH), الذي يشير بعد ذلك الغدة النخامية الأمامية لإطلاق هرمون أدرينوكورتيكوتروبيوم (ACTH)¹¹. وهذا بدوره يحفز إفراز الكورتيزون من النخاع الكظري. يقوم الجسم بتعميم الكورتيزون من خلال الدم، مما يحول تخزين الجلوكوز من الجليكوجين ويعبئ الجلوكوز من الجليكوجين المخزن^11. هذه السلسلة من الأحداث العصبية الهرمونية هي الاستجابة المستخدمة من قبل الحيوان للتعامل مع المحفزات لا يمكن التنبؤ بها¹¹. ومع ذلك ، عندما يتم إطلاق الكورتيزون وتبقى مرتفعة لفترة طويلة من الزمن ، يعتبر الحيوان يعاني من الإجهاد المزمن¹²^،¹³. وتنطوي هذه العملية على تحويل الطاقة بعيدا عن الوظائف الجسدية البدنية الأخرى، حيث أنها ضرورية لإنتاج الغلوكوكورتيكود المستمر¹³. ونتيجة لذلك، يمكن للإجهاد المزمن أن يمنع النمو والإنجاب والمناعة، وكلها سمات اللياقة البدنية الرئيسية المطلوبة للبقاء على قيد الحياة¹⁴.

قياس إنتاج الحيوان غلوكوكورتيكود هو مؤشر شائع يستخدم لتحديد ما إذا كان الحيوان يعاني من الإجهاد الفسيولوجي¹⁵. للقيام بذلك، يمكن قياس الكورتيزون في بلازما الدم، المصل، اللعاب، البول أو البراز^16. ومع ذلك، تشير الأدلة إلى أن الشعر هو مؤشر أكثر فعالية بكثير من الإجهاد المزمن، بدلا من¹⁶المذكورة أعلاه . ويرجع ذلك إلى أن الشعر يعتقد أن دمج الهرمونات المنقولة بالدم خلال مرحلة نموها; هو نسبيّا ثابتة; وأي الكورتيزول المكتشف في الشعر يعكس الإجهاد الفسيولوجي الذي عانى منه خلال فترة نمو الشعر، والذي يمكن أن يكون أسابيع حتى أشهر^16. وعلاوة على ذلك، فإن أي مجموعة من الكورتيزول ينبغي أن تكون غير الغازية من أجل تقليل الإجهاد المرتبط ة التقاط والتعامل مع¹⁶. ومع ذلك، فإن أي الإجهاد من ذوي الخبرة خلال هذا الحدث لن يؤثر على مستويات الكورتيزون في الشعر¹⁶. كانت هناك العديد من الدراسات التي تستكشف كفاءة استخدام الشعر لقياس الإجهاد على المدى الطويل في عدد من الحيوانات، وتشمل دراسات عن الرنة، الدببة الأشيب، الحصى ريسوس، muskoxen، والدببة البني¹⁷^،¹⁸^، ^{19 سنة} ^, ²⁰ ^, ^21.عادة ما يتم استخراج الكورتيزول الشعر عن طريق غسل العينة أولا لضمان العرق والزهم المستمدة من الكورتيزول المودعة على سطح الشعر لا يتم استخراج مشترك مع الكورتيزول ومن ثم سحق العينة في حبة الخافق^22. بعد الغسيل، تحتاج العينة إلى تجفيفها لضمان التبخر الكامل^22. وأخيرا، باستخدام المذيبات، يمكن استخراج العينة وإعادة تشكيلها لتسهيل اختبار الكورتيزول²². المذيب الأكثر شيوعا المستخدمة لاستخراج الكورتيزول من الفراء هو الميثانول²¹^،²³؛ ومع ذلك, هناك بعض الدراسات التي تستخدم الإيثانول وisopropanol في تقنيات استخراج الكورتيزول. على سبيل المثال، كانت دراسة استخدام الإيثانول ناجحة لاستخراج الكورتيزول من السائل السلوي البشري²⁴. بالإضافة إلى ذلك، كانت دراسة التي استخدمت isopropanol ناجحة لاستخراج الكورتيزول من شعر الإنسان والأظافر²⁵^،²⁶. ولهذا السبب، اختبرت هذه الدراسة جميع المذيبات الثلاثة (الميثانول والإيثانول والإيزوبروبانول) لتحديد أيهما كان الأكثر نجاحا لاستخراج الكورتيزول من عينات من فرو الكوالا.

وكان الهدف الرئيسي من هذه الدراسة استخدام التقنيات الحالية للتحقق من صحة تقنية استخراج هرمون الأمثل لاستخدامها كتدبير غير الغازية من الكورتيزول من الفراء كوالا. وقد تحقق ذلك عن طريق اختبار ثلاثة مذيبات استخراج (الميثانول، الإيثانول، وإيزوبروبانول). افترضنا أن الميثانول سيكون المذيب الأمثل المستخدم لاستخراج الكورتيزول من فرو كوالا لأنه هو المذيب الموصى به لاستخراج من قبل شجرة اختبار الكورتيزول مجموعات²⁷.

Protocol

وقد تم تنفيذ هذا المشروع في إطار مبادئ توجيهية صارمة لرعاية الحيوانات والبشر. منحت أخلاقيات الحيوان من قبل جامعة سيدني الغربية (A12373). بالإضافة إلى ذلك، تم تقديم تقييم المخاطر المختبرية والسلامة البيولوجية ونموذج الإشعاع وقبلت من قبل جامعة سيدني الغربية لإجراء هذا البحث بأمان (B12366).

ملاحظة: تم الحصول على عينات فرو كوالا لهذا المشروع من مستشفى أديلايد كوالا والحياة البرية، الواقع في 282 طريق أنزاك السريع، بليمبتون جنوب أستراليا. وقد أخذ الفراء من أحد الكوالا الذي أدخل المستشفى وتم نقله إلى المستشفى بسبب إصاباته الشديدة. وقد تم تخزين الكوالا المتوفى في فريزر داخل كيس جثة بعد وقت قصير من الوفاة. بعد إزالة الكوالا المتوفى من كيس الجسم، تم حلق 1.2 غرام من الفراء من مؤخر الرقبة باستخدام كليبرز الحيوان القياسية. تم حلق الفراء أقرب ما يمكن إلى الجلد، وذلك لضمان عدم قطع الجلد. وبمجرد حلقه، أعيد الكوالا المتوفى إلى كيس الجثة ووضع هافي الفريزر. ثم وضعت الفراء في كيس مصنوعة من رقائق الألومنيوم وتخزينها تحت -20 درجة مئوية. أثناء العبور، تم الاحتفاظ بالفراء في درجة الحرارة المحيطة، وعند وصوله إلى المختبر، تم تخزين الفراء في -80 درجة مئوية.

1. كوالا استخراج الكورتيزول الفراء

قم بإزالة الفراء من التخزين عند -80 درجة مئوية واترك الوقت للذوبان.
وزن الفراء على توازن الدقة التحليلية المختبرية.
ضع 60 ملغ من الفراء في أنبوب طرد مركزي مُقاس مسبقًا وموسّم بـ 1.5 مل وكرر حتى يتم ملء 18 أنبوبًا.
ملاحظة: استُخدمت 18 عينة فرعية من الفراء في دراسة التحقق هذه.
إضافة 1 مل من 100٪ عالية الأداء الكروماتوغرافيا السائلة (HPLC) الصف isopropanol إلى كل أنبوب باستخدام ماصة.
عينات دوامة لمدة 30 s.
سلالة كل عينة باستخدام منخل الدقة الدقيقة 0.5 مم وذلك لتحقيق فصل السائل والفراء.
تخلص من السائل في حاوية نفايات.
وضع كل عينة الفراء في قارب وزنها البلاستيك المسمى، ثم وضع في المجفف فراغ، وترك الفراء لتجف لمدة 3 أيام.
مرة واحدة جافة تماما، ووضع كل عينة في أنبوب الطرد المركزي الصغيرة 1.5 مل وصفت.
ضع كل عينة في مطحنة حبة مع 3 حبات من الصلب الكروم (3.2 ملم) وسحق لمدة 2 دقيقة في 30 يهز في الثانية الواحدة.
ماصة 1.5 مل من تقنية الاستخراج الأولى (100٪ الإيثانول الصف التحليلي) إلى 6 1.5 مل أنابيب الطرد المركزي الدقيقة التي تحتوي على عينة الفراء.
أداء نفس ل100٪ الميثانول الصف التحليلي و 100٪ الصف التحليلي isopropanol حتى يتم تعبئة ثمانية عشر أنابيب الطرد المركزي الدقيقة 1.5 مل.
قم بغطاء كل أنبوب طرد مركزي صغير سعة 1.5 مل واحتضن في درجة حرارة الغرفة (RT) مع نبض مستمر باستخدام شاكر لمدة 3 ساعة.
إزالة وإجهاد العينات باستخدام منخل الدقة الدقيقة 0.5 مم.
نقل السائل إلى أنبوب جديد للطرد المركزي الصغير بـ 1.5 مل مع ماصة مع ضمان التخلص من الفراء بشكل مناسب.
استخراج المذيبات الجافة تماما تحت تيار من بخار N₂ تحت خزانة الدخان.
إعادة تشكيل استخراج عينة المجففة باستخدام 400 درجة مئوية من العازلة اختبار (تكوين المقدمة في مجموعة الكورتيزول التجارية؛ انظر جدولالمواد) و 100 درجة من الإيثانول الصف التحليلي 100٪.
ملاحظة: يمكن تخزين مقتطفات عينة في -80 .

2 - الضوابط الداخلية

لجعل الضوابط، وجعل مجموعة من العينات المستخرجة مع مستويات هرمون عالية. لجعل هذا التجمع، حدد عينات من الحيوانات مع التعرض المعروف لإجهاد. على سبيل المثال، حدد عينات من الكوالا التي تم إنقاذها من الصدمة البيئية لأنها سوف تظهر عموما مستويات هرمون الكورتيزول عالية⁶.
1. لجعل تجمع استخراج، واتخاذ 20 درجة مئوية من استخراج من كل عينة (ن = 10) حتى يتم الحصول على حجم إجمالي 200 درجة مئوية. يمكن تخزين تجمع استخراج في -80 C حتى الاختبارات. تشغيل التجمع في كل تسرب كعناصر تحكم داخلية منخفضة أو عالية (راجع الخطوة 2.2).
للحصول على التبيّاب، استخدم المسبح لجعل الأسهم للضوابط المنخفضة والعالية التي تربط بنسبة 70% (C1) و30% (C2)، على التوالي. الحصول على عامل التخفيف لنقاط الربط 30٪ و 70٪ من الرسم البياني التوازيللمستخلص مقابل معيار الكورتيزول (الشكل 1). استخدم المخزن المؤقت للتحليل لتخفيف تجمع العينات. على سبيل المثال، استخدم 60 ميكرولتر من مستخلص التجمع و60 ميكرولتر من المخزن المؤقت للاختبار للتخفيف 1:2.
ملاحظة: بالنسبة لاستخراج الميثانول، كانت نقطة الربط 30٪ في أنيق في حين أن 70٪ نقطة ملزمة كان ما يقرب من 1:2 وفقا للرقم 1. وهكذا، وفرت هذه العوامل عامل التخفيف للضوابط الداخلية (C1 و C2 على التوالي) لتشغيلها ضمن نطاق المراقبة.

3. تحليل الكورتيزول في مستخلصات الفراء كوالا

استخدام مجموعة الكورتيزولالتجارية (جدول المواد) وإعداد لوحة قطاع جيدا 96 بما في ذلك العينات، والضوابط، ومعايير الكورتيزول، والآبار ملزمة غير محددة، والآبار ملزمة كحد أقصى وفقا لتعليمات المورد. استخدم ورقة تخطيط اللوحة المتوفرة في كتيب المجموعة لسرد مواضع العينات وعناصر التحكم والمعايير على خريطة اللوحة.
ملاحظة: من المستحسن تشغيل كافة العينات وعناصر التحكم والمعايير في تكرار للسماح بدقة النتائج.
جهزوا العينات اتبع استخراج هرمون الفراء (القسم 1) للحصول على 100٪ الميثانول المستخرجة الفراء كوالا.
جهز الكواشف اتبع الإجراء الموضح في مجموعة الكورتيزول التجارية لإعداد الكواشف بما في ذلك (1) فحص العازلة، (2) غسل العازلة، و (3) المعايير (التراكيب المقدمة في مجموعة الكورتيزول، جدولالمواد).
وفقا للتعليمات المقدمة في مجموعة الكورتيزول، pipet 50 ميكرولتر من العينات أو المعايير في الآبار في لوحة. الأنابيب 75 درجة مئوية و 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت للبفحص في آبار الربط غير المحددة (NSB) وآبار الربط القصوى (B0 أو صفر قياسي)، على التوالي.
إضافة 25 درجة مئوية من متقارن الكورتيزول إلى كل بئر باستخدام أنبوب مكرر. ثم pipet 25 درجة مئوية من الأجسام المضادة الكورتيزول في كل بئر، باستثناء الآبار NSB. اضغط بلطف على جانبي اللوحة للتأكد من أن الكواشف مختلطة بشكل جيد.
تغطية لوحة مع السدادة لوحة ويهز في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة (بسرعة بطيئة) باستخدام شاكر المدارية.
إزالة السدادة لوحة وأسق لوحة جيدا عن طريق غسل كل بئر مع 300 درجة مئوية من العازلة غسل 4 مرات.
تجفيف لوحة عن طريق النقر على لوحة على المناشف ماصة نظيفة.
ماصة 100 ميكرولتر من رباعي ميثيل البنزادين (TMB) الركيزة (تكوين المقدمة في مجموعة الكورتيزول، جدولالمواد) إلى كل بئر.
ضع السدادة لوحة على لوحة جيدا وحضانة في RT لمدة 30 دقيقة.
ماصة 50 درجة مئوية من وقف الحل لكل بئر.
وضع لوحة جيدا في قارئ لوحة قادرة على قراءة 450 نانومتر.
لحساب تركيز الهرمون النهائي، تستمد تركيز الكورتيزول الفراء النهائي في نانوغرام / ملغ من العينة عن طريق ضرب تركيز هرمون PG /مل مع حجم استخراج النهائي (0.5 مل) والقسمة على كتلة عينة الفراء (60 ملغ).

النتائج

يتم تحديد الكشف عن اختبار الأيض هرمون من الفائدة باستخدام التوازي. باستخدام منحنى التوازي، تحدد نقطة الربط 50٪ أيضًا عامل تخفيفالعينة على المنحنى القياسي (الشكل 1). كما هو مبين فيالرسم البياني التوازي (الشكل 1)، والإيثانول 100٪ و100٪ مقتطفات Isopropanol لم توفر الإزاحة موازية ضد م?...

Discussion

هناك عدد من الدراسات التي تستخدم مجموعة من التقنيات للكشف عن الكورتيزول في الفراء الثدييات. تعرض هذه الدراسة نتائج للكشف عن الكورتيزول في الفراء الذي تم جمعه من كوالا البرية المعرضة للإجهاد البشري الحالي. استخدمت هذه الدراسة الرائدة الفراء لاختبار أي من المذيبات الثلاثة شائعة الاستخدام ...

Disclosures

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

وقد تم دعم هذا العمل من خلال تمويل البحوث الناشئة لإدوارد نارايان من خلال جامعة سيدني الغربية، كلية العلوم والصحة. ويشكر المؤلفون جاك نخول على مساعدته في معالجة العينات.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Centrifuge Tubes	n/a	n/a	1.5 mL
Chrome Steel Beads	n/a	n/a	3.2 mm x 3
Cortisol Kit	Arbor Assays	K003-H1W	Manufactured in Michigan USA
DetectX Cortisol Enzyme Immunoassay Kit	Arbor Assays	K003-H5	Used first-time for cortisol testing in koala fur
Ethanol	n/a	n/a	HPLC Grade
Isopropanol	n/a	n/a	HPLC Grade
Methanol	n/a	n/a	HPLC Grade
Micro Pipette	n/a	n/a	n/a
Micro Precision Sieve	n/a	n/a	0.5 mm
Microplate Reader	Bio Radi	n/a	n/a
Microplate Washer	Bio Radi	n/a	n/a
Orbital Shaker	Bio Line	n/a	n/a
Plastic Weighing Boat	n/a	n/a	n/a
Plate Sealer	n/a	n/a	n/a
Precision Balance	n/a	n/a	n/a
Vortex Mixer	Eppendorf	n/a	n/a

References

Sandhu, H. S., Crossman, N. D., Smith, F. P. Ecosystem services and Australian agricultural enterprises. Ecological Economics. 74, 19-26 (2012).
Martinez-Ramos, M., Ortiz-Rodriguez, I. A., Pinero, D., Dirzo, R., Sarukhan, J. Anthropogenic disturbances jeopardize biodiversity conservation within tropical rainforest reserves. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (19), 5323-5328 (2016).
Aukema, J. E., Pricope, N. G., Husak, G. J., Lopez-Carr, D. Biodiversity Areas under Threat: Overlap of Climate Change and Population Pressures on the World's Biodiversity Priorities. PLoS ONE. 12 (1), 0170615 (2017).
MacDougall, A. S., McCann, K. S., Gellner, G., Turkington, R. Diversity loss with persistent human disturbance increases vulnerability to ecosystem collapse. Nature. 494 (7435), 86-89 (2013).
Hrdina, F., Gordon, G. The Koala and Possum Trade in Queensland, 1906-1936. Australian Zoologist. 32 (4), 543-585 (2004).
Narayan, E. J., Williams, M. Understanding the dynamics of physiological impacts of environmental stressors on Australian marsupials, focus on the koala (Phascolarctos cinereus). BMC Zoology. 1 (1), (2016).
Woinarski, J., Burbidge, A. Phascolarctos cinereus. The IUCN Red List of Threatened Species 2016. , (2016).
Gonzalez-Astudillo, V., Allavena, R., McKinnon, A., Larkin, R., Henning, J. Decline causes of Koalas in South East Queensland, Australia: a 17-year retrospective study of mortality and morbidity. Scientific Reports. 7, 42587 (2017).
Hing, S., Narayan, E. J., Thompson, R. C. A., Godfrey, S. S. The relationship between physiological stress and wildlife disease: consequences for health and conservation. Wildlife Research. 43 (1), 51-60 (2016).
Whirledge, S., Cidlowski, J. Glucocorticoids, stree, and fertility. Minerva Endocrinologica. 35 (2), 109 (2010).
Romero, L. M. Physiological stress in ecology: lessons from biomedical research. Trends in Ecology & Evolution. 19 (5), 249-255 (2004).
McEwen, B. S., Wingfield, J. C. What is in a name? Integrating homeostasis, allostasis and stress. Hormones and Behavior. 57 (2), 105-111 (2010).
Wingfield, J. C. The comparative biology of environmental stress: behavioural endocrinology and in ability to cope with novel, changing environments. Animal Behaviour. 85 (5), 1127-1133 (2013).
Chrousos, G. P. Stress and disorders of the stress system. Nature Reviews Endocrinology. 5 (1), 374-381 (2009).
Narayan, E. J., Webster, K., Nicolson, V., Mucci, A., Hero, J. M. Non-invasive evaluation of physiological stress in an iconic Australian marsupial: the Koala (Phascolarctos cinereus). General and Comparative Endocrinology. 187, 39-47 (2013).
Mastromonaco, G. F., Gunn, K., McCurdy-Adams, H., Edwards, D. B., Schulte-Hostedde, A. I. Validation and use of hair cortisol as a measure of chronic stress in eastern chipmunks (Tamias striatus). Conservation Physiology. 2 (1), 055 (2014).
Ashley, N. T., et al. Glucocorticosteroid concentrations in feces and hair of captive caribou and reindeer following adrenocorticotropic hormone challenge. General and Comparative Endocrinology. 172 (3), 382-391 (2011).
Macbeth, B. J., Cattet, M. R. L., Stenhouse, G. B., Gibeau, M. L., Janz, D. M. Hair cortisol concentration as a noninvasive measure of long-term stress in free-ranging grizzly bears (Ursus arctos): considerations with implications for other wildlife. Canadian Journal of Zoology. 88 (10), 935-949 (2010).
Dettmer, A. M., Novak, M. A., Suomi, S. J., Meyer, J. S. Physiological and behavioral adaptation to relocation stress in differentially reared rhesus monkeys: hair cortisol as a biomarker for anxiety-related responses. Psychoneuroendocrinology. 37 (2), 191-199 (2012).
Di Francesco, J., et al. Qiviut cortisol in muskoxen as a potential tool for informing conservation strategies. Conservation Physiology. 5 (1), 052 (2017).
Cattet, M., et al. Quantifying long-term stress in brown bears with the hair cortisol concentration: a biomarker that may be confounded by rapid changes in response to capture and handling. Conservation Physiology. 2 (1), 026 (2014).
Meyer, J., Novak, M., Hamel, A., Rosenberg, K. Extraction and analysis of cortisol from human and monkey hair. Journal of Visualized Experiments. (83), e50882 (2014).
Carlitz, E. H., et al. Measuring Hair Cortisol Concentrations to Assess the Effect of Anthropogenic Impacts on Wild Chimpanzees (Pan troglodytes). PLoS ONE. 11 (4), 0151870 (2016).
Aderjan, R., Rauh, W., Vecsei, P., Lorenz, U., Ruttgers, H. Determination of cortisol, tetrahydrocortisol, tetrahydrocortisone, corticosterone, and aldosterone in human amniotic fluid. Journal of Steroid Biochemistry. 8 (1), 525-528 (1977).
Nejad, J. G., Ghaseminezhad, M. A Cortisol Study; Facial Hair and Nails. Journal of Steroids & Hormonal Science. 7 (2), 177 (2016).
Palme, R., Touma, C., Arias, N., Dominchin, M., Lepschy, M. Steroid extraction: get the best out of faecal samples. Veterinary Medicine Australia. 7 (2), 1-5 (2013).
Davenport, M. D., Tiefenbacher, S., Lutz, C. K., Novak, M. A., Meyer, J. S. Analysis of endogenous cortisol concentrations in the hair of rhesus macaques. General and Comparative Endocrinology. 147 (3), 255-261 (2006).
Kanse, K. S., Joshi, Y. S., Kumbharkhane, A. C. Molecular interaction study of ethanol in non-polar solute using hydrogen-bonded model. Physics and Chemistry of Liquids. 52 (6), 710-716 (2014).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

150

This article has been published

Video Coming Soon

Keep me updated: