Кортизол Измерение в Коала (Phascolarctos cinereus) Мех

Резюме

Мы представляем протокол для определения оптимального растворителя экстракции для измерения кортизола из меха коалы. Растворителями, используемыми в этом протоколе, являются метанол, этанол и изопропанол. Определение оптимального растворителя извлечения поможет надежно измерить мех, чтобы определить влияние хронического стресса на коал.

Аннотация

Оптимальные методы экстракции гормонов, используемые для измерения стресса у животных по типам образцов, не всегда одинаковы. Австралийские культовые сумчатые виды, коала(Phascolarctos cinereus),сталкивается с длительным воздействием антропогенных стрессоров и оценка хронического стресса в диких популяциях является срочно оправданным. Одним из наиболее эффективных способов измерения хронического стресса является анализ глюкокортикоидного гормона кортизола в волосах или мехе, так как он поддерживает физиологические и поведенческие реакции. Это лабораторное исследование проверки направлено на тестирование современных методов для проверки оптимального метода экстракции гормонов, который будет использоваться в качестве неинвазивной меры кортизола в мехе коалы. Признано, что использование неинвазивных методов для измерения гормонов стресса является предпочтительным по сравнению с традиционными, инвазивными методами из-за их идеальной практической и этической точки зрения. Кроме того, сравнительно легче приобретать мех у коал, чем приобретать образцы их крови. В этом исследовании использовались образцы меха коалы, приобретенные в Аделаиде Коала и больнице дикой природы, чтобы запустить ряд методов экстракции гормонов в попытке проверить оптимальный метод экстракции кортизола. Результаты показали, что 100% метанол обеспечивает наиболее оптимальный растворитель добычи по сравнению с 100% этанола или 100% изопропанола на основе результатов параллелизма. В заключение, этот метод извлечения кортизола из меха коалы обеспечил надежный неинвазивный тест, который может быть использован для изучения хронического стресса у коал.

Введение

Австралийские экосистемы поддерживают жизнь человека путем предоставления услуг, включая продукты питания и волокна среди многих других динамических взаимодействий¹. По иронии судьбы, это человеческая деятельность, которая действует в качестве доминирующего драйвера нарушения экосистемы через изменение биоразнообразия². Фрагментация мест обитания, известная как процесс деления больших непрерывных мест обитания на небольшие участки земли, изолированные друг от друга, является основным антропогенным изменением биоразнообразия, угрожающим австралийским экосистемам². Фрагментация мест обитания изменяет структуру и разнообразие видового состава в той или инойобласти, тем самым уменьшая площадь среды обитания, необходимую для сохранения жизнеспособных популяций 2. Результатом этого является усиление конкуренции между видами за ресурсы, включая продукты питания, топливо, клетчатку и воду³. Разрушение австралийских экосистем путем изменения биоразнообразия имеет катастрофические последствия для многих австралийских местных видов¹.

Самые знаковые сумчатые виды Австралии, коала(Phascolarctos cinereus),зависит от австралийских экосистем, остающихся здоровыми для их выживания⁴. Введение Европейского урегулирования вызвало быстрое сокращение австралийского населения коал, так как они были убиты за шкуры в погоне за прибылью в большой экспортной торговле⁵. Эта практика была запрещена в 1980-х и популяции коал смогли стабилизировать⁵. Тем не менее, экспоненциальный рост популяции людей привел к тому, что этот вид конкурирует за большую часть своей среды обитания, и их выживание снова находится под угрозой⁶. По данным Международного союза охраны природы (МСОП), все популяции австралийских коал ы перечислены как уязвимые к вымиранию с уменьшением демографии^{тенденция 7}. Этот перечень объясняется неопределенностью вокруг соответствующих параметров популяции и заметными различиями в демографических тенденциях для данного вида⁷. Как наиболее знаковых и эндемичных животных, коалы в значительной степени пользу австралийской экономики через туризм (NSW Управление окружающей среды и наследия 2018). По оценкам, связанный с коалой туризм создал около 9000 рабочих мест и вносит от $1,1 до $2,5 млрд в экономику (NSW Office of Environment and Heritage 2018). Удаление любого одного вида имеет потенциал, чтобы быть катастрофическим, и можно увидеть в устойчивом упадке родной австралийской дикой природы⁶. Кроме того, экономика Австралии будет чувствовать последствия, если население австралийских коал продолжать снижаться темпами они⁶.

Предполагается, что распространенность смертности и заболеваний в ответ на фрагментацию среды обитания является результатом хронического стресса⁸. Уже, двадцать четыре сумчатых видов были объявлены вымершими в Австралии из-за фрагментации среды обитания, с коалами после аналогичной тенденции⁸. Сложность фрагментации среды обитания и биологических систем является синергетической, но может быть распакована путем анализа реакции на стресс⁶. Как правило, любое нарушение в естественной среде животных активирует сложный каскад нейрогормональных событий, известный как "борьба или полет" ответ^9,10. Эта реакция на стресс процесс, который начинается в головном мозге, где гипоталамо-гипофизарно-надпочечников (HPA) оси активируется¹¹. Компонент мозга называется гипоталамус релизы кортикотрофина-рилизинг гормона (CRH), который затем сигнализирует передний гипофиза, чтобы освободить адренокортикотрофический гормон (ACTH)¹¹. Это, в свою очередь, стимулирует глюкокортикоидную секрецию из надпочечников медуллы. Организм циркулирует через кровь глюкокортикоиды, что отвлекает хранение глюкозы из гликогена и мобилизует глюкозу из хранящегося гликогена^11. Этот каскад нейрогормональных событий является ответом, используемым животным для борьбы с непредсказуемыми раздражителями¹¹. Однако, когда глюкокортикоиды высвобождаются и остаются повышенными в течение длительного периода времени, считается, что животное испытывает хронический стресс^12,13. Этот процесс включает в себя отвлечение энергии от других телесных функций организма, так как это необходимо для текущего производства глюкокортикоидов¹³. В результате, хронический стресс может запретить рост, размножение и иммунитет, все это ключевые черты фитнес, необходимые для выживания¹⁴.

Измерение производства глюкокортикоидов животного является общим показателем, используемым для определения того, испытывает ли животное физиологический стресс^15. Для этого глюкокортикоиды могут быть измерены в плазме крови, сыворотке крови, слюне, моче или фекалиях¹⁶. Тем не менее, данные свидетельствуют о том, что волосы является гораздо более эффективным показателем хронического стресса, в отличие от вышеупомянутых¹⁶. Это потому, что волосы, как полагают, включают кровь гормонов во время его фазы роста; она относительно стабильна; и любой кортизол, обнаруженный в волосах, отражает физиологический стресс, испытываемый в период роста волос, который может составить несколько недель до¹⁶месяцев. Кроме того, любая коллекция кортизола должна быть неинвазивной, чтобы свести к минимуму стресс, связанный с захватом и обработкой^16. Тем не менее, любой стресс, испытываемый во время этого события не повлияет на уровень глюкокортикоидов в волосах^16. Там было много исследований, которые исследуют мастерство использования волос для измерения долгосрочного стресса в ряде животных, и включают в себя исследования на оленей, медведей гризли, рекусов обезьян, muskoxen, и бурых медведей^{17,18, 19 лет , 20 , 21}. Кортизол волос, как правило, извлекается при первом мытье образца для обеспечения пота и кожного сала полученных кортизола на хранение на поверхности волос не совместно извлечены с кортизола, а затем распыления образца в бисером бисером²². После стирки образец необходимо высушить, чтобы обеспечить полное испарение^22. Наконец, с помощью растворителя, образец может быть извлечен и восстановлен для облегчения анализ кортизола²². Наиболее распространенным растворителем, используемым для извлечения кортизола из меха, является метанол^21,23; однако, Есть некоторые исследования, которые используют этанол и изопропанол в своих методах извлечения кортизола. Например, исследование, в ходе которого использовался этанол, было успешным для извлечения кортизола из амниотической жидкости человека^24. Кроме того, исследование, которое использовало изопропанол был успешным для извлечения кортизола из человеческих волос и ногтей^25,26. По этой причине, это исследование протестировало все три растворителя (метанол, этанол и изопропанол), чтобы определить, какой из них был наиболее успешным для извлечения кортизола из образцов меха коалы.

Основная цель этого исследования заключается в использовании современных методов для проверки оптимального метода экстракции гормонов, которые будут использоваться в качестве неинвазивной меры кортизола из меха коалы. Это было достигнуто путем тестирования трех растворителей извлечения (метанол, этанол и изопропанол). Мы предположили, что метанол будет оптимальным растворителем, используемым для извлечения кортизола из меха коалы, потому что это рекомендуемый растворитель извлечения Arbor assay комплекты кортизола²⁷.

протокол

Этот проект был выполнен в соответствии со строгими руководящими принципами по уходу за животными и людьми. Этика животных была предоставлена Западным Сиднейским университетом (A12373). Кроме того, лабораторная оценка рисков и биобезопасность и радиационная форма были представлены и приняты Университетом Западного Сиднея для безопасного проведения этого исследования (B12366).

ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы меха Коала для этого проекта были получены из Аделаиды Коала и дикой больницы, расположенной на 282 Anzac шоссе, Плимптон южная Австралия. Мех забрали из одной коалы, которая была госпитализирована и усыплена из-за тяжелых травм. Покойный коала хранился в морозильной камере в мешке для трупов вскоре после смерти. После удаления умершего коалы из мешка для тела, 1,2 г меха был выбрит с затылка с помощью стандартных клиперов животных. Мех был побрился как можно ближе к коже, чтобы кожа не была разрезана. После того, как побрился, покойный коала был помещен обратно в мешок для тела и помещен в морозильную камеру. Затем мех помещали в сумку из алюминиевой фольги и хранили ниже -20 градусов по Цельсию. В пути мех хранился при температуре окружающей среды, а по прибытии в лабораторию мех хранился при -80 градусах Цельсия.

1. Извлечение кортизола из меха Коалы

1. Удалите мех из хранилища при -80 градусах Цельсия и дайте время на оттепель.
2. Взвешивание меха на лабораторно-аналитическом точном балансе.
3. Поместите 60 мг меха в предварительно взвешенную и помеченную 1,5 мл центрифуги трубки и повторить до 18 труб заполнены.
   ПРИМЕЧАНИЕ: 18 меховых подобразцов были использованы для этого исследования проверки.
4. Добавьте 1 мл 100% высокопроизводительной жидкой хроматографии (HPLC) класса изопропанола к каждой трубке с помощью пипетки.
5. Образцы вихрей на 30 с.
6. Процедите каждый образец с помощью сито точности 0,5 мм, чтобы добиться разделения жидкости и меха.
7. Отбросьте жидкость в мусорный контейнер.
8. Поместите каждый образец меха в маркированной пластиковой взвешивания лодки, а затем поместить в вакуумный desiccator, оставить мех высохнуть в течение 3 дней.
9. После полного высыхания поместите каждый образец в подмаркированную микроцентрифугную трубку мощностью 1,5 мл.
10. Поместите каждый образец в бисерную мельницу с 3 хромированными стальными бусинками (3,2 мм) и распыляйте в течение 2 мин при 30 встряхиваниях в секунду.
11. Пипетка 1,5 мл первой техники экстракции (100% аналитический сорт этанола) в 6 микроцентрифуговых трубках площадью 1,5 мл, содержащих образец меха.
12. Выполните то же самое для 100% аналитического класса метанола и 100% аналитического класса изопропанола до восемнадцати 1,5 мл микроцентрифуговых труб заполнены.
13. Крышка каждой 1,5 мл микроцентрифуг трубки и инкубировать при комнатной температуре (RT) с постоянной пульсирующей с помощью шейкера в течение 3 ч.
14. Удалить и процедить образцы с помощью 0,5 мм микро-сито точности.
15. Перенесите жидкость в новую микроцентрифуговую трубку мощностью 1,5 мл с помощью пипетки, обеспечивая при этом, чтобы мех был соответствующим образом отброшен.
16. Полностью сухой экстракт растворителя под потоком пара N₂ под дымом-купбордой.
17. Восстановите высушенный образец экстракта с использованием 400 qL буфера асссе (состав, представленный в коммерческом комплекте кортизола; см. Таблица материалов) и 100 л 100% аналитического сорта этанола.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Образец экстрактов может храниться при -80 .

2. Внутренний контроль

1. Чтобы сделать контроль, сделать пул извлеченных образцов с высоким уровнем гормонов. Чтобы сделать этот бассейн, выберите образцы из животных с известным воздействием стрессора. Например, выберите образцы из коал, которые были спасены от экологическойтравмы, поскольку они, как правило, отображают высокий уровень гормона кортизола 6.
   1. Чтобы сделать пул экстракта, возьмите 20 qL экстракта из каждого образца (n no 10) до получения общего объема в 200 л. Бассейн экстракта может храниться при -80 C до ассс.. Выполнить бассейн в каждом ассее, как низкий или высокий внутренний контроль (см. шаг 2.2).
2. Для ассоциа, используйте бассейн, чтобы сделать запасы для низких и высоких элементов управления, которые связывают на 70% (C1) и 30% (C2), соответственно. Получить коэффициент разбавления для 30% и 70% связывающих точек от графика параллелизм для экстракта против стандарта кортизола(рисунок 1). Используйте буфер ассеа для разбавления пула образцов. Например, используйте 60 юл экстракта пула и 60 л буфера асссеа для 1:2 разбавления.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для экстракта метанола, 30% точки связывания был аккуратным в то время как 70% точки связывания было примерно 1:2 в случае рисунок 1. Таким образом, они обеспечили фактор разбавления для внутреннего контроля (C1 и C2 соответственно) для выполнения в рамках асссе.

3. Анализ кортизола в экстрактах коалы меха

1. Используйте коммерческий комплект кортизола(Таблицаматериалов) и установите 96 хорошо полоса пластины, включая образцы, элементы управления, стандарты кортизола, неспецифические связывающие скважины, и максимальный связывания скважин в соответствии с инструкциями поставщика. Используйте лист макета пластин, представленный в буклете комплекта, чтобы перечислить позиции образцов, элементов управления и стандартов на карте пластин.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется, чтобы все образцы, элементы управления и стандарты были запущены в дубликат, чтобы обеспечить точность результатов.
2. Подготовка образцов. Следуйте экстракции гормона меха (раздел 1) для получения 100% метанола, извлеченного меха коалы.
3. Подготовка реагентов. Следуйте процедуре, описанной в коммерческом комплекте кортизола для подготовки реагентов, включая (1) буфер асссе, (2) мыть буфер, и (3) стандарты (композиции, представленные в комплекте кортизола, Таблица материалов).
4. В рамках инструкций, предусмотренных в комплекте кортизола, pipet 50 зл образцов или стандартов в колодцы в пластине. Труба 75 л и 50 л ассса буфера в неспецифических связывающих (NSB) скважинах и максимальной связывающей (B0 или нулевой стандарт) скважин, соответственно.
5. Добавьте 25 зЛ кортизола конъюгированного к каждому колодцу с помощью трубача-ретранслятора. Затем пипета 25 зл антитела кортизола в каждую скважину, за исключением скважин NSB. Аккуратно коснитесь сторон пластины, чтобы реагенты хорошо перемешаны.
6. Накройте тарелку уплотнителем и встряхните при комнатной температуре в течение 1 ч (при медленной скорости) с помощью орбитального шейкера.
7. Снимите уплотнитель пластины и аспирируйте скважину, промывая каждую скважину с 300 qL буфера для мытья 4 раза.
8. Высушите тарелку, нажав тарелку на чистые абсорбирующими полотенцами.
9. Пипетка 100 л тетраметилбензадина (TMB) субстрата (состав, предусмотренный в комплекте кортизола, Таблица материалов) для каждой скважины.
10. Поместите уплотнитель пластины на хорошую тарелку и инкубировать на RT в течение 30 минут.
11. Пипетка 50 л стоп-раствора для каждой скважины.
12. Поместите хорошо пластины в пластины читателя способны читать 450 нм.
13. Чтобы рассчитать конечную концентрацию гормона, вывешйте окончательную концентрацию меха кортизола в нг/мг образца, умножая концентрацию гормона пг/мл с окончательным объемом экстракта (0,5 мл) и разделив на массу образца меха (60 мг).

Результаты

Ассаи выявляет гормоны метаболитов, представляющих интерес, определяется с помощью параллелизма. Используя кривую параллелизма, 50% связывающая точка также определяет коэффициент разбавления образца на стандартной кривой(рисунок1). Как показано на графике параллелизма(р?...

Обсуждение

Есть ряд исследований, которые используют ряд методов для обнаружения кортизола в меха млекопитающих. Это исследование представляет результаты для обнаружения кортизола в мехе, собранных из дикой коалы подвергаются текущему антропогенному стрессу. Это новаторское исследование испо?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Centrifuge Tubes	n/a	n/a	1.5 mL
Chrome Steel Beads	n/a	n/a	3.2 mm x 3
Cortisol Kit	Arbor Assays	K003-H1W	Manufactured in Michigan USA
DetectX Cortisol Enzyme Immunoassay Kit	Arbor Assays	K003-H5	Used first-time for cortisol testing in koala fur
Ethanol	n/a	n/a	HPLC Grade
Isopropanol	n/a	n/a	HPLC Grade
Methanol	n/a	n/a	HPLC Grade
Micro Pipette	n/a	n/a	n/a
Micro Precision Sieve	n/a	n/a	0.5 mm
Microplate Reader	Bio Radi	n/a	n/a
Microplate Washer	Bio Radi	n/a	n/a
Orbital Shaker	Bio Line	n/a	n/a
Plastic Weighing Boat	n/a	n/a	n/a
Plate Sealer	n/a	n/a	n/a
Precision Balance	n/a	n/a	n/a
Vortex Mixer	Eppendorf	n/a	n/a